基于13C稳定性同位素微观代谢和宏观代谢信息综合分析的发酵过程优化研究
一种碳同位素标记物及其制备方法和应用
一种碳同位素标记物及其制备方法和应用碳同位素标记物是生物医学研究中常用的一种关键工具，通过将不同碳同位素标记的化合物引入生物体内，可以实现对生物体代谢途径、药物吸收、分布、代谢和排泄等生理过程的研究。
本文将探讨一种碳同位素标记物的制备方法及其在生物医学研究中的应用。
首先介绍碳同位素标记物的制备方法。
通常情况下，我们可以选择使用稳定性较高的碳同位素，如碳-13（13C）和碳-14（14C）来进行标记。
其中，13C标记物较为常见，其制备方法通常通过与13C稳定同位素标记碳源反应，合成13C标记物。
此外，还可以利用同位素交换、同位素分离等方法来制备具有13C标记的化合物。
其次，我们将讨论碳同位素标记物在生物医学研究中的应用。
一方面，碳同位素标记物可用于药物代谢动力学研究。
将药物分子中的某些碳原子用13C标记，可以追踪药物在体内的代谢途径，了解其代谢产物的组成和排泄途径，从而评估药物的代谢速率、代谢产物的活性和毒性，为药物的临床应用提供重要参考。
另一方面，碳同位素标记物还可用于研究生物代谢途径。
通过将代谢途径中关键化合物进行13C标记，可以跟踪这些代谢产物的生成和转化过程，揭示生物体内能量代谢、脂肪合成、葡萄糖代谢等生理过程的机制，为疾病诊断和治疗提供依据。
除此之外，碳同位素标记物还可以用于研究细胞代谢途径。
将细胞培养基中的某些营养元素进行13C标记，可以跟踪这些营养物质在细胞内的代谢途径，了解细胞能量代谢、生物合成、分泌代谢等过程的动态变化，为疾病治疗和干预提供重要信息。
综上所述，碳同位素标记物是一种重要的生物医学研究工具，其制备方法简单且应用广泛。
通过将碳同位素标记的化合物引入生物体内，可以实现对生物体代谢途径、药物代谢和细胞代谢等过程的研究，并为疾病诊断和治疗提供重要参考。
因此，碳同位素标记物具有广阔的应用前景，在生物医学研究中发挥着重要作用。
基于核磁-质谱稳定同位素分辨的代谢组学及肿瘤代谢应用
基于核磁-质谱稳定同位素分辨的代谢组学及肿瘤代谢应用1.引言1.1 概述在代谢组学研究领域，核磁-质谱稳定同位素分辨技术已经成为一种重要的分析方法。
基于核磁共振和质谱技术的结合，该技术能够在代谢水平上提供全面和准确的信息，进一步揭示生物体内代谢网络的变化与调控机制。
代谢组学通过分析细胞或组织中代谢产物的整体组成和相对含量，可以获得关于生物体内代谢物组成和变化的全貌，有助于了解生物体在不同状态下的代谢特征和相互作用。
肿瘤代谢学研究是代谢组学的一个热点领域。
肿瘤细胞的代谢特征与正常细胞不同，具有高度依赖糖酵解和异常的脂肪酸代谢等特点。
通过分析肿瘤细胞的代谢变化，可以揭示肿瘤的发生机制、进展过程以及治疗反应，为肿瘤的早期诊断和治疗提供新的思路和方法。
基于核磁-质谱稳定同位素分辨的代谢组学技术，可以通过标记和追踪代谢物中特定同位素的变化，实现对代谢途径和代谢流动的定量分析。
这种方法能够提供代谢物的结构信息和代谢途径的动力学变化，进一步拓展了代谢组学的研究领域。
在肿瘤代谢研究中，通过核磁-质谱稳定同位素分辨的代谢组学技术，我们可以深入了解肿瘤细胞的代谢特征、代谢途径的调控机制以及与肿瘤发生的相关因素。
这对于肿瘤的分型、诊断和治疗提供了重要的参考依据。
综上所述，基于核磁-质谱稳定同位素分辨的代谢组学技术在肿瘤代谢研究中具有重要的应用价值。
通过该技术，我们能够全面了解肿瘤细胞的代谢特征和代谢途径的变化，从而为肿瘤的早期诊断和治疗提供新的策略和方法。
1.2文章结构文章结构部分的内容可以包括以下内容：本文主要分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分主要概述了本文的研究背景和目标。
首先，介绍了代谢组学在肿瘤研究中的重要性和应用前景。
接着，详细介绍了基于核磁-质谱稳定同位素分辨技术的代谢组学方法及其在肿瘤代谢研究中的应用。
最后，阐述了本文的目的，即通过研究核磁-质谱稳定同位素分辨的代谢组学在肿瘤代谢研究中的应用，为肿瘤诊断和治疗提供新的策略和方法。
