miR-155在低氧环境中对间充质干细胞免疫因子表达的调控及其机制研究要点
mir-155通过调控肾小管上皮细胞焦亡参与肾脏缺血再灌注损伤的机制研究
MiR-155 is Involved in Renal Ischemia- Reperfusion Injury via Regulating Renal Tubular Cell PyroptosisAbstractRenal ischemia-Reperfusion injury due to renal transplantation,liver transplantation and heminephrectomy is a major cause of acute kidney injury[1].During renal ischemia-Reperfusion injury,the death of renal tubular cell and subsequent inflammatory responses contribute the development and progression of this injury. Pyroptosis is a pro-inflammatory programmed cell death [2]. unlike apoptosis or necrosis,Pyroptosis is characterized by rapid plasma membrane rupture and the release of pro-inflammatory intracellular contents. Caspase-1 dependence is a definitive feature of pyroptosis.MicroRNAs are endogenous, small non-coding RNAs of approximately 19–22 nucleotides in length that is Involved in a wide range of biological processes[3].In our study, An in vivo rat model of renal IRI was established. For the in vitro study, the cultured human renal proximal tubular cell line HK-2 was subjected to 24 h of hypoxia (5% CO2, 1% O2, and 94% N2) followed by 12 h of reoxygenation (5% CO2, 21% O2, and 74% N2).We found that during IRI in renal tissue and HRI in HK2 cells the expression of MiR-155 was significantly up-regulated, while caspase-1, IL-1βand IL-18 were remarkly increased.Moreover over-expression of miR-155 resulted in increased levels of caspase-1, IL-1βand IL-18, whereas knockdown of miR-155 attenuated the inflammatory cell death of HK2 cells, indicating that anti-miR-155 could be a strategy for the prevention of renal pyroptosis.In further study,we found that miR-155 promoted renal tubularcell pyroptosis via down-regulating FoxO3a and its downstream protein ARC.More importantly, We performed a series of functional studies to determine the link between miR- 155 and FoxO3a,finding that FoxO3a is a direct target of miR-155.in