木霉植酸酶编码基因多样性及作为系统发育标记潜力研究
植酸酶基因在工程菌中的表达及初步改造的研究
华南理工大学硕士学位论文植酸酶基因在工程菌中的表达及初步改造的研究姓名：毕士峰申请学位级别：硕士专业：生物化工指导教师：张毅2001.2.20丝！：一摘要ｆ植酸酶能提高植酸磷的利用率，除去抗营养因子和减少污染，由于植酸盐存在于谷物类和植物性的粕类中，在家禽及其它单胃动物日粮中成功地利用植酸酶的价值超过任何其它的单一或复合酶的综合效益，使得植酸酶成为全球最有潜力的饲料酶制剂。
｝／本论文研究了植酸酶基因在工程菌中的表达及初步改造。
以含有植酸酶基因的ＰＭＤ质粒为模板，利用ＰＣＲ方法扩增出植酸酶基因片段，把表达载体ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ和ＰＣＲ产物进行重组，构建成功ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ．ｐｈｙＡ质粒，转入大肠杆菌ＪＭｌ０９中进行发酵培养。
对工程菌发酵所产生的蛋白质进行了ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析，ｆ结果表明：植酸酶基因在大肠杆菌ＪＭｌ０９中以可溶性融合蛋白进行表达，分子量约５２ｋＤ。
按种量为２％，３７℃下培养３个小时，然后诱导３小时，可获得较高的表达。
筛选出的工程茵质粒稳定性实验研究表明质粒具有较高的稳定性，连续稀释摇瓶培养１４４小时后，质粒稳定率在９０％以上。
发酵所得酶液的最适ｐＨ为５．６，最适温度为５５℃，在ｐＨ３～８的范围内活性都比较高，４０℃以下稳定。
ｃａ２＋有激活作用，Ｈ９２＋和ｃ０２＋有较强的抑制作用。
Ａｌ”的影响作用较小。
以植酸作为底物时，米氏常数为Ｋｍ＝５２．６ｌａｍ０１／Ｌ，底物与酶有较强的亲合力。
；、、通过ｅｒｒｏｒ—ｐｒｏｎｅＰＣＲ法对植酸酶基因进行体外随机突变，与载体ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ重组后转入大肠杆菌中进行表达，筛选出热稳定性较高的菌株。
测定突变株酶活与非突变株相近，热稳定性稍有提高，在６５℃下３０分钟后酶活剩余４０％，提高３０％。
关键词：植酸酶；ｐｈｙＡ丝童堡三查耋三兰堡圭兰堡丝塞：ＡＢＳＴＲＡＣＴＰｈｙｔａｓｅｃａｎｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｒａｔｉｏ，ｅｌｉｍｉｎａｔｅａｎｔｉ—ｎｕｔｒｉｔｉｏｎｆａｃｔｏｒａｎｄｄｅｃｒｅａｓｅｔｈｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｐｏｌｌｕｔｉｏｎ．Ｐｈｙｔａｔｅｅｘｉｔｓｉｎｔｈｅｐｌａｎｔｓｅｅｄｓｏｆｃｏｒｎａｎｄｏｉｌｃｒｏｐ．Ｔｈｅｇｅｎｅｒａｌｂｅｎｅｆｉｔｉｓｂｅｔｔｅｒｔｈａｎａｎｙｏｔｈｅｒｅｎｚｙｍｅｉｆｉｔｃａｎｂｅｕｓｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｉｎｔｈｅｆｅｅｄｓｔｕｆｆｏｆｍｏｎｏｇａｓｔｒｉｃａｎｉｍａｌｓ，ＳＯｐｈｙｔａｓｅｉｓｂｅｃｏｍｉｎｇｔｈｅｍｏｓｔｐｒｏｍｉｓｉｎｇｆｏｄｄｅｒｅｎｚｙｍｅ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｒｉｍａｒｙｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｈｙｔａｓｅｇｅｎｅ—ｐｈｙＡｗａｓｓｔｕｄｉｅｄ．ＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｈｙｔａｓｅｇｅｎｅｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｐｌａｓｍｉｄＰＭＤ４．２１ｂｙＰＣＲ，ｔｈｅｐｌａｓｍｉｄｐＴｒｃｈｉｓ２Ｂ－ｐｈｙＡｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｗｉｔｈｖｅｃｔｏｒｐＴｒｃｈｉｓ２Ｂａｎｄｐｈｙｔａｓｅｇｅｎｅ—ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｗｈｉｃｈｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏｔｈｅｈｏｓｔＣｅｌｌ．ＥＣＯｌｉＪ．Ｍ』Ｄ９。
植酸酶的多样性及其分类
