质谱测序 第三代测序
三代测序原理
三代测序原理
三代测序原理是指第三代测序技术，又称为单分子测序技术。
与第一代（Sanger测序）和第二代（高通量测序）相比，第三代测序技术具有更高的速度、更低的成本和更长的测序读长等优点。
第三代测序技术的原理主要是基于测序模板的直接测序，而不需要PCR扩增。
这种直接测序的方法可以避免PCR扩增引入
的错误，并且能够在一个测序周期内得到完整的序列信息。
在第三代测序技术中，常用的方法是通过将DNA分子固定在
一个载体上，形成DNA聚集体。
然后，通过负电荷的方式将
这些DNA聚集体附着在固定的表面上，形成一个DNA分子
阵列。
接着，通过使用荧光染料将这些固定的DNA分子标记出来，
并且使用激光束在一个固定的区域内进行扫描。
这样，就可以得到每个DNA分子的位置和荧光信号强度信息。
在测序过程中，通常会使用一种特殊的酶来控制DNA链的合
成过程。
这种酶能够识别每个碱基的序列信息，并且在特定的条件下将其添加到适当的位置。
通过不断重复这个步骤，直到测序反应完成，就可以得到整个DNA分子的序列信息。
总结起来，第三代测序技术的原理是通过直接测序DNA模板，
不需要PCR扩增，通过固定DNA分子并使用荧光标记，通过酶的作用在特定条件下完成碱基的添加，最终得到完整的
DNA序列信息。
这种技术具有快速、低成本和长读长等优势，在各种生物学研究中得到了广泛的应用。
第三代测序技术单分子即时测序
第三代测序技术:单分子即时测序・７１８・第三代测序技术：单分子即时测序刘岩吴秉铨ＤＮＡ测序技术是分子生物学研究中最常用的技术，它的出现极大地推动了生物学的发展。
从人类基因组计划（ｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅｐｒｏｊｅｃｔ），到人类基因组单倍型图计划（ＨａｐＭａｐ），再到人类癌症基因组及个体基因组计划，第一代和第二代ＤＮＡ测序技术功不可没。
特别是近几年发展起来的第二代ＤＮＡ测序技术则使得ＤＮＡ测序进入了高通量、低成本的时代。
目前，基于单分子读取技术的第三代测序技术已经出现，该技术测定ＤＮＡ序列更快，并有望进一步降低测序成本，为人类从基因水平深入理解疾病的发生、发展、诊断和治疗提供新的手段，使个体化医疗成为现实。
本文回顾了测序技术发展过程，并对第三代测序技术的特点和优势进行详细论述。
一、第一代ＤＮＡ测序（ｆｉｒｓｔ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）成熟的ＤＮＡ测序技术始于２０世纪７０年代中期，１９７７年Ｍａｘａｍ和Ｇｉｌｂｅｒｔ…报道了通过化学降解测定ＤＮＡ序列的方法。
同一时期，Ｓａｎｇｅｒ等拉１发明了双脱氧链终止法，基本原理是利用４种双脱氧核苷酸（ｄｄＮＴＰ）代替脱氧核苷酸（ｄＮＴＰ）作为底物进行ＤＮＡ合成反应。
一旦ｄｄＮＴＰ掺入到ＤＮＡ链中，由于核糖的第３位碳原子上不含羟基，不能与下一核苷酸反应形成磷酸二酯键，ＤＮＡ合成链的延伸反应被终止，生成了若干长度仅相差单个碱基的ＤＮＡ片段。
在４个ＤＮＡ合成反应体系中，分别加入一定比例的带有放射性同位素标记的某种ｄｄＮＴＰ，通过单碱基分辨率的凝胶电泳分离不同长度的ＤＮＡ片段和放射自显影后，可以根据电泳带的位置确定待测ＤＮＡ分子的序列。
２０世纪９０年代初出现的荧光自动测序技术也是基于Ｓａｎｇｅｒ等¨１原理。
但用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了ＤＮＡ测序的速度和准确性，将ＤＮＡ测序带入自动化测序的时代，这些技术统称为第一代ＤＮＡ测序技术。