Conclusions, Our study proposes a new signaling pathway of miR-155/FoxO3a/ARC leading to renal pyroptosis under ischemia/reperfusion injury conditions.Key words: Ischemic/reperfusion injury,Pyroptosis,MiR-155,FoxO3a,Kidney,Renal tubular cell符号及缩略词说明缩写词英文全称中文全称AKI Acr acute kidney injury, AKIAcrylamide急性肾损伤丙烯酰胺IRI ischemia-reperfusion injury 缺血再灌注损伤APS Ammonium persulfate 过硫酸铵MiR-155 Micro RNA-155 微小核糖核酸-155caspase-1 cDNA cysteinyl aspartate specific proteinase-1Complementary DNA含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1互补脱氧核糖核酸DAB Diaminobenzidine 二氨基联苯胺DNA Deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸EB Ethidium bromide 溴化乙锭IR Ischemia/reperfusion 缺血再灌注N.S. Not significant 无统计学差异NS Normal saline 生理盐水OD Optical density 吸光度PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酞胺凝胶电泳HE hematoxylin-eosin staining 苏木精—伊红染色法PBS Phosphate buffer saline 磷酸盐缓冲液PBST Phosphate Buffered Saline Tween-20 磷酸盐吐温缓冲液PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链反应pIpC Polyinosinic:polycytidylic ribonucleic acid 聚肌苷酸-聚胞苷酸PMN Polymorphonuclear 中性粒细胞PMSF PTGS Phenylmethyl Sulfonyl Fluoridepost transcriptional gene silencing苯甲基磺酰氟特异性的转录后基因沉默MAPK mitogen-activated protein kinase 丝裂原活化蛋白激酶ERK extracellular regulated protein kinases 细胞外调节蛋白激酶rpm Revolutions per minute 转每分钟SDS Sodium dodecyl sulfate 十二烷基磺酸钠TBE Tris-Boracic acid-EDTA 三氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸TBP TATA binding protein TATA 结合蛋白TBST Tris-Buffered Saline and Tween 20 三(羟甲基)氨基甲烷缓冲盐+吐温20TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediae 三(羟甲基)氨基甲烷TGS transcriptional gene silencing 转录水平的基因沉默WT Wild-type 野生型cAMP cyclic adenosine monophosphate 环磷酸腺苷酸MNCs mononuclear cells 单个核细胞DMSO FoxO3a Dimethyl sulfoxideForkhead box O3a二甲基亚砜叉头转录因子O3a目录MiR-155通过调控肾小管上皮细胞焦亡参与肾脏缺血再灌注损伤的机制研究 (I)摘要 (I)Abstract (IV)符号及缩略词说明 (VI)绪论 (1)实验材料 (4)1.1 主要仪器和器械 (4)1.2 实验动物 (5)1.3 实验细胞系 (5)1.4 实验药品 (5)实验方法 (8)2.1 Sprague-Dawley大鼠肾脏IR 