微生物学通报 MAY 20, 2010, 37(5): 738−747 Microbiology China © 2010 by Institute of Microbiology, CAStongbao@基金项目：国家863计划项目(No. 2006AA10A211) *通讯作者：Tel: 86-531-82605386; Fax: 86-531-82965636; : yanght@收稿日期：2009-08-24; 接受日期：2010-01-18专论与综述植酸酶的多样性及其分类李晓龙1,2 杨合同1,2* 扈进冬2 吴远征2 李纪顺2 任艳2(1. 山东理工大学生命科学学院 山东 淄博 255049)(2. 山东省科学院生物技术中心 山东省应用微生物重点实验室 山东 济南 250014)摘 要: 植酸酶是一类催化植酸水解逐步释放磷酸基团形成低级肌醇磷酸衍生物的正磷酸单酯磷酸水解酶。
植酸酶在动物营养、资源环境保护和人类健康等领域有巨大的应用潜力。
目前, 人们对植酸酶的多样性及其分类的认识比较模糊甚至错误, 严重影响了植酸酶的研究进程和水平。
首先简要概述了基于最适pH 和立体专一性的植酸酶分类, 然后着重论述了基于结构和催化机理的植酸酶分类及其代表酶特征的最新研究进展, 最后探讨了根据不同分类标准特别是基于结构和催化机理准确理解和全面表征各种植酸酶的重要性, 以期为植酸酶的研究和应用提供参考。
关键词: 植酸酶, 最适pH, 立体专一性, 结构和催化机理, 分类Diversity and Classification of PhytasesLI Xiao-Long 1,2 YANG He-Tong 1,2* HU Jin-Dong 2 WU Yuan-Zheng 2LI Ji-Shun 2 REN Yan 2(1. School of Life Sciences , Shandong University of Technology , Zibo , Shandong 255049, China )(2. Shandong Provincial Key Laboratory for Applied Microorganism , Biotechnology Center , Shandong Academyof Sciences , Jinan , Shandong 250014, China )Abstract: Phytase is a type of orthophosphomonoester phosphohydrolase, which catalyticly initiates step-wise hydrolysis of phytic acid to release phosphate radicals and produce lower inositol phosphate deriva-tives. Phytase has great application potential in the areas of animal nutrition, resource conservation, envi-ronmental protection and public health. At present, the understanding in phytase diversity and classification is so confusing or even inaccurate that the research progress and level of phytase has been badly affected. In this paper, the phytase classification based on optimal pH and stereospecificity is briefly introduced first, and then the updated research advance in phytase classification based on structure and catalytic mechanisms and the attributes of the representative phytases are summarized and discussed comprehensively. It is of vital importance to take into consideration the classification standards especially to focus on structure and cata-lytic mechanisms when a given phytase could be fully and accurately understood and characterized. Keywords: Phytase, Optimal pH, Stereospecificity, Structure and catalytic mechanisms, Classification 植酸(Phytic acid 或Phytate), 即肌醇六磷酸(myo -Inositol hexa kis phosphate, IP6), 是植物种子中磷元素的主要储存形式, 普遍存在于植物性食品和饲料[1]。
