激光诱导荧光寿命及其测量
荧光寿命的定义
荧光寿命的定义简介荧光寿命是描述荧光物质发光时间的一个重要参数。
随着光学技术的快速发展，对荧光寿命的研究也越来越深入。
荧光寿命在许多领域中都有广泛的应用，如生物物理学、材料科学、化学等。
本文将对荧光寿命的定义进行详细探讨，包括荧光寿命的概念、测量方法和影响因素等。
荧光寿命的概念荧光寿命是指荧光物质由受激态回到基态所需的时间。
当荧光物质受到外界激发能量时，部分电子会从基态跃迁到激发态，形成受激态。
随后，受激态上的电子会自发地跃迁回到基态，释放出能量并产生荧光。
荧光寿命是受激态电子从激发态回到基态所需的平均时间。
荧光寿命的长短与荧光物质的性质密切相关，它可以通过荧光寿命测量仪器来获得。
荧光寿命的测量方法有许多方法可以用来测量荧光寿命，其中最常用的方法是荧光寿命衰减法。
该方法通过测量荧光强度随时间的衰减曲线来得到荧光寿命。
具体操作步骤如下： 1. 准备样品：选择合适的荧光物质作为样品，并将其制备成适当的形式，如溶液、薄膜等。
2. 激发样品：使用合适的激发源，如激光器或荧光灯，对样品进行激发。
激发波长通常与样品的吸收峰相匹配。
3. 收集荧光信号：使用荧光探测器收集样品发出的荧光信号，并将其转化为电信号。
4. 记录荧光信号随时间的变化：使用荧光寿命测量仪器记录荧光信号随时间的变化，并得到荧光强度随时间的衰减曲线。
5. 拟合曲线：利用合适的数学模型，如指数衰减模型，对荧光衰减曲线进行拟合，从而得到荧光寿命。
影响荧光寿命的因素荧光寿命受到多种因素的影响，其中包括以下几个方面： 1. 荧光物质的性质：荧光物质的分子结构和化学组成对荧光寿命有重要影响。
不同的分子结构会导致不同的荧光激发和退激发机制，从而影响荧光寿命的长短。
2. 温度：温度是影响荧光寿命的重要因素。
一般情况下，荧光寿命会随着温度的升高而缩短。
这是因为温度的升高会增加分子的振动和动力学速率，从而加快荧光退激发的速率。
3. 溶剂效应：溶剂对荧光寿命也有较大影响。
激光诱导荧光技术简介资料重点
快速的时间响应：时间分辨最高可达纳秒量级，可对自由基等瞬态物 质寿命进行检测。
对被测区域无干扰：通过激光激发，而不涉及接触式的探针等器件， 对等离子体，燃烧等几乎不产生干扰。
激光诱导荧光技术（LIF）
12
特点
主要问题： 对激光器的要求较高，维护昂贵； 测量系统较复杂。
采集软件：采集数据，并对数据进 行处理；
激光诱导荧光技术（LIF）
7
激光诱导荧光技术（LIF）
8
技术要求
该技术的关键是选择合适的物质与特定波长的激光光 源相匹配，以产生足够强度的荧光信号为探测器所接收。 目前作为示踪粒子的有氢氧根（OH）、碳氢根（HC）、 一氧化碳（CO）、氧分子（O2）、氧原子（O）、丁二 酮分子等。
LIF应用
生物
毛细血管 电泳检测
医学
环境
病变诊断
检测大气、 水体污染
激光诱导荧光技术（LIF）
其他
检测火焰、 流场等
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特点
优点：
高灵敏度：探测下限可达106个粒子/cm3，浓度检测最低可达1013mol/L。
测温范围宽，测量精度高：已有在1600℃的实验条件和1100℃的燃气 轮机条件下进行荧光测温的报道，测温精度可达±1℃。
用于液体的流场显示时需要加入荧光染料。 不同物质需和不同波长的激光器相配合。
激光诱导荧光技术（LIF）
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分类
浓度测量 温度测量
LIF分类
示踪LIF 产物分析LIF
测量手段
液体LIF 气体LIF 燃烧LIF
测量物质
激光诱导荧光技术（LIF）
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应用
目前LIF技术已应用于气体、液体、固体的测量中及燃烧、等离 子体、喷射和流动现象中。
激光诱导荧光光谱技术
应用
(3)燃烧系统中的应用
测量温度、粒子浓度等。LIF方法在火焰中粒子 浓度的测量包括： ① 瞬态自由基粒子的测量。瞬态自由基是燃烧中的 反应中间体，如OH等。 ② 污染粒子测量，用于对污染物的控制与排放，常 见的污染粒子有NO、CO、NO2、SO2等分子， LIF方法的空间与时间的分辨测量有助于深入理解 燃烧过程中这些粒子形成的机理。 ③ 金属粒子的测量，如Na、K、NaS等。
