复合诱变选育高产纤维素酶黑曲霉菌株
黑曲霉高产纤维素酶菌株的高通量筛选
孔间和板 间酶活力值 的变异 系数均在 ５ 以下 ， 重现性和稳定性均能够满足高通量 复筛 的需要 ； 经过对所得菌株 固 态发酵条件优化后发现 ， 当碳源为稻草粉和麸皮 的混合物 ， 氮源为 ２５ 硫酸铵添加量 为 １５ 时 的玉米 浆作为生 ． ．
长促进剂 ， 加水量 为 ３ ／ １ ０ｇ 的 培养 基产 酶 效果 最 好． 最 佳 培养 条 件下 ， 分 泌纤 维 素 滤纸 酶 活力 为 ５ｍＬ （０ ） 在 其
６ １ ８ｗａ ｕ ｊｃｅ ｏｍｕａｉｎｉｖ ｌｉｇｉ ａ ｉ ｉｎｗｉ ｌ ａ ｉｌ ｇ ｔａ ｄｓ ｂ ｅｕ ｎｌ ｔ ｌ ｔｏ ０ ０ ｓｓ ｂｅｔｄｔ ｔｔ ｏｖｎ ｒｄａ ｏ ｔ ｕｔ ｖｏｅ ｌ ｈ ｎ ｕ ｓｑ ｅ ｔ ｗｉ ｅｅ ｒｎ ｏ ｎ ｒ ｔ ｈ ｒ ｔｉ ｙ ｈ ｃ
Ａｂ ｔａ ｔ Ｔｏ ｏ ｔ ｉ ｉｈ ｃ ｌ ｌｓ － ｒ ｄ ｃｎ ｔａｎ， ｈ ａ ｅ ｔ １ｓｒ ｉ ｐ ｒ ｌｕ ｉ ｅ Ｉ ｓｒｃ ： ｂ ａｎ ａ ｈ ｇ ｅｌ ａ ｅｐ ｏ ｕ ｉｇ ｓｒ ｉ ｔ ｅ ｐ ｒ ｎ ａ ｔａｎ Ａｓ ｅ ｇｉｌ ｓｎ ｇ ｒ ＧＳ ＣＣ ｕ
ｂ ａ ． ｅｒ ｓ ｌｓｓ ｏ ｄ ｔ ａ ｆｅ ｈ ｒｍａ ｙ ｓ ｒｅ ｉｇ ｂ ｅｌｌ ｓ ｎ ｏ Ｒｅ ｅ ｉｍ ｎ ｅ ｏ ｄ ｒ ｅ ｍ Ｔｈ ｅ ｕ ｔ ｈ ｗｅ ｈ ｔａ ｔｒｔ ｅ ｐ ｉ ｒ ｃ ｅ ｎ ｎ ｙ ｃ ｌ ｏ ｅＣｏ ｇ － ｄ ｍ ｄ ｕ ａ ｄ ｓ ｃ ｎ ａ ｙ ｕ ｈｇ －ｈ ｏ ｇ ｐ ｔｓ ｒ ｅ ｉ ｇｗ ｉ ｅ ｙ ｄ ｖ ｌｐ ｅ ｔｏ ｃ ｏ ｌｔ－ ａ ｅ ｉ ｅ ａ ｅ ｓ ａ ， ｈ ｔｂ ｅｍ ｕ ｉ ｈ ｔ ｒ ｕ ｈ ｕ ｃｅ ｎｎ ｔ ｎ ｗｌ ｅ ｅｏ ｍ ｎ ｆｍｉｒ ｐ ａｅ ｂ ｓ ｄ ｆ ｔ ｒｐ ｐ ｒａ ｓ ｙ ｔ ｅ ｓａ ｌ — ｈ ｌ
产纤维素酶黑曲霉菌种的复壮
选料→清洗→粉碎→微波提取→分离→浓缩→ 洋芫荽、茴香、龙蒿、牛膝草、鼠尾草、百里香
干燥→粉化→产品
等。已用于板蓝根的板蓝根多糖、麻黄的麻黄碱、
４．３ 应用
高山红景天的红景天苷、柚皮的色素、罗汉果的罗
采用微波萃取技术提取活性成分的研究已包括 汉果皂苷、射干的鸢尾苷、金针菇的实体多糖、黄
了生物碱类、有机酸、萜类、蒽醌类、黄酮类、皂 芩的黄芩苷、金银花的绿原酸， 以及紫杉醇、麦角
工艺与设备
产纤维素酶黑曲霉菌种的复壮
张志焱， 徐海燕， 吕明霞， 杨军方， 曹 斌
（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东 泰安 ２７１０００）
