2.3素的微生物的分离
微生物的分离纯化方法
微生物的分离纯化方法微生物的分离纯化方法是微生物学研究的重要内容之一，旨在从混合的微生物群落中分离出单一种类的纯培养菌株。
微生物的纯化有助于研究其生物学特性、代谢途径以及应用领域等方面的深入研究。
下面将介绍常用的微生物分离纯化方法。
1. 单菌分离：是最常见的微生物分离方法之一。
通常使用传统方法（如分离培养基、落菌法、抗生素筛选等）以及现代分子生物学的技术手段（如16S rRNA 测序、荧光原位杂交等）对微生物进行筛选和分离，获得纯培养菌株。
2. 稀释平板法：是一种简单易行的微生物分离方法。
将待分离样品适当稀释后均匀涂布于富含适宜生长因子的平板培养基上，使微生物在固体培养基上形成单个菌落，然后用针头或者扩展环等工具将单个菌落接种于新的培养基上，形成纯培养单菌。
3. 滤膜方法：利用0.2μm以上的滤膜可以有效地将微生物和大颗粒物质分离开。
将待分离样品过滤，将滤膜放置于富含适宜生长因子的培养基上进行培养，从而获得纯菌落。
4. 凝胶去除法：主要针对混合微生物群落中细菌和其他微生物细胞凝胶的去除。
通过化学或物理方法（如酶解、超声波、渗透压等）将细胞凝胶分离离去，然后进行接种和培养，实现单菌分离纯化。
5. 选择性培养基法：利用特定的培养基，添加一定浓度的抗生素、染色剂或其他抑制物质限制其他微生物的生长，从而提高目标菌株的生长优势，实现单一种类的微生物分离纯化。
6. 微量稀释法：根据微生物的生长特性，将待分离样品进行多次连续稀释，然后分别在富含适宜生长因子的培养基上进行培养。
微生物的最高稀释度对应最大的菌落数目，可以通过对菌落的观察和计数，筛选到目标微生物。
7. 生物免疫法：利用微生物本身的免疫特性，通过制备抗体或其他免疫试剂对微生物进行分离纯化。
通过配对抗体和堆积生物试剂，将目标微生物从混合菌种中选择性地分离出来。
8. 流式细胞技术：是一种现代化的微生物分离纯化方法。
将待分离样品进行特定染色或标记，然后通过流式细胞仪对样品进行分析和排序，从而分离出目标微生物，实现单一种类微生物的分离纯化。
微生物分离鉴定步骤
微生物分离鉴定步骤
微生物的分离和鉴定是微生物学研究中非常重要的步骤，它可
以帮助我们了解微生物的种类和特性。
通常，微生物的分离和鉴定
包括以下步骤：
1. 样品收集，首先需要收集来自环境、生物体表面或其他来源
的微生物样品。
这可能涉及到采集土壤、水样、食品、空气或生物
体组织等样品。
2. 稀释和接种，将样品进行适当的稀释，然后在培养基上进行
接种。
这有助于分离出单一的微生物菌落，以便进行后续的鉴定。
3. 培养，接种后，将培养皿放入恒温培养箱中进行培养。
不同
类型的微生物可能需要不同类型的培养条件，如温度、氧气含量等。
4. 分离，在培养一段时间后，可以观察到菌落的形成。
选择单
一的菌落，进行分离培养，以获得纯培养物。
5. 形态学特征观察，观察微生物的形态学特征，包括细胞形态、大小、颜色等，可以初步了解微生物的特征。
6. 生理生化特性测试，进行一系列生理生化特性测试，如对不同营养物质的利用、酶活性、氧气需求等，以进一步了解微生物的特性。
7. 分子生物学鉴定，利用分子生物学方法，如16S rRNA序列分析，可以对微生物进行更精确的鉴定，包括确定其属种和种的分类位置。
以上是常规的微生物分离和鉴定步骤，通过这些步骤可以全面地了解微生物的特征和分类位置。
值得注意的是，不同的微生物可能需要不同的鉴定方法，有时可能需要结合多种手段进行鉴定，以确保鉴定结果的准确性。
2.3土壤中纤维素分解菌的分离
课题3 分解纤维素的微生物 的分离
一、基础知识
（一） 纤维素与纤维素酶 1.纤维素在生物圈的分布
纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质. 植物的根茎叶等器官都含有大量的维生素.地球 上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨.