No. 11
应用
(2)水质监测
LIF 遥测系统以355 nm 激发波长的Nd-YAG晶体激 光器为激发光源, 脉冲宽度4 ns , 重复频率10Hz 。脉冲 激光通过卡塞格伦望远镜射入待测水体, 后向散射的荧光 进入望远镜, 使用光纤分为两路, 一路通过干涉滤光片, 光电倍增管测量作为水拉曼光强度, 另一路通过安装有中 心波长为355 、450 和685 nm 三块干涉滤光片的转轮, 以光电倍增管测量瑞利散射光、DOM 荧光和叶绿素a 荧光强度。测得的瑞利散射光、DOM 荧光和叶绿素a 荧光强度以水拉曼光强度进行归一化, 记为瑞利散射因子、 DOM 荧光因子和叶绿素a 荧光因子, 分别与水体浊度、 DOM 浓度和叶绿素a 浓度成线性正相关。
光学组件：光路调整，光路转换，过滤杂散光等作用。
样品池：气体密闭池、液体池。窗口与光路上不产生激发光的散射，
窗口与池壁不产生荧光、样品池的窗口通常作成布儒斯特角。
光电探测器：光电倍增管、光电二极管、电荷耦合器件CCD等。
信号处理模块：信号采集、分析、显示和处理, 根据信号控制激光
器、检测光路和光电探测器等模块, 实现在线分析、处理和信号优化。
处于高能态的分子不稳定，在一定时间内它会从高能态返 回到基态。在此过程中，分子会通过自发辐射释放能量发光而 产生荧光，这就是激光诱导荧光。
荧光寿命测定的现代方法与应用
荧光寿命测定的现代方法与应用房 喻 王 辉(陕西师范大学化学系 西安 710062)摘 要 介绍了时间相关单光子计数、相调制和频闪等三种现代荧光寿命测定方法的工作原理,指出了各种方法的优点和局限性;介绍了时间相关单光子计数实验数据的处理方法;概述了时间分辨荧光技术在化学和生命科学中的应用。
关键词 荧光寿命 单光子计数 相调制法 频闪技术Abstract The principles and characteristics of s ome of the m odern techniques,including time2correlated single2 photon counting(T CSPC),phase m odulation and strobe techniques,for fluorescence lifetime measurements have been briefly introduced.The advantages and disadvantages of each method have als o been pointed out.The comm on method used for the analysis of the fluorescence decay,taking T CSPC as an example,has been discussed in detail.On the basis of these introductions,the applications of time2res olved fluorescence techniques in chemical and biological re2 search have been overviewed.K ey w ords Fluorescence lifetime,T ime2correlated single photon counting,Phase m odulation methods,S trobe techniques荧光是分子吸收能量后其基态电子被激发到单线激发态后由第一单线激发态回到基态时所发生的,而荧光寿命是指分子在单线激发态所平均停留的时间。
荧光寿命的认识
寿命 是衰减常数k 的倒数。事实上，在 瞬间激发后的某个时 间，荧光强度达到最 大值，然后荧光强度 将按指数规律下降。 从最大荧光强度值后 任一强度值下降到其 1/e所需的时间都应 等于 。
分析采用非线性最小二乘曲线拟合方法, 迭代过程用Marquardt法。拟合初值可由 用户输入,也可对曲线粗略分析得到。如 对两种衰变成分的衰变曲线,先由曲线尾 部段进行单指数曲线拟合得到长寿命成分 参数,再由曲线前段进行双指数曲线拟合 得到(其中长寿命成分参数已得到)短寿命 成分参数。
二．研究荧光寿命的意义
从下式可以得到 F的粗略估计值(单位为秒)。