生物过程代谢组学与代谢流测定
生物过程代谢组学与代谢流测定黄明志;鲁洪中;林佳【摘要】整合的代谢组学和13C代谢流数据能充分反映细胞的代谢状态,对代谢组学和代谢流的测定技术已成为工业生物过程研究的重要手段,并能为工业生物过程优化和高产菌株理性设计提供重要帮助.阐述了代谢组学和代谢流测定的完整流程,包括实验方法、数据处理方法和软件工具,并综述了其在代谢途径鉴定、代谢机制解析和代谢工程等领域的应用进展.【期刊名称】《生物产业技术》【年(卷),期】2018(000)001【总页数】6页(P68-73)【关键词】代谢组学;代谢流;生物过程【作者】黄明志;鲁洪中;林佳【作者单位】华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237【正文语种】中文1 代谢组学测定生物过程代谢组学（metabolomics）的测定是指通过对生物过程中的细胞代谢物进行定量分析，以阐释生物过程中细胞代谢的变化。
代谢组学数据的测定包括三个步骤，分别是样品处理、仪器分析和数据处理。
1.1 样品处理在代谢组学研究中，适当的预处理是获得可靠分析结果的基础。
样品预处理的目的是固定细胞的新陈代谢活动，以尽可能多地获得细胞的新陈代谢信息。
根据代谢物所处位置，可以分为胞外代谢物组和胞内代谢物组，两者分别关注所有胞外代谢物和所有胞内代谢物。
胞外代谢物的获取相对简单，常用方法包括低温离心和冷钢珠过滤。
低温离心是将样品注入预冷管，低温离心分离出生物质和上层清液。
冷钢珠过滤是将样品注入含有不锈钢珠的预冷注射器，通过快速过滤分离生物质和上层清液[1]。
由于离心需要的时间较长，过滤操作更为方便，因此冷钢珠过滤法的使用更加普遍。
胞内代谢物的可靠获取较为复杂，要经过取样、灭活和代谢物抽提等操作。
许多胞内成分，特别是糖酵解途径中间代谢物、与能量相关的代谢物（如ATP）和辅因子（如NADH）等，其转化时间都在秒级。
13c标准物质的
13c标准物质的
13C标准物质是指其中的碳元素的同位素含量为13C的化合物。
13C是碳的一种同位素，相对丰度为1.1%，相对于稳定同位
素12C而言，13C含量较少。
13C标准物质在化学、生物、地质等领域中具有广泛的应用。
它可以用于研究化学反应、代谢途径、发酵过程等。
通过测定13C同位素比值，可以确定样品中特定元素的来源和代谢途径，进一步了解样品的性质和过程。
在医学和环境科学研究中，13C标准物质被用于进行同位素示
踪实验。
通过给予受试者带有13C标记的物质，研究者可以
追踪和定量受试者体内物质的代谢路径和转化速率，从而了解疾病发展和环境污染的机理。
常见的13C标准物质包括13C标记的葡萄糖、氨基酸、脂肪
酸等有机物，以及13C标记的二氧化碳等无机物。
这些标准
物质经过特殊制备和纯化工艺，确保其同位素含量和纯度的准确性和稳定性，以提供可靠的实验数据。
代谢流检测同位素标记方法
代谢流检测同位素标记方法代谢流检测是一种用于研究生物体代谢过程的重要方法。
而同位素标记则是代谢流检测的一种常用技术手段。
本文将介绍代谢流检测同位素标记方法的原理、应用以及未来发展。
一、原理代谢流检测同位素标记方法基于同位素的特性，通过给生物体内的代谢产物标记同位素，然后追踪同位素在代谢过程中的转化和分布情况，从而揭示代谢通路和代谢流动的动态变化。
常用的同位素标记包括稳定同位素标记和放射性同位素标记。
稳定同位素标记主要使用稳定同位素如碳-13（13C）、氮-15（15N）等进行标记。
通过给生物体提供含有标记同位素的底物，可以追踪标记同位素在代谢过程中的转化情况。
例如，可以使用13C标记的葡萄糖来研究细胞内糖酵解通路的代谢流动。
放射性同位素标记则是利用放射性同位素的放射性特性来进行追踪。
放射性同位素通常用于研究代谢过程中的特定酶催化反应。
例如，可以使用放射性标记的底物来研究某一特定酶的活性和代谢通路的流动。
二、应用代谢流检测同位素标记方法在生物医学研究和药物开发领域具有广泛的应用。