第三代DNA测序技术的原理及应用
第三代DNA测序技术是近年来生物学领域的一项重大突破，它的原理和应用在基因研究和生物科学中具有重要意义。
本文将深入探讨第三代DNA测序技术的原理，并分析其在不同领域的应用。
1. 引言DNA测序技术是生物学研究中最基础、最重要的工具之一。
传统的第一代和第二代DNA测序技术虽然有着高效和准确的特点，但在测序速度、数据质量和测序长度方面存在一定的局限性。
而第三代DNA测序技术的出现，为我们提供了更高的测序速度、更长的测序读长和更低的测序成本。
2. 原理第三代DNA测序技术的原理与传统技术有所不同。
它不再依赖于离散的信号和化学反应，而是通过直接读取单个DNA分子中的碱基序列来实现测序。
下面将介绍几种常见的第三代DNA测序技术原理及其特点。
2.1 单分子实时测序技术单分子实时测序技术是第三代DNA测序技术中的一种重要方法。
它利用了DNA链的线性自我扩增特性，通过监测单个DNA分子的合成过程来实现测序。
这种方法具有实时性好、测序速度快、数据产量高的优点，适用于高通量测序和长读长要求的研究。
2.2 纳米孔测序技术纳米孔测序技术是一种基于离子传导原理的第三代DNA测序方法。
它使得DNA分子能够通过纳米孔的通道，并且依据碱基的化学特性在电流传导上产生差异，从而实现测序。
这种方法具有高速度、低成本和无需扩增的特点，适用于快速测序和实时监测。
2.3 光学测序技术光学测序技术是第三代DNA测序技术中的又一种重要方法。
它利用了荧光染料的性质和光信号的检测来实现测序。
通过将DNA分子与特定的荧光染料标记，然后在测序仪器中激发并检测荧光信号，从而获取对应的碱基信息。
这种方法具有高灵敏度和高分辨率的特点，适用于复杂样品和高标准的测序要求。
3. 应用第三代DNA测序技术在生物学研究和医学领域的应用十分广泛，下面将介绍几个典型的应用案例。
3.1 基因组测序第三代DNA测序技术在基因组测序中具有重要意义。
其高通量、长读长和低成本的特点使得科学家们能够更快地完成全基因组的测序工作，并且能够检测到一些传统方法难以观察到的基因变异。
三代测序原理及步骤
三代测序原理及步骤
三代测序是一种新型的高通量测序技术，与传统的二代测序技术相比，具有更快的速度、更高的分辨率和更低的成本。
三代测序的原理主要分为三个步骤：预处理、测序和数据分析。
1. 预处理：样本DNA需要进行预处理，包括DNA提取、文
库构建和引物连接等。
其中文库构建过程中，DNA分子被打
断成较小的片段，并与适当的引物序列连接。
这个过程是为了克服DNA分子长度和连续读取长读长的难题。
2. 测序：三代测序主要依赖于单分子测序技术。
这种技术可以直接读取单个DNA分子的序列信息，避免了文库扩增和PCR
等步骤对序列的干扰。
常用的三代测序技术包括SMRT （Single Molecule Real-Time）测序、Nanopore测序等。
其中，SMRT测序技术利用圆盘形态的DNA多聚酶在放射线观测下
合成DNA，观察到DNA的添加情况，从而得到DNA的序列
信息；Nanopore测序技术则利用微小的纳米孔通过测量DNA
分子通过孔的电导变化来分析DNA序列。
3. 数据分析：三代测序产生的数据量大、复杂，需要进行数据预处理、序列比对、变异检测、基因组组装等一系列的数据分析步骤。
这些步骤主要包括数据清洗、基因组或转录组的组装、SNP分析、结构变异分析等。
总体来说，三代测序的步骤包括预处理、测序和数据分析。