植酸酶及其基因工程改造研究进展
一类酶的总称，自然界存在很多能水解植酸盐的酶类，
统称“植酸酶”。植酸酶广泛存在于动植物组织和微生
物细胞中，在植物中主要存在于谷物和豆科植物的种
摘要 植酸酶做为一种新型的酶制剂，引起了国内外研究者的极大关注。植酸酶广泛存在于动植物组织和微生物细
胞中，分解植酸磷，降低磷的排放量。文章综述了植酸酶的分类、理化性质、作用机理、菌种选育，并着重讨论了近
酶之困”转变为“植酸酶之盛”， 是每个从业者应该思
考的问题。
2 植酸酶的理化性质
2.1植酸酶的分子量
植酸酶的物理性质植酸酶的分子量依来源不同差异
很大，主要分布在35～200 KDa 之间，最大达700 KDa ，
最小仅10～13 KDa。Quan等[12]从Cladosporium sp. FP - 1 分
酶被认为是活性最强的[3，4]。
植酸酶按结构的不同主要可以分为三类:霉菌及部
分细菌来源的PhyA 与PhyB、Bacillus subtilis 来源的
PhyC、玉米植酸酶[2]。3 - 植酸酶( EC. 3. 1. 3. 8) PhyA
与6 - 植酸酶( EC. 3. 1. 3. 26) PhyB属于同一酶家族，
年来植酸酶基因工程改造等问题。
关键词 植酸酶; 基因工程；
植酸酶及其基因工程改造研究进展
武燕平 刘霞1 张彦杰2 罗俊彩2 王燕1 杨平平1
( 1 山东轻工业学院，山东济南 250353；2 山东理工大学，山东淄博 255049)
作者介绍：武燕平（1 9 8 3 - ），女，山东菏泽人，山东轻工业学院研究生。
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植酸酶的分子生物学特性及应用前景研究进展
植酸酶的分子生物学特性及应用前景研究进展
倪宏波;曲进;石星明;徐春厚
【期刊名称】《黑龙江八一农垦大学学报》
【年(卷),期】2005(017)003
【摘要】植酸酶是一类能促进植酸及其盐类水解成肌醇和磷酸的酶的总称.它作为饲料和食品添加剂也有重要的使用价值,能提高饲料和食品中磷的利用率、减轻对环境的污染,清除植酸与金属离子的螯合作用,改善营养成分的吸收和利用.本文主要综述了国内外真菌植酸酶的分子生物学及其基因工程研究的最新进展,讨论了其进一步的研究方向与应用前景.
【总页数】4页(P62-65)
【作者】倪宏波;曲进;石星明;徐春厚
【作者单位】黑龙江八一农垦大学动物科技学院,大庆,163319;黑龙江省建三江分局二道河子农场兽医站;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所;湛江海洋大学
【正文语种】中文
【中图分类】Q556
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植酸酶的分子生物学与基因工程探讨
植酸酶的分子生物学与基因工程探讨作者：蒋灵晰来源：《农家科技下旬刊》2014年第03期摘要：本文綜述植酸酶的分子生物学和基因的相关特性，并由此展开探讨。
关键词：植酸酶；分子生物学；基因工程在自然界中，磷原子被认为以植酸磷的形式存在于谷类、豆类、小麦、玉米等多种作物的果籽内【1】，由于高营养的原因这些作物广泛运用于饲养业中。
但因植酸本身极难被单胃动物小肠利用吸收，造成了植酸中磷离子的浪费。
植酸酶则是一种能够将植酸、及其盐类物质水解成肌醇与磷酸盐的一类酶的总称，是近几年的一种极具研究价值的酶类。
一、植酸酶的分子生物学在世界范围内，已有较多的植酸酶的相关制剂运用于畜牧业。
从植酸酶分子研究的历程可知，植酸酶的研究始于谷糠【2】等植物，随后逐步认识到植物中植酸酶属于6-植酸酶，最适pH近中性【3】，这点并不满足人们的要求。
在饲养业中，植酸酶常作为饲料添加，对单胃动物而言，所需要的是酸性植酸酶，而鱼类等水产业生物而言则需要碱性植酸酶【4】。
于是人们转向微生物来源的植酸酶的相关研究。
1.1微生物来源的植酸酶的酶学特性在酵母、曲霉、根霉等真核微生物和枯草芽孢杆菌、假单胞杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌等原核生物中已发现大量的植酸酶存在【3】。
对于不同微生物来源的植酸酶，李晓龙【5】等人利用最适pH和立体专一性作为标准对其分类，往往认为有3-植酸酶，6-植酸酶，5-植酸酶三种立体专一不同的植酸酶。
绝大多数的微生物产生3-植酸酶【5】，例如来源于A.ficuum NRRL3135的植酸酶PHYA，这类植酸酶最终产物为2-磷酸肌醇单酯。