模型制作 (8)2.2 HK2细胞的H/R处理 (8)2.3 肾组织与HK2细胞中MDA浓度测定 (9)2.4 肾组织与HK2细胞中SOD浓度测定 (10)2.5 免疫荧光染色 (12)2.6 酶联免疫吸附实验检测IL-1β、IL-18 (13)2.7 细胞活性检测 (14)2.8 血清肌酐（SCr）和尿素氮（BUN）检测 (15)2.9 HE染色检测大鼠肾脏缺血再灌注损伤组织学变化 (15)2.10 实时定量逆转录PCR (16)2.11 荧光素酶实验 (19)2.12Western-Blot检测Caspase-1，Caspase-11，FoxO3a，ARC等蛋白的表达 (20)实验结果 (23)3.1肾缺血再灌注损伤导致肾小管上皮细胞焦亡 (23)3.1.1 肾IRI损伤大鼠肾小管上皮细胞 (23)3.1.2 大鼠肾IRI中氧化应激反应与细胞焦亡 (24)3.1.3 H/R处理导致HK2细胞活力下降。
miR-155研究进展
miR-155研究进展李聪聪;赵金艳;吴姣;徐秋良【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2018(034)011【摘要】microRNAs(miRNAs)是进化上保守且广泛存在于真核生物中的一类非编码单链小RNA,大小约为19-25个核苷酸,主要通过抑制靶基因的表达或翻译来发挥转录后调控作用.miR-155是microRNAs家族中的重要成员,由于其具有多功能的特点而颇受关注,人们对其开展了广泛而又深刻的研究.大量研究结果表明miR-155的功能广泛,它参与机体造血细胞的发育分化、免疫细胞的发育分化、炎症反应、免疫应答、肌肉发育以及脂肪分化等许多生物过程,并在肝癌、淋巴癌、乳腺癌、胰腺癌和肺癌等多种癌组织或细胞株中呈现高表达,与肿瘤的发生、侵袭和转移密切相关,而且,随着研究的不断深入,miR-155极有可能成为一个新的肿瘤标志物以及肿瘤基因治疗的新靶点.miR-155在各种生命过程中扮演着无可替代的角色,并在相关信号通路的调节中发挥着不可或缺的作用,是个典型的重要的多功能miRNA.就miR-155的主要特点以及相关功能研究进展予以综述,旨在讨论miR-155在机体生命活动中发挥的重要作用,为多种疾病的治疗提供新思路和新方法.【总页数】13页(P70-82)【作者】李聪聪;赵金艳;吴姣;徐秋良【作者单位】河南牧业经济学院动物科技学院河南省畜禽遗传资源保护工程技术研究中心,郑州450046;河南牧业经济学院动物科技学院河南省畜禽遗传资源保护工程技术研究中心,郑州450046;河南牧业经济学院动物科技学院河南省畜禽遗传资源保护工程技术研究中心,郑州450046;河南牧业经济学院动物科技学院河南省畜禽遗传资源保护工程技术研究中心,郑州450046【正文语种】中文【相关文献】1.miR-155调控T细胞分化与功能的研究进展 [J], 陈倩云;范恒2.miR-155在2型糖尿病中的研究进展 [J], 李洁;侯祺敏3.MiR-155与颌骨代谢研究进展 [J], 赵志芳;邓润智4.miR-155在口腔鳞状细胞癌发生中作用及机制研究进展 [J], 黄丽环; 江颖彤; 欧阳可雄; 吴丽红; 杨雪超5.miR-155在炎症性肠病中的免疫作用机制研究进展 [J], 朱凤;范恒;刘星星因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
miR-155真核表达载体的构建及其在胰腺癌中功能的初步研究的开题报告
miR-155真核表达载体的构建及其在胰腺癌中功能
的初步研究的开题报告
一、研究背景和意义
胰腺癌是一种高度恶性的消化系统恶性肿瘤，由于其早期症状不明显，大多数患者在发现时已经处于晚期，预后极差。
miR-155是一种广泛表达于许多细胞类型中的小分子RNA，已经证实在许多肿瘤的发生和进展中发挥着重要作用。
然而，在胰腺癌中miR-155的表达和作用尚未得到充分阐明。
因此，本研究旨在构建miR-155真核表达载体，并研究miR-155在胰腺癌中的功能，从而为深入研究胰腺癌的发生和治疗提供理论基础和实验依据。
二、研究内容和方法
本研究计划使用化学方法合成miR-155的DNA序列，并将其插入真核表达载体pCDNA3.1中，构建miR-155真核表达载体。
然后，将miR-155真核表达载体转染入胰腺癌细胞株中，利用qPCR方法检测miR-155的表达水平。
接下来，评估miR-155的功能，包括细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化，通过Western blot的检测miR-155可能调控的靶蛋白的表达。