摘 要： 介绍了饲用酶制剂生产菌种黑曲霉纯化复壮的方法， 并对复壮菌株、退化菌株、原始菌株的酶活力 及长势进行了比较， 结果表明经纯化复壮筛选出的 ７ 号菌株纤维素酶活力明显高于退化的菌株， 且生长快、长势 强， 甚至优于原始菌株。
标准曲线绘制： 取 ２５ ｍＬ 具塞刻度试管 ６ 支， 分 别 加 入 １．０ ｍｇ·ｍＬ－１ 的 葡 萄 糖 标 准 溶 液 ０， ０．４， ０．８， １．２， １．６， ２．０ ｍＬ， 再依次加纯化水 ２．０， １．６， １．２， ０．８， ０．４， ０ ｍＬ， 加 ＤＮＳ 试 剂 １．５ ｍＬ， 混 合 均匀后沸水浴 ５ ｍｉｎ， 取出立即用冷水冷却， 用纯 化水定容到 ２５ ｍＬ， 摇匀， 在 ５４０ ｎｍ 测吸光度 Ａ， 以吸光度为纵坐标， 葡萄糖的含量为横坐标， 绘制 标准曲线。
△Ａ＝Ａｓ－ Ａｃｋ 根据△Ａ 从标准曲线上查得葡萄糖含量 Ｐ。 酶活力（ Ｕ·ｇ－１） ＝Ｐ×Ｋ×１ ０００ ／ ０．５ ×３０ 式中 Ｋ 为稀释倍数。 ２．５．２ 水分的测定 采用水分快速测定仪法。 ３ 结果与讨论 ３．１ 初筛结果 经过纯化复壮， 以菌株生长性能为指标， 确定 符 合 标 准 的 ３ 号 、７ 号 、８ 号 、１３ 号 、１５ 号 、２２ 号为初筛菌株。 ３．２ 复筛结果 菌株在全麸皮培养基上纤维素酶活力测定结果 见表 １。
复合诱变选育纤维素酶高产菌株
复合诱变选育纤维素酶高产菌株
白敏霞;李彩英;黄智娴;黄琦琦;韦利欢;付跃
【期刊名称】《广东化工》
【年(卷),期】2022(49)21
【摘要】以绿色木霉为原始菌株,以纤维素酶酶活为考察指标,进行纤维素酶高产菌株的筛选。
首先进行紫外诱变,筛选得到一株纤维素酶高产菌株A4,其羧甲基纤维素酶酶活和滤纸酶活为35.36 U/mL和25.30 U/mL,较出发菌株提高了26.37%和16.00%。
继续用A4进行亚硝酸钠诱变,得到纤维素酶高产菌株F1,其羧甲基纤维素酶酶活和滤纸酶活为44.29 U/mL和29.00 U/mL,较出发菌株提高了24.90%和14.62%。
【总页数】4页(P114-116)
【作者】白敏霞;李彩英;黄智娴;黄琦琦;韦利欢;付跃
【作者单位】河池学院化学与生物工程学院;微生物及植物资源开发利用广西高校重点实验室;河池学院农业生物技术应用研究中心
【正文语种】中文
【中图分类】TQ
【相关文献】
1.复合诱变选育高产纤维素酶绿色木霉菌株
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3.紫外-微波复合诱变选育高产纤维素酶的Trichoderma asperelloides菌株
4.