通
过这些步骤，可以高效地获得高质量的基因组或转录组序列，并进一步分析相关的生物学功能和基因表达调控等信息。
三代测序原理技术比较
三代测序原理技术比较三代测序是指第三代DNA测序技术，相对于第一代和第二代DNA测序技术，它具有更高的测序速度、更低的成本和更高的基因组分辨率。
三代测序技术在遗传学、生物学和医学研究等领域中起着重要的作用。
本文将对三代测序原理和技术进行详细比较。
第一代测序技术，又称为经典测序技术，是20世纪70年代末到80年代初出现的。
代表性的方法包括Sanger测序和Maxam-Gilbert测序。
这些方法都是基于DNA链延伸原理进行测序，通常需要大量的模板DNA和特定的剪切酶。
优点是准确性高，读长长，可达到1000到2000个碱基。
缺点是测序速度慢，成本高，并且需要大量的模板DNA。
第二代测序技术，也称为高通量测序技术，是在21世纪初出现的。
代表性的方法包括454测序、Illumina测序和SOLiD测序。
这些方法都是基于DNA扩增和测序的原理进行测序，通常需要少量的模板DNA。
优点是测序速度快，成本低，并且可以实现高通量测序。
缺点是读长短，通常只能达到几百个碱基，而且对于GC含量高的区域有较大的偏倚。
第三代测序技术，又称为单分子测序技术，是在2005年之后出现的。
代表性的方法包括Pacific Biosciences (PacBio)测序、Oxford Nanopore Technologies (ONT)测序和Helicos测序。
这些方法都是基于单分子测序的原理进行测序，通常只需要少量的模板DNA。
优点是读长极长，可以达到数万个甚至数十万个碱基，对于复杂基因组和长读长测序有很大的优势。
此外，这些方法不需要扩增和特定的剪切酶，因此可以避免偏倚。
缺点是准确性相对较低，错误率较高。
在三代测序技术中，PacBio测序和ONT测序是目前较为成熟和广泛应用的两种方法。
PacBio测序原理是利用DNA聚合酶在测序过程中释放出的荧光信号进行测序。
当DNA聚合酶在DNA模板上合成新的DNA链时，会引起荧光信号的变化，从而实现碱基的识别和测序。
第三代测序技术原理及应用
Pacific Bioscience SMRT 技术
• 优势：长读长，耗时短。可以进行DNA甲基化，高GC含量区域、 RNA等测序。
• 缺陷：会出现插入和缺失错误。 缺失错误源于有时候碱基掺入速度过快， 超过了相机的拍摄帧数; 插
入错误源于有时候酶随机的选择一些碱基，但并未真的将这些碱基掺入 合成链中。但这些错误是随机的，并不会随着读长的增加而提高， 随着 测序覆盖深度的增加会逐渐被消除。
Oxford Nanopore Technologies 纳米孔单分子测序技术
• 优势：仪器构造简单使用成本低廉，因为它不需要对核苷酸进行标记， 也不需要复杂的光学探测系统 。能直接对 RNA 分子进行测序。同时 由于它是直接检测每一个碱基的特征性电流， 因而能对修饰过的碱基 进行测序， 这一点对于表观遗传学研究具有极高的价值。
Pacific Bioscience SMRT 技术
第一代、二代、三代测序仪比较
Rhoads A, Au KF. PacBio Sequencing and Its Applications. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 2015;13(5):278-289. doi:10.1016/j.gpb.2015.08.002.