三、研究预期结果和意义
本研究意义在于构建miR-155真核表达载体，并验证miR-155在胰腺癌中的作用，从而深入研究胰腺癌的发生和治疗提供理论基础和实验依据，为开发治疗胰腺癌的新策略奠定基础。
预期结果为，成功构建miR-155真核表达载体，并转染至胰腺癌细胞中，能够显著抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力并调节靶蛋白的表达。
在深入探究miR-155在胰腺癌中的功能、调控机制及作用靶标的基础上，为胰腺癌的预防和治疗寻求新的途径，提高胰腺癌患者的生存率和生活质量。
miRNA-155在系统性硬化病中作用的研究进展
miRNA-155在系统性硬化病中作用的研究进展miRNA-155是一种非编码RNA分子，在免疫调节和炎症反应中发挥重要作用。
近年来，研究表明miRNA-155在系统性硬化病（systemic sclerosis，SSc）的发病机制中发挥重要作用。
本文主要综述miRNA-155在SSc中的作用及其研究进展。
miRNA-155在SSc中的作用主要表现为对肉芽肿形成和免疫系统的调节。
miRNA-155通过抑制靶基因还原型蛋白1（receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1，RIP1）的表达，抑制了NF-κB信号通路的激活，从而减少了炎症反应和肉芽肿的形成。
miRNA-155还通过抑制表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的表达，发挥抗炎和抗纤维化的作用。
miRNA-155还通过调节免疫细胞的活化和调节T细胞亚群平衡来影响SSc的发病机制。
研究发现，miRNA-155能够调节树突状细胞的活化和蛋白质表达，从而调控免疫细胞的功能和炎症反应。
miRNA-155还能够调节CD4+T细胞和CD8+T细胞的分化和功能，影响T细胞亚群的平衡，从而对SSc的病理过程产生影响。
最近的研究还发现，在SSc中，miRNA-155可能通过调节转录因子Fli-1的表达来影响病理过程。
miRNA-155能够直接靶向Fli-1基因，降低其表达水平，从而调节SSc中的炎症反应和纤维化过程。
miRNA-155在SSc的发病机制中发挥重要作用。
miRNA-155通过调节多种靶基因的表达，参与免疫调节、炎症反应和纤维化过程，从而影响SSc的病理过程。
对miRNA-155在SSc中的研究不仅有助于进一步揭示SSc的发病机制，还为SSc的诊断和治疗提供了新的靶点。
目前对miRNA-155在SSc中的作用机制和具体调控途径仍需进一步研究，以期为SSc的治疗和预防提供更有效的策略。
miR-155在骨髓间充质干细胞成骨分化中的调控作用
miR-155在骨髓间充质干细胞成骨分化中的调控作用杨晓庆;苏健【摘要】目的探讨miR-155对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨分化能力的影响.方法从C57/BL6J小鼠骨髓中分离BMSCs,BMSCs按照2×105个/mL的浓度接种,过夜贴壁后进行转染,通过miR-155模拟剂及miR-155抑制剂改变miR-155在BMSCs中的表达,同时设立miRNA模拟剂的同型对照和miRNA抑制剂的同型对照.采用qRT-PCR检测不同处理后BMSCs中骨标志基因RUNX2、骨钙蛋白(OCN)、骨桥蛋白和Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)的表达;通过碱性磷酸酶(ALP)染色和ALP活性分析观察ALP的表达和酶活性;通过茜素红染色检测细胞外钙盐结节的形成.结果地塞米松使miR-155在BMSCs中的表达上调(13.56±0.45)倍(P＜0.01),miR-155在BMSCs向成骨细胞诱导第4天时表达显著下调(P＜0.01).转染miR-155模拟剂的BMSCs成骨诱导第12天时RUNX2、OCN和Col-Ⅰ的表达明显低于其同型对照(P＜0.01),ALP活性明显低于其同型对照(P＜0.01),ALP染色和茜素红染色的阳性细胞数也明显少于其同型对照.转染miR-155抑制剂的BMSCs成骨诱导第12天时RUNX2、OCN和Col-Ⅰ的表达明显高于其同型对照(P＜ 0.05或P＜0.01),ALP活性明显高于其同型对照,ALP染色和茜素红染色的阳性细胞数也明显多于其同型对照.