以下是几个常见的应用：1. 代谢疾病研究：代谢流检测同位素标记方法可以帮助揭示代谢疾病的发生机制和代谢异常。
通过比较健康人和病人的代谢流动差异，可以找到病理生理过程中的关键因素，并为疾病诊断和治疗提供依据。
2. 药物代谢研究：药物的代谢途径对于药物的疗效和安全性具有重要影响。
代谢流检测同位素标记方法可以帮助研究药物在体内的代谢途径和代谢产物。
这对于药物设计和开发具有指导意义，可以提高药物的疗效和减少副作用。
3. 营养代谢研究：代谢流检测同位素标记方法可以用于研究不同营养物质在体内的代谢过程。
通过标记不同的营养物质，可以追踪其在身体内的转化和分布情况，进而了解不同营养物质的代谢途径和相互作用。
4. 代谢工程：代谢流检测同位素标记方法在代谢工程领域也有重要应用。
通过标记底物和产物，可以揭示代谢通路的结构和功能，进而优化代谢工程的设计和操作策略。
C13标记在代谢途径中应用 PPT课件
1)化学及生物学性质
同一的示踪性 2)物理性质差异的
可探测性
特点
放射性同位素
1.测量灵敏度高，活度检测限
Amin=1Bq,相应物质的质量检测 限10-12 -10-17g 2.能与内源物质相区分，可在生 理稳恒条件进行代谢研究。 1.现代质谱核素丰度测定的精度 可达0.01%.
稳定性同位素
2.利用同位素稀释原理可计算样
品中的物质来自示踪剂的比率。 3.样品制备分析需大型设备。 4.无放射性，无衰变，无污染。 有时是唯一的。
3.样品制备及测定简便。
4.结合显影或显像技术可进行定 位定量或半定量测定。
稳 常用的稳定性示踪核素列表 定同位素标记法
Element H
几个术语：
N
C S
Heavy isotopes (0.0156%)
它们都有6个质子和6个电子，但中子数则分别为6、7和8。
同位素根据其质量不同有轻重之分，又根 据其物理性质不同可分为放射性同位素和 稳定同位素 凡能自发地放出粒子并衰变为另一种同位 素者为放射性同位素。无可测放射性的同 位素是稳定同位素。
稳定同位素其中一部分是放射性同位素衰
变的最终稳定产物。例如206Pb和87Sr等。 另一大部分是天然的稳定同位素，例如
氨酸等均可作为示踪氨基酸。
13C标记在植物水分胁迫程度的应用
判断植物是否受到干旱胁迫及其程度
常规的方法是：直接观察植物叶片是否失水萎蔫，测定植物叶 片的水势或分析与干旱胁迫有关的酶。实际上，一株植物在干 旱环境中会倾向于关闭气孔，从而减少水分的散失。同时，植
物会降低对13CO2吸收的排斥，利用更多的13CO2，所以植物组
白质代谢规律的研究涉及最多。稳定同位素技术可用于测定
_13_C代谢通量分析
本文主要针对13 C MFA 的最新进展做简要的阐
收稿 : 2005 年 9 月 , 收修改稿 : 2006 年 1 月 3 国家自然科点基础研究发展规划 (973) 项目 (No. 2003CB716003) 资助 3 3 通讯联系人 e2mail :xmzhao @tju. edu. cn
关键词 13 C MFA 标记模式 微量滴定板 传感反应器 数据分析 功能基因组 中图分类号 : O652 ; Q591 ; Q819 文献标识码 : A 文章编号 : 10052281X(2006) 07Π820995207
Advances in 13 C Metabolic Flux Analysis
1 引言
代谢通量 (metabolic flux) 是细胞生理学的一个 基本决定因素 ,也是代谢途径中最重要的参数 。在 稳态条件下代谢通量一般以代谢产物的比生成速率 来表 示[1] 。代 谢 通 量 分 析 ( metabolic flux analysis , MFA) 是根据代谢路径中各反应的计量关系以及实 验中所测得的数据来确定整个代谢反应网络中代谢 通量分布的一种方法 ,在代谢工程中占有重要地位 。 通过计算不同途径或不同条件下的代谢通量分布 , 可以表征细胞的代谢能力 ,洞察遗传修饰对细胞代 谢状态的影响 ,从而为进一步更加合理的遗传改造 提供理论依据 。MFA 综合了底物吸收及产物形成