1/F≈104 max
在讨论寿命时，必须注意不要把寿命与跃迁时 间混淆起来。跃迁时间是跃迁频率的倒数，而 寿命是指分子在某种特定状态下存在的时间。
通过量测寿命，可以得到有关分子结构和动力 学方面的信息。
荧光寿命及其含义
假定一个无限窄的脉冲光(δ函数)激发n0个荧 光分子到其激发态,处于激发态的分子将通 过辐射或非辐射跃迁返回基态。假定两种衰 减跃迁速率分别为Γ和knr,则激发态衰减 速率可表示为dn(t)/dt=- (Γ+ knr) n(t) (1)
Zn3(PO4)2 存在α,β,和γ三种晶体结构对于这三 种磷光体,在α-ZPMG中没有红色长余辉现象,因为在 结构中不存在六配位Mn2+。相反,在β和γ-ZPMG中, 可以很清楚地观察到红色长余辉现象。采用254nm紫 外光激发5min后,立即测得磷光粉的余辉光谱如图6 所示。由图我们可以看出,β和γ-ZPMG中监测到宽 带峰与发射光谱中的峰位相同,均位于616nm,归属为 Mn2+的4T1g(4G) →6A1g(6S)跃迁。
新型激光诱导荧光检测器的研制及评价
５ ５
１ ＬＦ ２ ０ ＩＤ ３ 激光诱导 荧光检测器的设计
激 光 诱 导 荧光 检 测 器 Ｌ Ｆ ２ ０使 用 ４ ３ ｍ 半 ＩＤ ３ ７ｎ
现代 仪器（ｗ ．ｏｅｎ ｓ ｓ ｒ． ） ｗ ｗｍ ｄｒｎｔ ． ｇ ｎ ｉ ｒｏ ｃ
３ 液体 出口 ； ． 光入 射方 向 ４激
光采集效率 ，提高检测器灵敏度 ［ ３ 】 。本文针对该检
测器 的设 计 原理 加 以说 明 ，并通 过 与高 效液 相 色谱 联 用 ，对 其 性 ｉｉ 以评 价 。 ｉｉ
２ 实验部分
２ １ 仪器与试剂 ． ＬＩＤ２０激 光 诱 导 荧 光 检 测 器 ，Ｐ ３ Ｆ ３ ２０高压 恒
ＦＴ Ｉ Ｃ衍 生 化苯胺 、对 甲苯胺 、对 氯苯胺 、联 苯胺 、对苯二胺 等 ５种物 质 ，评 价 该检 测 器 ，
最 小检 测量 达到 Ｐ ｇ级 ，重现 性好 ，５种物 质保 留时间 ＲＳ Ｄ值 均 小于 １ ｎ ７ 。说明该检 ％（＝ ）
测 器具 有灵敏度 高、稳 定性好 、线性 范 围宽等特 点 ， 用于环境 与生物领 域痕 量物质检 测。 适
（． ２ 大连依利特分析仪器有限公司 （． ３华东理工大学
摘 要
大连
１６ ２ ） ０ ３ １
上海
２０３ ） ０２７
采 用成 本低 、灵敏 度 高的反射 式 ｚ 型检 测池 ，成 功研 制新 型 ４ ３ｍ 固体 激光诱 一 ７ｎ
导 荧光检 测 器 （ Ｉ Ｄ） 用荧光物 质 异硫 氰酸 荧光素 （ Ｉ Ｃ 标 准品评 价检 测 器性 能，其灵 ＬＦ 。 ＦＴ ） 敏度 高 ，最低检 测浓度 为 １ ０。 ｌ （／ ＝ ５ ，线性 范围超 过 ４个 数量 级。进一 步使 用 ×１ 。ｍｏ／ ＳＮ ｌ ） Ｌ
荧光寿命成像技术FLIM
生物光子学大作业作业名称：荧光寿命成像技术FLIM 姓名：曾扬舰学号：完成日期：2016.6.28荧光寿命成像技术FLIM摘要：荧光寿命显微成像技术（FLIM）技术是一种新颖的荧光成像技术，具有其他荧光成像技术无法代替的优异性能，是生物医学工程领域的研究热点。
频域调制、门控探测和时间相关单光子计数是FLIM的几种主要实现方法。
综述了这些计数的原理、研究现状和已取得的部分成果，比较了这三种方法的时间分辨率和成像速度等参数的优劣。
宽场FLIM更适用于延时成像和实时成像。
荧光偏振各向异性成像和内窥镜FLIM技术都是FLIM技术很有前景的应用方向。
Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy(FLIM)Why lifetime Imaging?The fluorescence lifetime is the signature of a fluorescent material ;It is the exponential decay in emission after the excitation of a fluorescent material has been stopped. FLIM is a technique to map the spatial distribution of lifetimes within microscopic images and it allows measurements