结论转染miR-155模拟剂能够明显抑制BMSCs向成骨细胞分化,转染miR-155抑制剂则能够明显促进BMSCs分化为成骨细胞.miR-155作为成骨分化的负性调节分子可能成为骨质疏松症等成骨分化异常相关疾病的有效干预靶点.【期刊名称】《中国医药导报》【年(卷),期】2015(012)033【总页数】6页(P38-42,封4)【关键词】地塞米松;骨髓间充质干细胞;成骨分化;miR-155;骨质疏松症【作者】杨晓庆;苏健【作者单位】北京市医疗器械检验所,北京 100700;北京市医疗器械检验所,北京100700【正文语种】中文【中图分类】R68骨质疏松症是一种以骨量减少、骨微结构破坏、骨脆性增加和易骨折为特征的全身代谢性骨病。
miR-155调控HGAL的表达和增加淋巴瘤细胞的运动
• miRNA：小的非编码RNA，在转录后调控基因表达参与 调控多种的生命活动。他们参与免疫系统的调控可能对淋 巴细胞引起的恶性肿瘤的发病有作用。
方法
• • • • • • 寻找miRNA靶基因和结合位点 RNA分离和miRNA定量PCR( real-time PCR) DNA构建 荧光素酶报告实验 趋化实验 RhoA pull-down assay
miR-155同时调控了HGAL和RTKN2,他们又同时参 与了RhoA通路和细胞运动
结果
miRNA155抑制HGAL的表达：mRNA水平的检测
B.Raji细胞系中转染 高表达hsa-miR-155 通过real-time PCR 在转染24, 48, 和 72小时后检测HGAL mRNA水平。
从图中可以看出，在转染hsa-miR-155 72小时后HGAL mRNA的降低水平大到最大
结果
miR-155对F-actin的聚合的作用
图4。bic / miR-155 - / -小鼠脾B细胞 趋化性实验。bic / miR-155 - / -或对 照组小鼠脾B细胞用于SDF-1和IL-6
的趋化实验。从图中可以看出，
miR-155并没有增加小鼠 脾B细胞的运动性，这与体 外培养的人属淋巴瘤细胞 的结果是相反了，说明了 在鼠科中，miR-155及M17 （HGAL人属）的作用机制 还有待进步一步的研究。
低氧对再生医学中间充质干细胞培养的研究进展
低氧环境可以改善干细胞的移 植效果，提高治疗效果
03
低氧在再生医学中的应 用
低氧在组织工程中的应用
低氧环境可以促进干细胞的增殖和分化 低氧环境可以增强干细胞的抗炎和免疫调节能力 低氧环境可以促进干细胞的迁移和血管生成 低氧环境可以促进干细胞的存活和功能恢复
低氧在细胞治疗中的应用
低氧环境可以促进干细胞的增殖和分化 低氧可以增强干细胞的抗炎和免疫调节作用 低氧可以改善干细胞的存活率和功能 低氧可以促进干细胞的迁移和归巢能力
01 添加章节标题
02
低氧对中间充质干细胞 的影响
低氧对干细胞增殖的影响
低氧环境可以促进干细胞增殖
低氧可以激活干细胞的自我更 新和增殖
低氧可以诱导干细胞向特定方 向分化
低氧可以增强干细胞的抗凋亡 能力
低氧对干细胞分化的影响
低氧环境可以促进干细胞的分化 低氧可以诱导干细胞向特定方向分化 低氧可以增强干细胞的再生能力 低氧可以调节干细胞的基因表达，影响其分化过程
低氧环境模拟：通过控制氧气浓度， 模拟人体组织缺氧状态
细胞培养：在低氧环境下培养间充 质干细胞，观察其生物学特性和功 能
添加标题题
疾病模型构建：利用低氧环境，构 建各种疾病模型，如缺血性心脏病、 脑卒中等
药物筛选：利用低氧疾病模型，进 行药物筛选和评价，寻找有效的治 疗方法
04
调节、组织修复等
干细胞的来源与分化调控
干细胞来源： 骨髓、脐带 血、脂肪等
干细胞分化 调控：基因 表达、信号 通路、细胞 因子等
低氧对干细 胞分化的影 响：促进或 抑制干细胞 分化
低氧对干细 胞培养的挑 战：细胞存 活率、细胞 分化效率等
低氧对干细 胞培养的前 景：提高干 细胞分化效 率、改善细 胞功能等
miRNA-155在系统性硬化病中作用的研究进展
miRNA-155在系统性硬化病中作用的研究进展miRNA-155的表达与SSc的发病机制密切相关。
研究表明，在SSc患者的皮肤和血液中，miRNA-155的表达水平明显升高。
miRNA-155还参与了皮肤纤维化、血管异常和免疫反应等多个方面的病理过程。
miRNA-155被认为是SSc的潜在治疗靶点。
下面将结合具体的研究进展就miRNA-155的作用机制和治疗应用进行详细介绍。
miRNA-155在系统性硬化病的病理生理过程中起到了重要作用。