同位素示踪技术在生物体代谢研究中的应用
同位素示踪技术在生物体代谢研究中的应用同位素示踪技术是一种在生物体代谢研究中广泛应用的重要工具。
通过利用同位素标记物质的特殊性质，可以追踪和分析生物体内化合物的代谢途径、动态变化以及相关生物学过程。
本文将介绍同位素示踪技术在生物体代谢研究中的应用，并探讨其在医学、农业和环境科学领域的潜在应用。
同位素示踪技术是基于同位素的稳定性和可追踪性原理的。
同位素是指原子的核外电子数相同，而核内中子数不同的同种元素。
同位素之间的差异使得它们在化学反应和生物过程中表现出若干特定性质。
例如，核素碳-13（13C）相对于普通碳-12（12C）而言具有一个额外的中子，因此它在物理上比12C略微重一些。
这个微小的重量差异使得13C被用作追踪剂，通过标记目标化合物中的碳原子，其轨迹可以在生物体内追踪和分析。
在医学研究中，同位素示踪技术被广泛应用于代谢病理学研究、新药开发和药物动力学研究等方面。
通过将同位素标记的药物或营养物质引入生物体内，可以追踪其代谢产物在体内的分布和消除情况。
这对于评估新药在体内的活性和作用机制具有重要意义，同时也为药物剂量的合理调整提供了依据。
例如，在药物代谢动力学研究中，将药物中的一个碳原子用13C标记，并通过检测代谢产物中的13C同位素，可以确定药物在体内的转化途径和代谢速率。
在农业研究中，同位素示踪技术可以帮助科学家追踪农作物的养分吸收和转运过程。
通过使用同位素标记的养分，科学家可以确定养分在土壤中的迁移路径，并了解作物对养分的吸收效率。
此外，同位素示踪技术还可以用于研究植物间的共生现象，例如根际微生物与植物之间的相互作用。
通过标记微生物使用的同位素，科学家可以跟踪其在植物体内的定位和代谢过程，揭示它们与植物之间的协同作用机制。
在环境科学领域，同位素示踪技术被广泛应用于水资源管理和污染追踪方面。
例如，通过标记地下水中的同位素，可以确定地下水的污染来源和迁移路径。
这对于制定合理的地下水保护措施具有重要意义。
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A B C N
A’ B’ C’ N’
局限性
能量平衡分析上，全面确定与能量相关的反应非常困难 原核生物中存在大量无效循环
细胞中大量存在的可逆反应、双向反应、回补反应 及并行反应中的净通量
13C代谢通量分析
典型的应用是在连续培养过程中使代谢达到拟稳态，利用菌体 蛋白原氨基酸的标记信息，对中心代谢途径通量进行计算。 对数生长期和连续培养的拟稳态过程
+
Serine
H3 N H
COOC C H H
Glycine
+
COO C H H
CO2 NH3 CH3
3PGA
COO+
H3 N
OH 93.45
OAA
H3 N
C CH2 CH2 S CH3
H
Methionine CH3 CH3 +H3 N CH3
COO- Betaine C H H
Biomass
A
pH 转速
71.9
2.8
3.6
3.6
Sedtohep ulose-7-P
G-3-P 103.9 3-P-glycerate
10.1
Threonine Acetaldehyde
Serine
Glycine 9.2 Betaine
21
Anaplerosis
48.3
Acetyl-CoA 77.6
20.4 0.3
NADH NADPH
分解合成代谢 中间代谢物
氨基酸
菌体蛋白
氨基酸
菌体蛋白
水解质谱分析
质谱分析
水解质谱分析
在线电极信号线
在线电极信号线
在线参数采集线
尾气质谱仪
快速取样 微型传感反应器 灭活
数据采集分析系统
离心洗涤
细胞破碎
质谱测定 生产规模反应器
GC-MS
基于13CMFA的VB12发酵过程甜菜碱 的代谢及工艺优化
Biomass (U-13C)Glucose 6.55
PPP pathway
Glucose 100.0 Glucose-6-P
mmol/100mmol(glucose) 9.6 Pentose-5-P 2.2
PPP pathway
Erythrose -4-P 3.5