in living cells as well as in fixed.Because of the fact that some phenomena do affect fluorescence lifetimes, the lifetime is used to detect these phenomena leading to various applications such as; lon imaging ,oxygen imaging, probing microenvironment, and medical dlagnosis.Frequency domain methodThe homodyne frequency domain FLIM method requires amodulated light source and a modulated detector.In the LIFE system these are the LED and the intensified CCD camere. Both are modulated at exactly the same frequency,but with an adjustable diffrence in phase.These two parameters depend on the fluorescence lifetime of the sample and the modulation frequency and are measured to calculate the flurescence lifetime in each pixel of the image.1、基本概念荧光是分子吸收能量后使得其基态电子被激发到单线激发态后由第一单线激发态回到基态时所发生的辐射复合发出的光。
荧光寿命测定方法
三、时间相关的单光子计数方法TCSPC
降低激光功率，使每一个激光脉冲所含能量足够小，以至于每次激发样 品时或者仅有１个荧光光子到达探测器的光阴极，或者没有。假如100 个激光脉冲激发样品，所发出的荧光光子仅能使光阴极平均发射１个 光电 子。光子q重概率密度则变成单个光电子概率密度：
E4 E3 E2
(10-8s) (10-3s)
E4 E3 E2
h
E1
E1
一、荧光寿命的概念
自发辐射：处于高能级E2的原子自发地向低能级E1跃迁，并发射出一个频
率为 υ=（ E2- E1 ）/h的光子。
自发跃迁几率：发光材料在单位时间内，从高能级上产生自发辐射的发光
粒子数密度占高能级总粒子数密度的比值 A21=(dn21/dt)sp/n2
三、时间相关单光子计数方法TCSPC
时间相关单光子计数技术首先由 Bollinger、Bennett、Koechlin 三人在六十 年代为检测被射线激发的闪烁体发光而建立的,后来人们把它应用到荧光 寿命的测量。
四、TCSPC技术优缺点
• TCSPC 法的突出优点在于灵敏度高、测定结果准确、系统误差 小,是目前最流行的荧光寿命测定方法； • 实际测定中,必须调节样品的荧光强度,确保每次激发后最多只有 一个荧光光子到达终止光电倍增管。否则会引起“堆积效应” (Pileup Effect)； • 对于量子效率较高的样品，需要限制激发光强度，即减小多个光 电子同时到达的概率； • 这种方法所用仪器结构复杂、价格昂贵、而且测定速度慢,无法满 足某些特殊体系荧光寿命测定的要求。
Pf(t) ≈ <λ(t)> = αI（t）
只要测得单个光电子到达时间概率分布，也就得到了微弱光场衰变曲线。 利用窗口鉴别器开设时间窗口，可以很方便地测量激发后不同时间区 间的荧光光谱，就得到了时间分辨荧光光谱。利用非线性最小二乘法、 矩法、Laplace 变换法、最大熵法以及正弦变换法等拟合曲线得到结果。
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折射率) , 另一通道的延迟信号触发高压脉冲发 生器。后者发出的脉冲信号通过门输入接口将
探测器打开, 直到激光诱导荧光信号到达时将 其关闭, 测出这两个信号之间的时间延迟便可 得到荧光寿命。
参考文献 1 Lu cas A . et al. Fluorescence spect roscopi c det ect ion of