人类以淀粉为主要能量来源，但完全不能消 化纤维素，而反刍动物和大量的微生物则主要以 纤维素为能量来源。这是因为，在反刍动物的瘤 胃中生活着大量的可以分解纤维素的微生物。
3.将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸 应该埋进土壤多深？
答：将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相 对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存 的适宜环境。一般应将纸埋于深约10 cm左右 腐殖土壤中。
4.想一想，两种刚果红染色法各有哪些 优点与不足？你打算选用哪一种方法？
方法一是传统的方法，缺点是操作繁 琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生 混杂；其优点是这样显示出的颜色反应 基本上是纤维素分解菌的作用。
(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自 培养基中的 化合物A ，实验需要振荡培养， 由此推测“目的菌”的代谢类型 是 异养需氧 。
例1(20分)某化工厂的污水池 中，含有一种有害的、难于降 解的有机化合物A。研究人员 用化合物A、磷酸盐、镁盐以 及微量元素配制的培养基，成 功地筛选到能高效降解化合物 A的细菌(目的菌)。实验的主 要步骤如图所示。请分析回答 问题：（北京卷）
（二）分离的结果是否一致： 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌 和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是 细菌。但由于所取土样的环境不同，学生也 可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。
P30课题延伸：纤维素酶的测定方法
一般是采用对纤维素酶分解 滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖 进行定量的测定
2.3分解纤维素的微生物的分离
富集培养→纯种分离→性能测定。
（1）不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是
从适合的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。培养
嗜盐菌的菌样应从 海滩等高盐 环境采集。
（2）富集培养指创设仅适合待分离微生物旺盛生长的特定环境
条件，使其群落中的数量大大增加，从而分离出所需微生物的培
养方法。对产耐高温淀粉酶微生物的富集培养应选择以淀粉为 的
3、操N作aC：l溶液作用：刚漂果洗红作，用以—免—出洗现去的与透纤明维圈素不结够合清不晰牢。的 方法1：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应。 方法2：在倒平板时就加入刚果红。
染色法
优点
缺点
这两种方法各有哪些优点与不足？
颜色反应基本 操作繁琐。
方法1 上是纤维素分 刚果红会使菌落之间发生
(后置染色法） 解菌的作用 混杂。
发酵产纤维素酶实验 液体发酵 固体发酵
2、纤维素酶的测定方法:
对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的 葡萄糖含量进行定量测定。
课堂小结
分解 纤维 素的 微生 物的 分离
纤维素酶 种类、作用、催化活力
筛选原理 刚果红染色
前置染色法 后置染色法
实 土壤取样 验 选择培养 设 计 纯化培养
富含纤维素土壤 增大分解菌含量 染色鉴别
为什么？
微生物大量繁殖
为什么选择培养能够“浓缩” 所需的微生物？
在选择培养的条件下，可以使那些能够 适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖， 而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖 被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。
注意：该步骤也可省略，但纤维素分解菌较少。
3.梯度稀释
按照课题1的稀释操作方法，将选择培养 后的培养基进行等比稀释101～107倍。
微生物菌种的分离和纯化方法
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。
1、用固体培养基分离和纯化单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。
当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。
不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。
大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。
所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。
这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。
固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。
最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。
这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。
1.1 稀释倒平板法首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。
如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。
随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。
1.2 涂布平板法因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
微生物细菌分离培养实验报告
微生物细菌分离培养实验报告土壤微生物的分离培养技术实验报告重庆大学研究生专业实验教学实验报告书实验课程名称:实验指导教师:学院: 专业及类别: 学号: 姓名: 实验日期: 成绩:重庆大学研究生院制一、实验目的1、了解分离与纯化微生物的基本原理及方法;2、了解倒平板配制土豆培养基的方法与平板划线分离的基本操作技术;;3、学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能;4、初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。
二、实验原理1、培养基的种类培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代谢产物。
一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。
培养基的种类很多，根据培养成分的不同可分为天然培养基、合成培养基与半合成培养基;根据物理状态的不同又可分为液体培养基和固体培养基。
微生物的分离、纯化、记数等方面的研究常常使用的就是固体培养基。
本实验就是使用的固体培养基。
已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。
培养基的原材料来源十分广泛，本实验采用的原材料为土豆。
2、接种方法与无菌接种将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。
接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。
接种的关键是要严格的进行无菌操作。
微生物的接种方法很多，划线接种、三点接种、穿刺接种、混浇接种与涂布接种是几种常用的接种方法。
划线接种是最常用的接种方法，即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可以达到接种的目的。
常用的接种工具为接种环、针等。
在斜面接种和平板划线中就常用此法。
三点接种是把少量的微生物接种在平板表面，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察研究它们的形态。
研究霉菌形态时就常用此法。
2023人教版选修一课题3《分解纤维素的微生物的分离》ppt
目标:
1、知道纤维素酶的种类及作用 2、初步掌握从土壤中分离出分解纤维 素的微生物的实验方法
一、基础知识