真空微波诱变结合化学诱变选育酸性纤维素酶高产菌株5.纤维素酶高产菌株的复合交替诱变选育
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复合诱变选育耐高温高产葡萄糖酸盐的黑曲霉菌株
文 章编 号 ： ０ ２ ５ ４ — ５ ０ ７ １ （ ２ ０ １ ６ ） １ ２ — ０ １ ３ ３ — ０ ４
ｄ ｏ ｉ ： １ Ｏ ． １ １ ８ ８ ２ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． ０ ２ ５ ４ — ５ ０ ７ １ ． ２ ０ １ ６ ． １ ２ ． ０ ２ ７
Ｃｏ ｍｐ ｏ ｕ ｎ ｄ ｍｕ ｔ ａ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ｉ ｓ ｓ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎ ｉ ｎ ｇ ｏ ｆ ｈ ｉ ｇ ｈ ｔ ｅ ｍｐ ｅ ｒ ａ ｔ ｕ ｒｅ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎ ｔ ａ ｎ ｄ ｈ ｉ ｇ ｈ ｇ ｌ ｕ ｃ ｏ ｎ ａ ｔ ｅ － ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｉ ｎ ｇ
黑曲霉高产纤维素酶活突变株的筛选
种 子 培 养 基 ：玉 米 秸 秆 粉 ２ｇ ，营 养 盐 溶 液（２ ％ （ＮＨ４）２ＳＯ，０．０５％ ＭｇＳＯ·４ ７Ｈ２Ｏ，０．０１％ ＫＨ２ＰＯ４）５ ｍＬ。
基础产酶培养基：玉米秸秆粉 ６０％，麸皮 ４０％，营养液 （２．０％（ＮＨ４）３ＰＯ４，０．０５％ ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，０．０１％ ＫＨ２ＰＯ４） ２５０％（ｖ／ｗ）。
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｎａｍｅｄ ＺＭ－８ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｗａｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｂｙ ｓｐａｃｅ－ｆｌｉｇｈｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｃｏｒｎ ｓｔａｌｋ ｐｏｗｅｒ ６０％， ｗｈｅａｔ ｂｒａｎ ４０％， ａｎｄ ｔａｐ ｗａｔｅｒ ２５０％（ｖ／ｗ）， （ＮＨ４）３ＰＯ４ ２％， ｐＨ６．０ ａｔ ３０℃ ｆｏｒ ７２ ｈｏｕｒｓ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｉｔｓ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ （Ｃ１）， ｅｘｏｇｌｕｃａｎａｓｅ （ＣＭＣａｓｅ） ａｎｄ β－ ｇｌｕｃｏｓａｃｃｈａｒａｓｅ（β－Ｇｌａｓｅ） ｔｏｗａｒｄ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ ｒｅａｃｈｅｄ １１０．２ Ｕ／ｇ， ３８９．９ Ｕ／ｇ， ４８９．３ Ｕ／ｇ ａｎｄ １２０８．１ Ｕ／ｇ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｂｙ ２．１， ３．５， １．７， １．８ ｔｉｍｅｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｐａｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ． Ｉｔ ｈａｓ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ｆｏｒ ５ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｌｉｄ ｍｅｄｉｕｍ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ Ａ． ｎｉｇｅｒ ｉｓ ａ ｐｒｅｆｅｒａｂｌｅ ｓｔｒａｉｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｏｐ ｓｔａｌｋｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ； ｃｅｌｌｕｌａｓｅ； ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