研究发现，miRNA-155通过调节多个靶基因的表达，参与了免疫细胞的激活和炎症反应的调控。
miRNA-155可以促进T细胞和B细胞的活化，并抑制调节性T细胞的功能，从而加剧免疫异常引起的病理过程。
miRNA-155还参与了成纤维细胞的活化和纤维化途径的调节，导致组织纤维化的发生。
miRNA-155在SSc的病理生理过程中扮演着重要的角色。
针对miRNA-155在SSc中的重要作用，研究者开始探索miRNA-155的治疗应用。
目前，针对miRNA-155的治疗策略主要包括两个方面：一是通过调节miRNA-155的表达水平来干预其生物学功能；二是设计miRNA-155的拮抗剂来阻断其对靶基因的调控作用。
在动物模型中的研究表明，以上两种策略均能够显著改善SSc的病理表现，为miRNA-155的临床治疗提供了一定的依据。
还有研究发现，miRNA-155的表达水平与SSc的临床特征和预后密切相关，因此miRNA-155也有望成为SSc的诊断和预后评估的生物标志物。
目前对miRNA-155在SSc中的研究还处于初步阶段，仍面临着许多挑战。
miRNA-155的靶基因和调控网络尚未完全阐明，其生物学功能有待进一步探索。
miRNA-155在不同亚型的SSc中可能发挥不同的作用，因此需要进一步开展临床分型研究。
miRNA-155的治疗策略尚未经过临床试验的验证，其安全性和有效性有待进一步评估。
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７３００５０，Ｃｈｉｎａ
Ｃｈｉｎｅｓｅ ＰＬＡ／Ｌａｎｚｈｏｕ
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０２５３－２７２７．２０１６．０８．００８ 作者单位：７３００５０兰州军区兰州总医院血液科 通信作者：白海，Ｅｍａｉｌ：ｂａｉｈａｉ９８＠ｔｏｍ．ｔｏｍ
万方数据
生堡血邃堂塞圭２Ｑ！§生８旦箜３１鲞筮Ｓ期￡丛！』珏！坐！！！！：△！艇丛２Ｑ！§，ｙＱ！：３１，丛Ｑ：８ ［（５．６９０士１．６５５）ＶＳ（０．８４１士０．１９４），Ｐ＜０．０１；（６．９８２士１．３５３）ＶＳ（０．６３２１０．１８４），Ｐ＜Ｏ．０１］．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｒｅ ｎｏ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｏｆ ＳＤＦ—ｌａ ａｎｄ ＴＧＦ—Ｂ【（２４．６０９ ４－２．５８４）ＶＳ（２５．３５９４－２．４５５），Ｐ＝－０．７６０；
度均为４０ ｎｍｏｌ／Ｌ的ｍｉＲ一１５５ ｍｉｍｉｃ及ＮＣ各５“ｌ，室
２．主要试剂：ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基、ＦＢＳ及胰蛋 白酶购自美国Ｇｉｂｃｏ公司；ｈａｓ．ｍｉＲ－１５５模拟物 （ｍｉｍｉｃ）及相应的阴性对照（ＮＣ）均由上海吉玛制药 技术有限公司合成；ＰＣＲ引物由生工生物工程（上 海）股份有限公司合成；ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００转染 试剂、ｏｐｔｉ．ＭＥＭ培养基及ＴＲＩｚｏｌ ＲＮＡ提取试剂盒 均购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；荧光染料（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）实时定量ＰＣＲ（ＲＱ—ＰＣＲ）试剂盒购自日本 ＴＡＫＡＲＡ生物公司；水合氯化钴（ＣｏＣＩ：・６Ｈ：Ｏ）及脂 多糖（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ＬＰＳ）均购于美国Ｓｉｇｍａ 公司；ＲＩＰＡ裂解液购于北京普利莱基因技术有限公 司；抗鼠ＨＩＦ—ｌａ多克隆抗体及细胞表面抗原均购于 美国ＢＤ公司；抗鼠ＮＯＳ２购于美国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公 司；抗鼠１３一ａｃｔｉｎ购于北京中杉金桥生物技术有限公
司；ＩＬ一６、ＩＬ．８、ＴＧＦ一６ ＥＬＩＳＡ试剂盒购于上海依科 赛生物制品有限公司；ＳＤＦ一１ ０【ＥＬＩＳＡ试剂盒购于英
温孵育５ ｍｉｎ后，分别将上述两种混合液混匀，室温 孵育２０ ｍｉｎ。将孵育好的转染试剂加入培养孑Ｌ中 （每孔５００ ｕ１），５ ｈ后更换成原培养基。３６ ｈ后分别 更换新的培养基和（或）含２００