1.2植酸酶基因目前已分离克隆的植酸酶基因多种多样。
对于属于自然界中分布最广的组氨酸酸性磷酸酶家族的PHYA而言，其基因往往在所编码的氨基酸序列具有较高的相似性。
例如对于NRRL3135和A.niger 963 l两种来源的PHYA，其氨基酸序列的同源性高达92%【2】。
二、植酸酶的基因工程运用基因工程有目的的产生人们所希望的生命物质已成为现代生物学中不可缺失的一部分。
酯酶功能和编码基因的多样性
和能 量 代 谢 ， 酶 还 直 接 催 化 细 胞 信 号 物 质 的 合 成 和 转 化 。 酶 大 多 由多 基 因 家 族 编 码 ， 一 家 族 成 员 在 不 同 种 生 物 和 同 一 生 物 酯 酯 同
不 同亚 种 中存 在 差 异 ， 因此 是进 化关 系 分 析 和 品 种 鉴 定 的 重 要 靶 酶 。 酶 自身 活 性 受 酶 蛋 白 的磷 酸 化 和 糖 基 化 的调 节 。 研 究扼 酯 本
Ｔｈｅ Ｄｉ ｅ ｓｔ ｏ ｔ ｒ ｓ Ｆｕｎ ｔｏ ａ ｄ ｖ ｒ ｉｙ ｆ Ｅｓｅ ａ ｅ ｃ ｉ ｎ ｎ Ｅｎｃ ｄｉ ｅ ｓ ｏ ｎｇ Ｇ ｎｅ
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要综述酯酶种类 、 能 、 码基 因 、 因进化和功能调节多样性方面的研究进展。 功 编 基
植酸酶基因phyA的克隆及在毕赤酵母中的高效表达的开题报告
植酸酶基因phyA的克隆及在毕赤酵母中的高效表达的开题报告摘要：植酸酶（phytase）是一种可降解植物中磷酸盐形式的酶，对提高畜禽饲料的磷利用效率具有重要作用。
本研究以几种源自不同植物的植酸酶序列作为参考，设计出特异性引物并进行PCR扩增，成功克隆了一段来自小麦中的phyA基因序列。
随后将该基因序列与毕赤酵母表达载体进行连接，并利用基因工程技术将其表达于毕赤酵母中，经过优化后获得了高效的表达结果。
本研究的结果为进一步研究phyA基因的功能及其在工业上的应用奠定了基础。
关键词：植酸酶；phyA基因；PCR扩增；毕赤酵母；表达。
1. 研究背景植酸酶是一种能将植物中的植酸磷酸化合物水解成可被动物利用的无机磷化合物的酶。
在畜禽饲料中添加植酸酶可以提高饲料磷的利用率，减少磷污染对环境的影响，也减轻了饲料制造成本。
因此，植酸酶在畜禽饲料工业中具有广泛的应用前景。
phyA基因编码植酸酶，目前已在多种植物和微生物中被克隆和表达。
但是，要获得高效的植酸酶生产菌株，必须对phyA基因进行进一步研究。
因此，本研究旨在克隆phyA基因，并将其表达于毕赤酵母中，为进一步研究植酸酶的功能和工业应用提供基础。
2. 研究方法2.1. 引物的设计以已公布的几种植酸酶基因序列为参考，利用生物信息学工具设计了一对特异性引物。
引物的序列为：5'ATG CTG TGT TCA CGT GGC3'（向前引物）和5'CGA GAA TCG ACG AGA ATC TGC3'（向后引物）。
2.2. PCR扩增以小麦DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环。
2.3. 克隆和序列分析将PCR产物分离、纯化、连接到pGEM-T Easy载体上，转化到E. coli JM109中筛选正常克隆。
使用ABI 3730 DNA序列分析仪对克隆物进行测序，并用DNAstar软件进行序列分析。
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木霉植酸酶编码基因多样性及作为系统发育标记潜力研究张超1，2，3，罗俊彩1，2，3，扈进冬2，3，李纪顺2，3，杨合同1，2，3*（1．山东理工大学生命科学学院，山东淄博255049；2．山东省科学院中日友好生物技术研究中心，山东济南250014；3．山东省应用微生物重点实验室，山东济南250014）摘要对现有的148株木霉菌株在含植酸钙的琼脂培养基上进行了产植酸酶能力鉴定，结果表明所有菌株均产生了水解透明圈，说明所有测试的木霉菌株都具有植酸酶活性，植酸酶编码基因在木霉群体中具有广泛性。
选取14个种类的21株木霉，采用植酸酶保守序列设计简并引物P8205、P500-2扩增获得其中11种17株木霉植酸酶基因片段，进行了序列测定；利用ITS4、ITS5引物扩增17个木霉菌株的ITS 序列并测序。
分别基于植酸酶基因片段序列以及ITS 序列信息，通过邻接法（N-J 法）构建系统发育树，结果表明植酸酶基因序列具有多样性的特点，而基于植酸酶基因序列与基于ITS 序列的分类结果基本相同，不同的是长枝木霉（Trichoder-ma longibrachiatum ）植酸酶基因序列与哈茨木霉（Trichoderma harzianum ）被分到同一分支当中，与ITS 序列的进化关系相差较大，表明有可以作为木霉分类的一种新的标记的潜力，并携带部分与ITS 序列不同的系统发育相关信息。