纤维素酶高产菌株的选育
（Ｕ／ ）来 表 示 。 Ｉ ｍＥ １ ３ 抗 分 解代谢 阻遏 的 突 变株 的选 育过 程 ． １ ３ １ 诱 变处 理 过程 ．．
纤 维 素物 质 的酶 促水 解 具 有 良好 的应 用 前景 。但
是 ，目前所存在的主要问题是酶解效率不高。为提高 纤维素酶解 的效率 ，多采用选育高产纤维素酶菌种和 改变纤维材料的结构 ，提高对酶的敏感性的方法 。选 育优 良菌种是提高纤 维素酶活力的关键 。通常，从 自 然界 分 离筛 选 的野 生 型菌 株 其产 酶 能力 比较 低 。为提 高纤维素酶 活力 ，诱 变育 种是一 种有效 的方法 。 目
基础。
天～１ 天 ，液体培养 ６ ～８ 。 ０ 天 天
１ ２ 分析 方 法 ．
还 原糖 测 定 ：取 上清 液 ，按 照 Ｍｉｅ 方 法 ，使 用 ｌｒ ｌ ＤｉＳ试 剂 测定 还 原 糖 的含 量 。 以葡 萄糖作 为标 准 。 Ｎ 纤 维素 酶 活力 测定 ：采 用 Ｍａ ｄｌ方 法来 测 定 滤 ｎｅ ｓ 纸 酶 活 （ ｉｅ ａｅ ｔ ｉ ，简 称 为 Ｆ Ａ）和 Ｃ ＦｌｒＰｐｒ ｉ ｔ ｔ Ａｃ ｖ ｙ Ｐ ＭＣ 酶 活 （ ＩＣ’ｅ） 其 酶 活 力 单 位 用 国 际 单 位 ＣＶ ａ 。 Ｉ ｓ
论产纤维素酶黑曲霉菌的探究进展
论产纤维素酶黑曲霉菌的探究进展作为地球上含量最为丰富，分布最为广泛的可再生生物质资源，纤维素的开发与利用对于解决能源危机、环境污染、粮食资源紧张等问题意义重大。
纤维素由D - 葡萄糖分子以beta; - 1，4 糖苷键组成的大分子多糖，其分子结构结晶度与聚合度高，需要利用纤维素酶的水解作用，将其降解成为单糖，继而进行纤维素的合理利用与转化。
纤维素酶是一组复合酶系，通过多种酶的协同作用水解降解纤维素，纤维素酶主要来源于可产纤维素酶的细菌和真菌。
其中，由于丝状真菌纤维素酶产量高于细菌和酵母菌等真菌，被广泛应用于纤维素酶产业化生产。
作为丝状真菌中的一员，黑曲霉菌高产纤维素酶，且安全、无毒素，在产纤维素酶微生物研究领域，黑曲霉菌是开发、利用最为广泛的真菌之一。
近年来，在高产纤维素酶微生物，发酵产酶工艺，应用领域等方面国内外均开展了相关研究，且取得了一定的进展。
1 纤维素酶的组成与催化机制纤维素酶是由三种不同酶组成的复合酶系，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或纤维二塘水解酶、beta; - 葡萄糖苷酶。
三种酶通过协同作用将纤维素降解为寡糖和纤维二塘，并最终水解为葡萄糖。
内切葡聚糖酶主要作用于纤维素分子的非结晶区，随机水解beta; - 1，4 糖苷键并产生大量带有非还原末端的小分子纤维，此外，也能水解纤维素的某些基团取代产物，如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素等。
外切葡聚糖酶主要作用于微晶纤维素分子的还原端和非还原端，水解beta; - 1，4 糖苷键，从而裂解下二糖分子。
beta; - 葡萄糖苷酶可将纤维二糖和其他可溶性寡糖水解为葡萄糖。
2 产纤维素酶微生物产纤维素酶的微生物主要包括细菌、真菌和放线菌。
放线菌和细菌纤维素酶产量相对较低，放线菌生长缓慢，相关研究较少，细菌纤维素酶多为内切葡聚糖酶，对结晶纤维素无活性，且分离难度较大，影响其产业化开发。
高产纤维素酶的真菌主要包括曲霉菌属、木霉菌属、青霉菌属、镰孢菌属和枝顶孢雄属等。
高产纤维素酶菌株的诱变选育和筛选
摘
要 ：用青霉 （ ｅｉｉ ｉｍ ． ＨＫ一０ Ｐ ｎｃｌ ｕ ｓ ） ｌ ｐ ０ ３为 原 始 茵 ， 亚硝 基胍 （ Ｇ） 羟胺 复 合 谤 变 ， 据 变 经 ＮＴ 、 根