【关键词】间质干细胞；
细胞低氧；微ＲＮＡｓ；一氧化氮合酶；乏氧诱导因子ｌⅡ
基金项目：甘肃省科技重大专项（１ １０２ＦＫＤＡ５ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ
ｏｎ
ｉｍｍｕｎｅ－ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｉｌｓ ｕｎｄｅｒ ｈｙｐｏｘｉｃ
Ｍｉｌｉｔａｒｙ
Ａｒｅａ
Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｌａｎｚｈｏｕ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒｊ Ｂａｉ ＨａＬ Ｅｍａｉｌ：ｂａｉｈａｉ９８＠ｔｏｍ．ｃｏｍ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ
Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆｍｉＲ—１５５
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虫垡血速堂苤盍２Ｑ！§生８月箜３２鲞笙８期￡丛！』Ｈ！盟ａ！！！：△！耻坠２Ｑ！鱼：ｙ！！：３２：№：８
・６７１．
・论著・
ｍｉＲ一１ ５５在低氧环境中对问充质干细胞
免疫因子表达的调控及其机制研究
韩潇 白海尹娇娇杨柯韩燕霞 欧剑锋王存邦
吴涛 【摘要】
目的探讨ｍｉＲ一１５５在低氧条件下对间充质干细胞（Ｍｓｃ）免疫因子表达的调控以及作
途径。 对象与方法
３．细胞制备及培养鉴定：参照文献［８］方法，利 用脐带进行间充质干细胞的分离与培养。收获第３ 代细胞，ＰＢＳ洗涤后制成细胞密度为ｌ×１０６／ｍｌ的单 细胞悬液，分别加入ＣＤ２９一ＰＥ、ＣＤ７３一ＰＥ、ＣＤ９０一ＰＥ、 ＣＤｌ０５一ＰＥ、ＣＤ３１－ＰＥ、ＣＤ４５一ＰｅｒＣＰ荧光标记的单克 隆抗体各５“ｌ，室温孵育３０ ｍｉｎ，上流式细胞仪进行 检测，采用Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ软件分析。每个样本至少分析
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｉｃａｌ
Ｐｒｏｊｅｃｔ
ｏｆ Ｇａｎｓｕ ｉｎ Ｃｈｉｎａ（１ １ ０２ＦＫＤＡ００５）
体外培养的间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＭＳＣ）具有修复受损组织和调节免疫的潜能， 现已广泛应用于临床再生医学领域ｎ１。低氧培养条 件可为众多干细胞提供生长优势，能有效阻止干细 胞提前衰老且保持未分化状态乜’４１。这些干细胞在 体内定居于被称作“干细胞壁龛”的局部微环境中， 其氧含量相对较低（约１％～９％Ｏ：）ｂ１。同时，成熟的 ｍｉＲ一１５５通过降解信使ＲＮＡ从而调控靶基因的表 达在ＭＳＣ的增殖及其免疫调节的调控中发挥着重 要作用哺。１。本研究中我们通过转染ｍｉＲ一１５５于 ＭＳＣ中以提高其表达量，从而研究ｍｉＲ－１５５在低氧 环境中对ＭＳＣ免疫作用的影响以及可能的调节
用机制。方法通过ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００转染试剂将ｍｉＲ．１５５模拟物转染至ＭＳＣ中，构建ｍｉＲ．１５５ 高表达的ＭＳＣ细胞。在水合氯化钴（ＣｏＣｌ：・６Ｈ：Ｏ）模拟的化学低氧环境中，用脂多糖（ＬＰＳ）刺激ＭＳＣ 的免疫作用，采用实时荧光定量ＰＣＲ方法鉴定其转染效果，并检测ＩＬ．６、ＩＬ．８、诱导型一氧化氮合酶 （ｉＮＯＳ）、ＴＧＦ．１３、低氧诱导因子ｌａ（ＨＩＦ．１ａ）ｍＲＮＡ的表达。用流式细胞术检测细胞表面抗原，ＥＬＩＳＡ 法检测上清中ＩＬ一６、ＩＬ一８、ＴＧＦ．Ｄ及ＳＤＦ—ｌａ的表达水平，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法检测ｉＮＯＳ、ＨＩＦ．１ａ蛋白的表达。 结果较阴性对照组，ｍｉＲ．１５５转染组的ＩＬ一６、ＩＬ一８表达上调（２４．２０１士１．５３６对１．８０２＋０．０５８，Ｐ＜０．０１； ２４．４０６士４．６１１对７．４０７士１．５５３，Ｐ＜０．０１），ｉＮＯＳｍＲＮＡ表达下调（０．１５１＋０．０３５对３２．９２５士１．６３２，Ｐ＜０．０１）。 