• 缺点：测序的平均读长相对较短， 只有 35 bp， 准确率较低， 约为 ≤97% 。
Oxford Nanopore Technologies 纳米孔单分子测序技术
α-溶血素纳米孔 外：核酸外切酶 内：环糊精传感器
核酸外切酶 消化单链DNA
单碱基与环糊 精作用影响电 流
依据电信号大小和 停留时间识别碱基
测序准确度较高，测序碱基错误率 为1%
简述第一二三代测序技术原理
简述第一二三代测序技术原理
第一代测序技术原理：
第一代测序技术又称为Sanger测序技术，是由Frederick Sanger在1977年首次提出并开发的。
这种方法依靠DNA链
延伸的DNA聚合酶做模板并进行荧光标记，使用一种称为链终止的化学方法，会使DNA链延伸终止在特定核苷酸，生成所有长度的DNA片段，然后使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离各个片段。
随后，通过电泳图谱能够分辨出不同长度的DNA片段，从而得到DNA序列。
第二代测序技术原理：
第二代测序技术是基于测序-by-synthesis原理，是通过将DNA 组装到表面上，并添加能够照亮每个核苷酸的化学试剂进行测序。
这些试剂可以逐个核苷酸累加，并用相应的光信号发送给计算机进行分析。
第二代测序技术包括Illumina, 454, Ion Torrent，和SOLiD。
Illumina使用激光照亮DNA序列中的核苷酸，并记录生成的荧光信号。
此技术具有高通量、低成本和快速的优点。
第三代测序技术原理：
第三代测序技术是一种实时单分子测序技术，采用单个自然DNA分子，并通过流速调节使DNA通过膜孔，然后测定膜孔中的电学性质来识别核苷酸（如Ion Torrent，Oxford Nanopore）。
这些技术还包括基于纳米技术和单分子DNA氧
化的PacBio技术。
这些技术具有不同的优点，包括高精确度、高通量和更真实的序列。
三代测序原理技术比较
三代测序原理技术比较三代测序是指第三代高通量测序技术，相对于第一代和第二代测序技术，它具有更高的速度、更低的成本以及更高的准确性。
目前，主要的三代测序技术包括单分子测序、单分子实时测序和纳米孔测序。
下面将分别介绍这三种技术的原理和特点。
单分子测序是三代测序技术的一种，它的原理是将DNA分子直接放在一个测序装置中，通过对DNA的碱基进行逐个测序以获得DNA序列。
单分子测序技术的一大特点是能够直接对DNA进行测序，不需要进行PCR扩增和片段化等传统测序方法中的预处理步骤，因此可以减少实验时间和所需样本量。
目前，常见的单分子测序技术有SMRT（Single-Molecule Real-Time）和Nanopore（纳米孔）测序。
SMRT技术是一种可以实现单分子实时测序的技术，它利用专门设计的测序装置以及特殊的引物和酶来进行测序。
测序装置中有一个高密度排列的微小孔，每个孔中有一个DNA聚合酶复合物和一个荧光基团，当DNA碱基与引物配对时，聚合酶会添加一个荧光基团，同时释放出荧光信号，这个过程可以被装置中的摄像机捕捉到。
通过观察荧光信号的强度和持续时间，就可以推断一些位置的DNA碱基是什么。
SMRT技术的优点是测序速度快、准确性高，但缺点是数据处理复杂，读长相对较短。
纳米孔测序是一种利用纳米孔测序装置对DNA分子进行测序的技术。
纳米孔是一种非常细微的孔道，通常直径在1-2纳米之间，只能通过单个DNA分子的一条链。
当DNA分子通过纳米孔时，其碱基会对应产生电信号，通过测量电信号的特性，可以推断DNA序列。
与其他测序技术相比，纳米孔测序的优势主要在于测序速度快、设备小巧、易于存储和传输，并且具有较长的读长和较低的测序成本。
然而，纳米孔测序技术也存在一定的误读和错配率等问题需要改进。
综上所述，三代测序技术相对于传统的测序技术具有更高的速度、更低的成本和更高的准确性。
单分子测序、单分子实时测序和纳米孔测序是目前主要的三代测序技术，它们各具特点，适用于不同的测序需求。
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第三代测序技术与质谱测序技术的
介绍和比较
质谱蛋白测序
质谱分析是一种测量离子质荷比的分析方法。
一级质谱主要是给出目标物的分子量，GC-MS一级谱图可以定性分析，LC-MS能用于简单的分子量测定。
二级质谱可以看出目标物的部分碎片，可以对目标物的结构进行分析。