异 茵株 茵落形 态变化 与产 酶 高低 的 关 系。 结合 酶 活 力检 测 理化 指 标 ， 筛选 出一 株 高产 稳 定 的 纤 维 素酶 茵株 Ｌ －３ ， 产酶 能 力 由 ２ ０Ｕ／ Ｘ ４５ 其 ０ ｍＬ提 高到 ４ ５Ｕ／ １ ｍＬ， 出发 茵株 提 高 ２ Ｏ 较 ． ８倍 。对 该 茵
废水 处 理 、 工业 洗涤 和 中 草 药 提 取 等 各 个 领 域 ， 其 前景 十分广 阔 。长 期 以来 ， 缺失 高 产 菌 株 一 直 是制 约纤维 素酶 大规模 生 产 的 主要 因素 ， 因此 诱 变 筛选 高产纤 维 素 酶 菌 株 是 关 键 问题 之 一 ［ 。作 者 以青 ２ ］ 霉 （ ｅｉｉｌ ｍ ｓ ． ＨＫ ０ ３为原 始 菌 株 ，通 过 亚 Ｐ ｎｃｌ ｕ ｐ ） －０ ｉ
种进行 了连 续 ８次继代 培 养 ， 结果表 明其遗传 性状 稳定 。 关键词 ：青霉 ； 亚硝 基胍 ； 胺 ； 羟 复合 诱 变
中 图分 类号 ： ９ ０ ＴＱ ２ 文 献标 识码 １ Ａ
Ｓ ｒ ｅ ｎｇ ｏ ｕｔ ｎ ｒ ｉ ｔ ｉｈ Ｃｅ ｌ ｌ ｓ ｔｖｔ ｃ ｅ ｎｉ ｆＭ ａ ｔＳｔａｎｓｗｉｈ Ｈ ｇ ｌｕ ｏ ｅ Ａｃ 降解 生 成 葡 萄 糖 的一 组 酶的 总 称 。纤 维 寨 酶 根 据 酶 的 作 用 方 式 分 为 Ｃ １ 酶 、 Ｘ酶 和纤维 二 糖 酶 等类 型 ［ 。 目前 ， 维 素酶 Ｃ １ ］ 纤 的应用 已扩 展 到 医药 、 日用 化 工 、 纸 、 品发 酵 、 造 食
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复合诱变选育高产纤维素酶黑曲霉菌株冯培勇,张婷,王艳杰 (鲁东大学生命科学学院,山东烟台264025)摘要 [目的]选育高产纤维素酶生产菌。
[方法]以1株黑曲霉(A spe rg illu s n ige r F 1)为出发菌株,经过紫外线、亚硝基胍、硫酸二乙酯诱变处理,选育出1株纤维素酶高产菌株生产菌。
[结果]在适宜条件下,选育得到的菌株D 3产CM C 活力为出发菌株的145.5%。
[结论]N T G 、D E S 和紫外线作用机理不同,但都能对微生物细胞中的D N A 造成突变,使其具有新的特性。
关键词 纤维素酶;复合诱变;黑曲霉中图分类号 S182 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)36-15774-02S e le c tion o f th e H igh -y ie ld in g C e llu lo se -n ig e r S tra in FENG P e i-y on g e t a l (C o lle ge o f L ife S cien ce o f L u don g U n ive rs ity ,Y an ta i ,S h andon g 264025)A b s tra c t [O b jectiv e]T h e produ ction ba cte ria o f h igh -y ie ld in g ce llu lose w a s bred.[M e th od]T h e n ig e r (A sp erg illu s n ige r)F 1be i n g u sed a s s ta rtin g s tra in,th e produ ction bac te ria stra i n o f h igh -y ie ldin g ce ll u la se w a s se le cted a fte r its m u ta tiontrea tm en t o f U V,n itrosogu an idin e and D E S.[R esu lts]U n de r th e su itab le con d ition s ,t h e CM Cv ita lity o f D 3s tra inse lected cou ld be 45.5%h igh e r th anth a t o f sta r tin g s tra in.[C on clu s ion]T h e re w as d iffe ren t w o rk in g m e ch an ismam on g N T G,D E S an d u ltra v io le t ,bu t a ll o f th ose cou ld a ffect th e D N A m u ta tion o f m icrob ia l ce ll .K e y w o rd s C e llu la se ;C om pou n d m u ta tion ;N ig e r基金项目 鲁东大学校基金项目(20053305)。