同时，ＨＩＦ—ｌａ在低氧环境下高表达（４５．０９３士３．３７１对２．２１０土０．４９８，Ｐ＜０．叭），且低氧ｍｉＲ－１５５转染组较低 氧对照组上调更为显著（１０２．９６５１４．４４９对４５．０９３士３．３７１，Ｐ＜０．０１）。低氧ｍｉＲ．１５５转染组ＩＬ一６、ＩＬ一８上调 较ｍｉＲ．１５５转染组更加显著（６５．６７０士１０．６１３对２４．２０１士１．５３６，Ｐ＜０．０ｌ；３５．５３７士２．２８５对２４．４０６士４．６１１．Ｐ＜ ０．０１）；ｍｉＲ－１５５下调ｉＮＯＳ表达（０．２３５士０．００３对０．６１２士０．０４３，Ｐ＜０．０１），低氧条件下更为显著（０．０８７士 ０．００２对０．２３５１０．００３，Ｐ＜０．０１）。低ｍｉＲ．１５５组ＳＤＦ—ｌｅｔ、ＴＧＦ．１３ ｍＲＮＡ表达均上调（５．６９０土１．６５５对 ０．８４１士０．１９４，Ｐ＜Ｏ．０ｌ；６．９８２１１．３５３对０．６３２士０．１８４，Ｐ＜０．０１），上清中细胞因子ＳＤＦ．１ｕ表达水平为 ２４．６０９士２．５８４对２５．３５９士２．４５５（／＇＝－０．７６０）；、ＴＧＦ一１３表达水平为０．５６８士０．０１９对０．３４５士０．０３７（Ｐ＝０．００２）。结 论低氧条件下，通过上调ＨＩＦ—ｌｅｔ的表达，从而下调ｉＮＯＳ基因及蛋白，由此促进ｍｉＲ．１５５正向调控 ＭＳＣ免疫因子的表达。
６孔板。２４ ｈ后弃去原培养基，用２５０ ｕｌ无血清ｏｐｔｉ—
１．研究对象：以我院产科连续７例足月顺产健
康新生儿脐带标本为研究对象，材料的获得经我院
伦理委员会批准且均获产妇知情同意并签署知情
同意书。
ＭＥＭ培养基稀释５
ｕｌ
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ…２０００两份；同
时，分别用２５０ ｕｌ无血清ｏｐｔｉ—ＭＥＭ培养基稀释终浓
ｗａｓ
Ｈｙｐｏｘｉａ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｍａｙ ｐｒｏｍｏｔｅ ｍｉＲ一１５５ ｔｏ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ＭＳＣ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＩＦ一】ｃｃ．ｗｈｉｃｈ ｄｏｗｎ— ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉＮＯＳ ｐｒｏｔｅｉｎ．
ｏｎ
１．５５３），Ｐ＜０．０ｌ ｊ ａｎｄ ｉＮＯＳ ｗａｓ ｍａｒｋｅｄｌｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ［（０．１５ｌ士０．０３５）ｖｓ（３２．９２５ ４－１．６３２），Ｐ＜０．０１］．
Ｈｙｐｏｘｉａ ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆＨＩＦ－ｌａ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ・１５５．ＭｉＲ一１５５ ａｎｄ ｈｙｐｏｘｉａ ｈａｄ ｅｆｆｅｃｔ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳＤＦ．１ ０【ａｎｄ ＴＧＦ．Ｂ
ＩＬ－８，ＴＧＦ—ｐ，ＳＤＦ・ｌａ）ｗｅｒｅ
ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ（５３．４４７士８．３６１
ｖｓ
ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ
ＥＬＩＳＡ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｍｉｌ０ １ ５５ ｗａｓ
Ｂｌｏｔ ｗａｓ
ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｉＮＯＳ
１０
０００个细胞。
４．转染及干预：实验分为五组：设①空白对照 组：未做任何处理的ＭＳＣ；②阴性对照组：转染ＮＣ 至ＭＳＣ中并加入ＬＰＳ；（爹ｍｉＲ．１５５组：转染ｍｉＲ．１５５ ｍｉｍｉｃ至ＭＳＣ中并加人ＬＰＳ；④低氧对照组：转染 ＮＣ至ＭＳＣ中并加入含ＣｏＣｌ：・６Ｈ：Ｏ的培养基和 ＬＰＳ；⑤低氧ｍｉＲ一１５５组：转染ｍｉＲ一１５５ ｍｉｍｉｃ至 ＭＳＣ中并加入ＣｏＣｌ：・６Ｈ：Ｏ的培养基和ＬＰＳ。取第 ３代对数生长期的ＭＳＣ，以每孔２ｘ １０６个细胞接种于