在蛋白测序方面，一级质谱结合肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprint，PMF)可以初步推测蛋白质的种类、序列。
PMF基本原理是将蛋白质直接从双向电泳凝胶上切下或印迹到PVDF膜上并切下，经过原位酶解得到酶解肽段，然后用质谱得到这些肽段的PMF，即获得了肽质量指纹图谱。
由于每种蛋白质氨基酸序列都不同，当蛋白质被酶解后，产生的肽片段序列也不同，其肽混合物质量数即具一定特征性。
用实测的肽段质量去查找蛋白质和核酸序列库，结合适当的计算机算法，可鉴定蛋白质。
但这种方法不能用来直接测序，必须依靠大量的数据库信息进行比对，准确率也受到限制。
串联质谱可直接用于测定肽段的氨基酸序列，其过程是从一级质谱产生的肽段中选择母离子，进入二级质谱，经惰性气体碰撞后肽段沿肽链断裂，由所得到的各肽段质量数差值推定肽段序列。
得到的质谱数据既可以通过仪器提供的软件解析，也可以进行手工解析。
在第一级质谱得到肽的分子离子,选取目标肽的离子作为母离子，与惰性气体碰撞，使肽链中的肽键断裂。
主要有三种不同的肽键断裂方式，产生6中不同的碎裂离子：即N端的a, b, c型离子与C端的x, y, z型离子. 每种断裂类型分别生成互补的两种离子, 如a-x,b-y,c-z 。
最常见的是a 型离子、b 型离子和y型离子，其他类型离子较少出现。
将这些碎片离子系列综合分析，可得出肽段的氨基酸序列。
质谱法有不少优点，还能用于翻译后修饰的分析（糖基化、磷酰化），但目前只适用于20个氨基酸以下的肽段。
此外，还存在固有的局限性，比如Leu和Ile、Lys和Gln不能区分，有些肽的固有序列不能用质谱法测定。
第三代测序
测序技术在近几年中又有新的里程碑。
以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies纳米孔单分子测序技术，被称之为第三代测序技术。
与前两代相比，他们最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。
SMRT（single molecule Real-Time）测序技术
该技术其实应用了二代测序边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体。
基本原理是：DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记的4种碱基（即是dNTP），在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。
具体的反应在零级波导孔(zero-mode waveguides, ZMW)的纳米结构中完成。
这种ZMW是直径50-100纳米，深度100nm的孔状纳米光电结构，通过微加工在二氧化硅基质的金属铝薄层上形成微阵列，光线进入ZMW后会呈指数级衰减，从而使得孔内仅有靠近基质的部分被照亮。
Φ29 DNA聚合酶被固定在ZMW的底部，模板和引物结合之后被加到酶上，再加入四色荧光标记的dNTP (A555-dATP, A568-dTTP, A647-dGTP, A660-dCTP)。
当DNA合成进行时，连接上的dNTP由于在ZMW底部停留的时间较长(约200ms)，其荧光信号能够与本底噪音区分开来，从而被识别。
荧光基团被连接在dNTP的磷酸基团上，因此在延伸下一个碱基时，上一个dNTP的荧光基团被切除，从而保证了检测的连续性，提高了检测速度。
SMRT的测序原理如图所示。
图A显示的是ZMW的结构，激光进入ZMW后呈指数级衰减，仅能照亮靠近底部的约30nm区域，因此大部分游离的荧光标记dNTP不会被激发，只有结合到DNA聚合酶上的dNTP其荧光基团被激光照亮，激发荧光。
图B显示的是DNA合成过程中检测到的荧光信号及持续时间。
结合到酶上的dNTP停留时间较长，信号呈脉冲式激发，因而能够与噪音区分。
另外，可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，既如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息。
SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。
但是，同时其测序错误率比较高，达到15%。