㈠纤维素与纤维素酶 1.纤维素
纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高 分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。
植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤 维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高 的天然产物。
水
A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？
是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）
B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有， 是如何进行选择的？
有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能 分解纤维素的微生物可以大量繁殖。
C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用
提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择 培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤 维素改为葡萄糖。
五、课题延伸
为了确定分离得到的是纤维素分解菌， 还需要进行发__酵__产__纤__维__素__酶_实验，纤维素酶的 发酵方法有__液__体__ 发酵和_固__体___ 发酵。纤 维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤 维素所产生的_葡__萄__糖___ 含量进行定量测定。
课堂总结
分解 纤维 素的 微生 物的 分离
纤维素酶催化分解后红色 复合物无法形成，培养基
定
培
上就会出现以纤维素分解
培
养基中加入酚红指示剂，如 菌为中心的透明圈
养 现 观果察pH菌升落高周指围示是剂否会有变红红色的 观察菌落周围是否出现
基 象 环带出现来鉴定尿素分解菌 透明圈来筛选纤维素分解菌
方 法
脲酶检测法
刚果红染色法
6、纯化培养
在产生明显的透明圈的菌落，挑取并 接种到纤维素分解菌的选择培养基上， 在300C－ 370C培养，可获得纯化培养。
微生物代谢产物的分离提取和鉴定
微生物代谢产物的分离提取和鉴定微生物代谢产物是微生物在生长过程中产生的一系列化合物，具有广泛的生物活性和医药应用价值。
其分离提取和鉴定是微生物学研究中的重要内容之一。
1. 微生物代谢产物的分离提取微生物代谢产物的分离提取可以通过以下几种方法进行：1.1 生物筛选法生物筛选法是利用微生物自身代谢特性进行分离提取的方法。
通过对微生物菌种的筛选和培养，可以筛选出产生特定活性物质的微生物。
随着技术的不断发展，生物筛选法已经成为了有机合成方法的重要补充。
1.2 萃取法萃取法是通过溶剂的物理性质差异对微生物代谢产物进行提取的方法。
通常使用有机溶剂（如氯仿、乙酸乙酯、丙酮等）进行萃取，将样品与溶剂混合，使化合物转移到到溶液中，然后再经过干燥等处理得到分离提取物。
1.3 分离柱层析法分离柱层析法是将萃取物通过固相柱进行分离的方法。
柱层析常用于研究样品中单一化合物的分离和纯化。
主要利用化合物在某些材料表面的化学吸附和排斥作用分离化合物，从而得到纯度较高的代谢产物。
2. 微生物代谢产物的鉴定微生物代谢产物的鉴定可以通过以下几种方法进行：2.1 紫外-可见吸收光谱法紫外-可见吸收光谱法是利用化合物分子在特定波长的光照射下所产生的吸收作用实现鉴定的方法。
这种方法非常适用于含有含电子共轭体系的化合物，如吲哚、噻吩类化合物等。
2.2 质谱法质谱法通常被视为微生物代谢产物鉴定的“金标准”。
它可以提供高灵敏度、高分辨率、高质量的分析结果，从而鉴定出代谢产物的分子式、结构特征和精确的分子量等信息。
2.3 核磁共振波谱法核磁共振波谱法是一种非常常用的分析方法，其主要原理是通过核磁共振现象对化合物进行鉴定。
不同类型的原子具有不同的核磁共振反应，从而可以进一步鉴定分子中含有哪些原子，并得到化合物的结构信息。
3. 结语微生物代谢产物的分离提取和鉴定是微生物研究中的重要环节，它为揭示微生物代谢途径、开发新型抗生素等提供了重要的实验支持。
随着科技的不断发展，微生物代谢产物的分离提取和鉴定技术也将不断地完善和提高。
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2.3素的微生物的分离
1、(2014·新课标Ⅰ)植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。
回答下列问题：
(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将________分解成________。
(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR 可与纤维素形成________色复合物。
用含有CR 的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________。
(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)：
据表判断，培养基甲________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是____________________________________；培养基乙________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是____________________________________________
________________________________________________________________________。
2．(12分)有些微生物能合成纤维素酶，通过对这些微生物的研究和应用，使人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。
研究人员成功地从土壤中筛选到能产生纤维素酶的微生物。
分析回答问题：
(1)在将样品稀释涂布到鉴别培养基之前，可以通过______(填“固体”或“液体”)培养基进行______以增加纤维素分解菌的浓度。
(2)刚果红可以与纤维素等多糖形成红色复合物，但并不与纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。
常用的刚果红染色法有两种，第一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应；第二种是在________时就加入刚果红。
________(填“第一种”或“第二种”)方法会使菌落之间发生混杂。
(3)如果观察到产生________的菌落，说明可能获得了纤维素分解菌。
为了确定是纤维素分解菌，还需要进行________产纤维素酶的实验。
纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的________进行定量的测定。
(4)实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌处理才能倒掉，这样做的目的是________________________________________________________________________。
1．纤维素酶是复合酶，包括C 1酶、C x 酶和葡萄糖苷酶等组分。
2．纤维素酶的作用：纤维素――――→C 1酶和C x 酶 纤维二糖――――→葡萄糖苷酶
葡萄糖。
3．刚果红与纤维素形成红色复合物。
当纤维素被分解后，培养基
中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。
4．分离分解纤维素的微生物的实验流程：土壤取样―→选择培
养―→梯度稀释―→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养
基上―→挑选产生透明圈的菌落。
5．分离后，为确定得到的是纤维素分解菌，还需进行发酵产纤维
素酶的实验。
1、答案：(1)纤维二糖葡萄糖(2)红透明圈(3)不能液体培养基不能用于分离单菌落不能培养基中没有纤维素，不会形成CR—纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌
2、答案：(1)液体选择培养(2)倒平板第一种
(3)透明圈发酵葡萄糖(4)防止造成环境污染。