ear ly, in jury-induced ath eros clerosis . SPIE, 1992, 1642: 183～190 2 A l exander A L. et al. Fluorescence s pectros copy of normal and at heromat ous hum an aort a: O ptim um il lumin at ion w avelengt h. SPIE, 1991, 1424: 6～14 3 A z iz D . et al . Fluorescence res ponse of select ed t issu es in t he canine heart -A t att empt t o f ind t he conduct ion sys tem. S PIE , 1992, 1642: 166～175 4 Pradh an A . at al . T ime res ol ved fl uores cence of normal an d at heros clerot ic ar teries . S PIE, 1991, 1425: 2～5 5 Pat t erson M S , Chance B and W ilson B C. T ime r esol ved refl ectance and tr ans mit t ance for th e noninvas ive ineasur emen t of t is sue opt ical pr op ert ies . A ppl . O pt . , 1989, 28 ( 12) : 2331～2336 6 A nders son-engels S . et al . M alignant T umor and
( 1a)
kq D +
( 1b)
kp 其他生成物
( 1c)
k′2a D + Q +
( 1d)
k′2b D + Q *
( 1e)
其中: —荧光频率;
h —普 朗克 常数 ; Q —消 激发 或淬 灭因 子;
—激发态与基态之间的能量差;
kr—激发态自发辐射光子并回到基态的
速率常数;
kq —分子之间相互作用消激发的速率常
1GHz 的宽带采样示波器则具有 0. 3ns 的上升 时间。
当然, 上升时间并非问题的全部。电子束每
次通过屏幕所产生的图像的亮度决取于阴极射
线管的荧光剂和加速电势。很多高速示波器不
适于观察低重复率信号就是因为其加速电势较
低; 对高重复率信号则不成问题, 因为眼睛累积
期间电子束可在屏幕上扫掠多次。用比较老式
点, 特别是系统的安装比较简单。而其主要缺点
是测量精度不如数字化处理的高, 一般只能达 到中等水平。
示波器的处理速率受其高频截止频率 f c
的限制, 上升沿时间
tr
∝
f
c
1
20M Hz 的 示 波 器 上 升 沿 时 间 约 为 17ns;
50M Hz 的约为 7ns; 300M Hz 的约为 1. 1ns; 而
数;
kp —激发态演变为其他生成物的速率常
数; k′2 = k ′2a + k ′2b—双分子激发态淬灭的速
率常数。
在这种模型下, 激发态 D* 衰减的速率方
程为
d[ D* dt
]
=
-
( kr +
kq +
kp ) [ D* ]
- k ′2[ Q] [ D * ]
( 2)
原则上讲, Q 在实验中会发生变化, 但实际上,
many case. T he fluor escence lifetime has been analy zed. T w o kinds o f measurem ent means bave been
presented by w hich the laser -induced fluor escence lifetime may be sur veied for no rmal or at hero sclero tic
A th eros clerot ic Plaque Diagnosis U s ing Laser-Induced Fl uores cence. IEE E J . of Q uant . E lect . , 1990, 26 ( 12) : 2207～2217
进行诊断已有很多年的历史, 而以激光作为激 的光学路径也是不可重复的, 这样, 环境的散射