关键词木霉；植酸酶基因；多样性；系统发育标记中图分类号Q55文献标识码A文章编号1005－7021（2012）03－0007－06Diversity and Potential Regarded as Phylogenetic Marks of Trichoderma Phytase Encoding GenesZHANG Chao 1，2，3，LUO Jun-cai 1，2，3，HU Jin-dong 2，3，LI Ji-shun 2，3，YANG He-tong 1，2，3（1．Schl．of Life Sci．，Shandong Uni．of Technol．，Zibo 255049；2．Biotech．Ctr．，Shandong Acad．of Sci．，Ji ’nan 250014；3．Shandong Key Lab．for Appl．Microorg．，Ji ’nan 250014）Abstract Phytase hydrolytic experiments on agar medium containing calcium phytate were done with the existing 148Trichoderma strains to carry out characterization of their phytase capability ，the results showed that all of these strains generated hydrolytic halos around colonies ，indicating all of the tested Trichoderma strains possessed phytase activity ，and phytase encoding genes widely existed in Trichoderma population．21strains of 14kinds of Trichoderma were cho-sen ，and adopted conservative sequence of phytase to design degenerate primers P8205and P500-2and obtained phytase gene fragments of 11kinds of 17Trichoderma strains by amplification ，and carried out sequencing ；ITS4and ITS5primers were used to amplify ITS sequence of 17Trichoderma strains and carry out sequencing．The phylogenetic trees were established through N-J method based on phytase gene fragments and ITS sequences information respective-ly．The results showed that phytase gene sequences had the characteristics of diversity ，and the classification results based on both sequences were basically the same ，the difference was that the phytase gene sequences of T．longibra-chiatum were placed into the same branch with T．harzianum ，however ，the evolution relation with ITS sequences dif-fered fairly great ，indicating that they had a potential as a new marker to classify Trichoderma ，and carrying part of基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划：2011AA10A205）作者简介：张超男，硕士研究生。
研究方向为微生物分子生物学。
E-mail ：zczc624@163．com *通讯作者。
男，研究员，博士生导师。
研究方向为植物保护。