作者简介 冯培勇(1977-),男,山东日照人,硕士,实验师,从事微生物产酶的研究工作。
收稿日期 2008-10-10纤维素是广泛存在于自然界中的一种由许多葡萄糖基组成的大分子物质,可被存在于微生物中的纤维素酶所降解。
纤维素酶指的是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称。
目前认为,完全降解纤维素至少需要3种功能不同但又互补的纤维素酶组分,即内切葡聚糖酶(简称C 1酶或E G)、外切葡聚糖酶(简称C x 酶或CBH )、β葡萄糖苷酶(简称βG )[1]。
纤维素酶的应用随着工业的发展而日趋广泛[2-3]。
由于野生型菌种的纤维素酶活力不高,因此,利用各种诱变手段选育高产纤维素酶生产菌一直是国内外研究的热点。
笔者通过紫外线、化学诱变剂N TG 、硫酸二乙酯对1株黑曲霉菌株进诱变,获得了纤维素酶活性显著提高且遗传性状稳定的突变株。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 出发菌株。
黑曲霉(A sperg ill us ni ger F 1),鲁东大学生命科学学院实验室分离保存。
1.1.2 培养基。
①斜面培养基(PDA 培养基):马铃薯200g ,葡萄糖20g ,琼脂15g ,水1000m l ,pH 值自然[4]。
②筛选培养基:KH 2PO 40.10%,(NH 4)2SO 4 1.00%,M g SO 4・7H 2O 0.025%,CM C -N a 1.00%,去氧胆酸钠0.25%,刚果红0.02%,琼脂2.00%,pH 值自然。
③发酵培养基:麸皮1.00g ,KH 2PO 42.00g ,(N H 4)2SO 41.40g ,M gSO 40.30g ,C aC l 20.34g ,F eSO 4・7H 2O5.00m g ,M nSO 4・H 2O 1.60m g ,ZnSO 4・7H 2O 1.40m g ,C oC l 22.00m g ,定容到1L,pH 值自然。
1.2 方法1.2.1 孢子悬液制备。
从新长成的斜面用pH 值7.0的磷酸缓冲液洗下孢子,以磁力搅拌器搅拌20m in ,打散孢子后显微镜计数,并调节孢子浓度至106个/m l [5]。
1.2.2 紫外线(U V )诱变。
取28℃培养5d 的F 1菌种斜面,按“1.2.1”制备孢子悬浮液。
打开紫外线灯(30W )预热20m in ,取8份5m l 的菌悬液置于离紫外线灯30c m (垂直距离)处的磁力搅拌器上照射1m in ,然后打开培养皿盖分别照射1、3、5、7、9、11、13、15m in 。
诱变菌液在黑暗中冷藏保存1～2h ,再接种于筛选培养基上,28℃培养4～5d 后,进行菌落计数并计算致死率。
致死率(%)=(对照菌落数-处理菌落数)/对照菌落数×100%。
1.2.3 亚硝基胍(N TG )诱变。
取28℃培养5d 的F 1菌种斜面,按“1.2.1”制备孢子悬浮液。
取孢子液10m l ,加入10m l N TG (4m g /m l),28℃恒温振荡处理5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60m in 后,适当稀释,涂布于筛选培养基平板,28℃培养4～5d 后,进行菌落计数并计算致死率。
1.2.4 硫酸二乙酯(DE S)诱变。
选取经N TG 诱变后酶活最高的突变株为出发菌株,按“1.2.1”制备孢子悬浮液。
取16m l pH 值7.0的磷酸缓冲液、4m l 孢子悬浮液、0.2m l DE S 原液充分混合(DE S 的终浓度为1%,体积比),28℃恒温分别振荡处理5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60m in 后,分别于1m l 处理液中加入0.5m l 25%N a 2S 2O 3溶液终止反应,适当稀释后,涂布于筛选培养基平板,28℃培养4～5d 后,进行菌落计数并计算致死率。