发源诱导组织发射荧光则使这种诊断方法变得 和光学路径的调整便使由测量的强度和光谱来
更加有效。
判断荧光物的性质的工作复杂化。而光谱的相
荧光发射包括光谱( 频域) 特性和时间( 时 域) 行为两方面的信息。因而, 依据激光诱导荧 光的特性进行疾病诊断相应地也有两种方法, 一种是荧光光谱法, 其依据是人体正常组织与 病变组织的荧光具有不同的光谱特性, 介绍这 种方法的例子如文献[ 1] ～[ 2] ; 另一种则称为 荧光寿命法, 其依据是人体正常组织与病变组 织的荧光寿命之 间存在显著差 异, 文献[ 4] ～ [ 6] 介绍的便是这种方法。
迁发生在激发态三重态和基态之间, 则属于量 子力学“禁戒”跃迁, 辐射的光称为磷光。荧光寿
命一般都很短, 依赖于荧光体, 从几十纳妙到几
个纳妙, 乃至亚纳妙。
用 D 和 D* 分别表示系统的基态和激发
态, 研究荧光寿命时主要关心的是激发态的衰
减速率, 衰减过程可以用以下一组关系表示:
D* kr D + h
激发态的寿命 是一种统计平均值, 其积
分形式为
∫∫ =
∞
t
0
-
d[ D * ] dt
dt
∞ 0
-
d[ D* ] dt
dt
( 6)
对激发态随时间按指数规律衰减的情况, 将方
程( 5) 代入方程( 6) 得:
∞
te- ktdt
∫ =
0 ∞
=
e- ktdt
∫0
1 k
( 7)
即激发态平均寿命等于其衰减常数的倒数。
现及发展, 激光诱导荧光寿命可以用更精确的 方法进行测量, 图 2 是这种方法的原理性框图。 图中虚线表示可选择连接, 当它接通时 ICCD 的控制器工作在外同步模式, 不接通时工作在 非同步模式。
图 1 示波器法测量荧光寿命框图 EL—激发光源; S—样品; FL—荧光;
O—示波器; PD—光电二极管; PM—光电倍增管; HV—高压电源。
由于激发态寿命很短, 所以, 在测量寿命的过程
中可以认为 Q 保持不变, 因而可将其归入常数 k′2, 并引进表示激发态衰减的总速率常数。
2
k = kr + kp + kq + k2
其中:
k 2 = k′2 [ Q]
( 3)
于是, 速率方程( 2) 简化为
d[ D* ] dt
=
-
k[ D* ]
( 4)
二、荧光寿命机理 被激光或其他光源激励到激发态的荧光体
1
光 学 技 术 1997 年 3 月
分子会在 很短的时间内自发跃迁回到基态, 同 时辐射比激发光波长稍长的光。如果这种跃迁
发生在激发态单态和基态单态之间, 则属于量
子力学允许的跃迁, 辐射的光称为荧光; 如果跃
的示波器观察低重频信号就更加困难。通过改
善荧光剂性能和提高加速电压, 很多现代的非
常高速的示波器则甚至对单脉冲信号也能产生
可观察像。
各种记忆式示波器非常适合于荧光寿命的
测量。对一个脉冲信号, 这类示波器典型的扫掠
速度为 0. 2～10 s/ cm 甚至更慢。这就说, 即使 用单次发射, 也可以在屏幕上产生一个有用的
踪迹, 或“半持久性”像。
2. 用 ICCD 测量荧光寿命 随着 ICCD( 像增强型电荷耦合器件) 的出
图 2 ICCD 测量荧光寿命的原理框图 D G—多通道延迟信号发生器; PL—脉冲激光器; L —激光束; S —样品; FL —荧光信号; S P—光谱仪; GI—ICCD 的门输入; C —控制器; HV —高压脉冲发生器。
三、荧光寿命的测量
测量荧光寿命有很多种方法, 最直接的方 法就是测量样品受到脉冲光照射后其发射光对
时间的依赖。由样品对激励脉冲的响应关系可
获得激发态衰减的动态特性。下面将介绍两类
测量装置, 第一类的检测设备为光电倍增管和
示波器; 第二类则采用 ICCD 器件。 1. 采用示波器的测量装置
图 1 是这种装置的方框图。图中 ET 是示
第 19 97
2 年
3
期月
光 学 技 术
No. 2
OPTICAL TECHNOLOGY
March 1997
激光诱导荧光命及其测量
阎吉祥 李家泽
( 北京理工大 学光电工程系, 北京 100081)
摘 要: 激光诱导荧光特性的研究可用于包括心血管病在内的多种疾病的诊断。荧光发射包括光谱 ( 频域) 和时间( 时域) 两方面的信息, 后者表现为荧光寿命。在很多情况下, 测量荧光寿 命是比测量光谱 更为有效的诊断方法。本文从理论上讨论了荧光寿命 问题, 并介绍两种测量 方法, 可用 于测量人体正常 组织和病变组织的激光诱导荧光寿命。