Tel ：0531-********，E-mail ：yanght@keylab．net 收稿日期：2012-02-01；修回日期：2012-02-217微生物学杂志2012年5月第32卷第3期JOURNAL OF MICROBIOLOGY May 2012Vol．32No．3related phylogenetic information that differed from ITS sequences．Keywords Trichoderma；phytase genes；diversity；phylogenetic marker木霉（Trichoderma spp．）是能够拮抗多种农作物的病原菌，促进农作物生长并诱导其产生抗病性［1］，是一种重要的植物病害生防菌；木霉所产纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、几丁质酶及蛋白酶等已在各个领域广泛应用［2］，是重要的工业微生物。
目前已知我国木霉菌有16个种［3］。
传统的木霉生物学鉴定主要依据形态学特征［4］，虽然形态学研究已经比较成熟，但是木霉的形态特征比较多样化，且易受到生存环境影响，因此同种的菌株之间也会存在差异，造成分类鉴定结果不稳定。
近年来，分子生物学技术运用到了木霉属分类和系统进化以及鉴定研究当中，例如蛋白标记（同工酶分析）、扩增片段长度多态性（AFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、内转录间隔区（ITS）序列分析等技术的应用，取得了显著的成果［5-9］，但是系统发育树会因菌株、基因标记及聚类方法的不同而异，其中基因标记序列的影响最大，因此现有基因标记尚不能完善地解决木霉的分类问题。
植酸酶（Phytase）是一种能降解植物性饲料中的植酸的酯酶，能将植酸分解为肌醇和磷酸［10］，广泛存在于植物、真菌、酵母和细菌［11］。
已有的研究表明，大部分丝状真菌植酸酶之间的进化关系较近［12］。
本研究结合木霉基于ITS序列及形态特征的分类与鉴定结果，通过比较分析，探讨了植酸酶编码基因的多样性及其用于木霉分类与鉴定工作的可行性。
1材料与方法1．1材料1．1．1实验菌株山东省科学院实验室保存的木霉菌种包括木霉菌种（14个菌株），从中国农业微生物菌种保藏中心购买的菌种（5个菌株），从山东5地区（87个菌株）和新疆25个土样中（42个菌株）分离获得的共148个木霉菌株。
选取14种21株形态鉴定差异较大的菌株进行植酸酶系统发育研究，如表1所示。
表1扩增植酸酶基因的21个木霉菌株Table1Phytase gene was amplified in21strains of Trichoderma spp．菌株编号菌种名称来源T72哈茨木霉（T．harzianum）聊城大蒜种植区TP拟康宁木霉（T．pseudokongningi）山东省科学院微生物重点实验室T9-1长枝木霉（T．longibrachiatum）聊城黄瓜大棚T9侧耳木霉（T．pleuroticloa）山东省科学院微生物重点实验室A5MH盖姆斯木霉（T．gamsii）山东省科学院微生物重点实验室T61-2绿木霉（T．virens）临沂白菜种植区T2-1侧耳木霉（T．pleuroticloa）山东省科学院微生物重点实验室TK7a康宁木霉（T．koningii）山东省科学院微生物重点实验室ACCC30592多孢木霉（T．polysporum）农业微生物菌株管理保藏中心ACCC31640卵孢木霉（T．ovalisporum）农业微生物菌株管理保藏中心ACCC30152柠檬绿木霉（T．citrinoviride）农业微生物菌株管理保藏中心ACCC30594绿色木霉（T．viride）农业微生物菌株管理保藏中心ACCC32084顶孢木霉（T．fertile）农业微生物菌株管理保藏中心T1-1棘孢木霉（T．asperellum）山东省科学院微生物重点实验室TG钩状木霉（T．hamatum）山东省科学院微生物重点实验室NKN拟康宁木霉（T．pseudokongningi）山东省科学院微生物重点实验室XJnml深绿木霉（T．atrovivide）山东省科学院微生物重点实验室LTR-2绿色木霉（T．viride）山东省科学院微生物重点实验室GZ钩状木霉（T．hamatum）山东省科学院微生物重点实验室XJ4-7柠檬绿木霉（T．citrinoviride）山东省科学院微生物重点实验室T79-1哈茨木霉（T．harzianum）章丘葱种植区8微生物学杂志32卷1．1．2培养基①PDB培养基：马铃薯200g，葡萄糖15g，蒸馏水定容至1L；②PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖15g，琼脂15g，蒸馏水定容至1L；③平板筛选培养基（质量体积比，%）：植酸钙0．5，葡萄糖2，硝酸铵0．5，氯化钾0．05，硫酸镁0．05，硫酸亚铁0．01，硫酸锰0．001，琼脂粉2，pH自然，倒板前加0．1%Triton X-100。