1.2.5 突变株的筛选。
选取纤维素水解圈与菌落直径之比大于1.5(H c >1.5)的菌落接种于斜面培养基上,培养4～5d 后接种到发酵培养基中,28℃培养120h 后测定酶活。
将每一轮诱变所筛选到的最高酶活突变株,作为下一轮诱变的出发菌株。
1.2.6 粗酶液制备。
取适量发酵液,5000r/m in 离心10m in ,上清液即为粗酶液。
1.2.7 CM C a se 酶活力的测定[6]。
以CM C 为底物测定。
取4支洗净烘干的具塞刻度试管,编号后各加入1.5m l 0.51%CM C 柠檬酸缓冲液,并向1号试管中加入1.5m l DN S 溶液以钝化酶活性,作为空白对照。
将4支试管同时在50℃水浴中预热5～10m in ,再各加入稀释5倍后的溶液0.5m l ,50℃水浴中保温30m in 后取出,立即向2、3、4号试管中各加入1.5m l DN S 溶液以终止酶反应,充分摇匀后沸水浴5m in ,取出冷却后用蒸馏水定容至20m l ,充分混匀。
在540nm 波长下测定2、3、4号试管液的光密度值并记录结果[7-8]。
根据3次重复光密度值的平均值,在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量,计算出CM C a se 酶活力(U /m l)。
在上述条件下,每分钟由底物生成安徽农业科学,Jo u rn a l o f A n h u i A g r i .S ci.2008,36(36):15774-15775 责任编辑 李菲菲 责任校对 傅真治1μg 葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活力单位(U )[9]。
2 结果与分析2.1 紫外线诱变致死率及突变株的筛选 以黑曲霉菌株F 1为出发菌株,经U V 诱变20～200s 后,涂布于筛选培养基,28℃培养4～5d ,计算菌落数。
孢子致死率与时间关系见图1。
处理200s 左右,孢子致死率接近100%。
选择在50%～90%致死率范围内,挑取H c >1.5的菌株10株,分别记为U 1～U 10,斜面培养后液体发酵,并测C x 酶活力。
结果得出U V 对黑曲霉的诱变效果为:F 1,100%;U 1,76.4%;U 2,110.5%;U 3,101.1%;U 4,79.9%;U 5,96.1%;U 6,114.7%;U 7,84.7%;U 8,93.6%;U 9,83.4%;U 10,93.4%。
由此可知,U V 诱变后,U 6菌株相对酶活最高,所以选U6菌株为下一轮诱变的出发菌株。
图1 UV 诱变致死率F ig.1 L e th a l ity ra te by UV m u ta g e n e s is2.2 NTG 诱变致死率及突变株的筛选 以U 6为出发菌株,经N TG 诱变5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60m in 后,涂布于筛选培养基,28℃培养4～5d ,计算菌落数。
孢子致死率与时间关系见图2。
处理50m in 左右,孢子致死率接近100%。
选择在50%～90%致死率范围内,挑取H c >1.5的菌株10株,记为N 1～N 10,斜面培养后液体发酵,并测C x 酶活力。
结果得出N TG 对黑曲霉的诱变效果为:F 1,100%;N 1,89.6%;N 2,120.4%;N 3,76.8%;N 4,89.9%;N 5,96.5%;N 6,122.8%;N 7,92.7%;N 8,103.9%;N 9,110.5%;N 10,99.7%。
由此可知,N TG 诱变后,N 6菌株相对酶活最高,所以选N6菌株为下一轮诱变的出发菌株。
图2 NTG 诱变致死率F ig.2 Le th a lity ra te b y NTG m u ta g e n e s is2.3 DE S 诱变致死率及突变株的筛选 以N 6为出发菌株,加DE S 处理,28℃恒温分别振荡处理5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60m in 后,适当稀释后,涂布于筛选培养基平板,28℃培养4～5d 后,进行菌落计数并计算致死率。