但好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向，因而可以通过多次测序来进行有效的纠错。
纳米单分子测序技术
与以往的测序技术皆不同，它是基于电信号而不是光信号的测序技术。
该技术的关键之一是，他们设计了一种特殊的纳米孔，孔内共价结合有分子接头。
借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔，当DNA碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度，而ATCG单个碱基的带电性质不一样，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。
纳米孔测序的主要特点是：读长很长，大约在几十kb，甚至100 kb;错误率目前介于1%至4%，且是随机错误，通量很高，起始DNA在测序过程中不被破坏，以及样品制备简单又便宜，理论上可以直接测序RNA。
纳米孔单分子测序计算还有另一大特点，它能够直接读取出甲基化的胞嘧啶，而不必像传统方法那样对基因组进行bisulfite处理。
这对于在基因组水平直接研究表观遗传相关现象有极大的帮助。
但也面临DNA易位速率过快，电流变化幅度较小，制备纳米孔材料的稳定性等问题。
测序技术比较
1、目的。
两种方法都是为了进行测序。
2、对象。
都是生物细胞产物。
三代测序对象是单细胞的DNA片段，不需要PCR扩增，分析单一的核苷酸种类；质谱测序对象是蛋白质的多肽片段，分析单一的氨基酸种类。
3、结果。
获得目的片段的序列。
三代测序得到DNA或RNA序列，质谱测序得到多肽序列。
两者序列可以相互换算验证。
4、原理。
三代测序基于碱基互补配对原则，边合成边测序；质谱测序根据不同离子碎片荷质比的差异进行区分。
5、检测方法。
三代测序利用荧光信号或电信号等检测，不同核苷酸对应不同信号，信号时间的不同可以区分碱基的修饰类型；质谱测序通过荷质比数据计算分析，计算中有一些特定的规律、公式，也有一些不可克服的误差因素。
6、读长。
三代测序读长很高，可以达到3000bp，测序速度约10bp/s；质谱测序只能针对小片段的多肽，在20个氨基酸左右。
7、修饰。
都可以检测发生的修饰。
三代测序通过核苷酸合成的时间检测碱基修饰；质谱测序通过荷质比分析氨基酸发生的修饰。
8、精度。
三代测序单次准确度约85%，重复测序可是准确率达到99.9999%；质谱测序准确率较高，但有部分氨基酸不能通过荷质比进行区分。
蛋白分析新技术
超高分辨率显微技术
自从1873年Ernst Abbe第一次发现光学成像具有衍射限制现象以来，物理学界就公认，显微镜的分辨率具有极限，该极限与光源的波长有关。
直到一个多世纪之后，罗马尼亚物理学家Stefan Hell推翻了这一观点。
他是首位不仅从理论上论证了，而且用实验证明了使用光学显微镜能达到纳米级分辨率的科学家。
自从2006年STORM技术和PALM技术问世以来，科技工作者就一直在不断努力，对它们进行改进、完善和提升。
新技术比以往所有光学3D成像技术的分辨率都要高出10倍，使以前很多看起来不可能的事情现在都变得可能了，对于蛋白质的分析研究有非常重要的意
义。
蛋白质芯片技术
蛋白质芯片原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上（如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等），根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白（存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等），经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析；它为获得重要生命信息（如未知蛋白组分、序列。
体内表达水平生物学功能、与其他分子的相互调控关系、药物筛选、药物靶位的选择等）提供有力的技术支持。
蛋白分离鉴定技术
基于色谱技术的二维色谱(2D-LC)、二维毛细管电泳(2D-CE)、液相色谱－毛细管电泳(LC-CE) 等新型分离技术，基于质谱技术的质谱鸟枪法(Shot-gun)、毛细管电泳-质谱联用(CE-MS)等新技术都可以在蛋白分离鉴定上发挥重要作用。
华东师范大学
张佳舜
51151300095。