Erythrose -4-P
Fructose-6-P 26.7 9.6 9.6
Sedtohep ulose-7-P
B
Triose-P 1 PGA PGM, ENO
Ru
C bis
O
Ru1,5-P2
C
Triose-P 1 PGA PGM, ENO
Ru
C bis
O
D
Ru1,5-P2 PHE(1-9)
1
PHE(1-2) PHE(2-9)
Phe 1 Val(1-5) Val (2-5) 1 Val
1
1 PEP
1
1 PEP PK 1 [U-13C3]Alanine 1 Pyruvate PDH
347.3 61.4 58.7
NAD+ NADP FAD
+ +
Anaplerosis
87.5 Phosphoenolpyruvate 100.8 26.1 Pyruvate 98.2
7.8
7.6
51.3
out
8.7
NADH NADPH
502.6
C1 metabolism
NAD+ FAD
6.2
6.3(1.1) Serine Glycine C1 metabolism
A
71.9 2-Keto-3-deoxy -6-gluconate
2.6
Glucose 100.0 Glucose-6-P
mmol/100mmol(glucose) 28.0 Pentose-5-P 3.6
3.5
B
90.4 2-Keto-3-deoxy -6-gluconate
Entner-Doudoroff pathway
Envirome
Toxin/Danger Pressure Osmolarity pH ORP Sheer Stress Temperature Oxygen CO2
Fluxome
Transcri ptome
Proteome
Cell
基于化学计量学的代谢通量分析（MFA）
其理论基础是中间代谢物的拟稳态假设和物料的质量守恒定律。 它是在构建好的细胞代谢网络的基础上，先假设代谢网络的中间代谢物 都处于拟稳态，然后根据物料质量守恒定律写出符合该代谢网络的化学 计量矩阵方程，再通过测量胞外底物消耗速率和代谢物分泌速率，最后 计算得出整个代谢网络的流量分布。
feed by 13C1-ala
feed by U-13C1-ala
研究技术的成熟
• • • • 对生产菌代谢途径的变化分析。 标记底物的选择。 标记底物 模式的选择。 数据的处理及分析。
发酵过程中非稳态代谢流分析
（传统实验模式）
标记底物 分解合成代谢 中间代谢物
（新实验模式） 标记底物
细胞
12.5
117.9
Vitamin B 12
out
3.5
Succate 121.5
Succinyl-CoA
Glutamate Vitamin B12 biosynthesis
0.33 Vitamin B 12 a-Ketoglutarate -ALA 9.8 126.5 4.2 Glutamate Succinyl-CoA Vitamin B12 biosynthesis
1.4
3.5
7.6
Oxaloacetate 57.6 TCA cycle
Citrate 76.3 1.9
FADH
Asp
Oxaloacetate TCA cycle
Citrate 138.2 4.9
FADH
208.5 NADP + 121.5 +
0.8
Succate 58.7
0.6
0.10 a-Ketoglutarate -ALA 0.2 61.3 0.0
7-ADCA发酵过程中己二酸前体的利用
Fate of labeled CO2 in fatty acid biosynthesis
Scenarios and calculations
A
Triose-P 1 PGA PGM, ENO 1 PEP PK 1 Alanine 1
Ru
C bis
O
Ru1,5-P2
基于13C稳定性同位素微观代谢和宏观代谢信 息综合分析的发酵过程优化研究
A Powerful Tool in Metabolic Engineering
微观代谢流研究的重要性
Genome Nutrition
Vitamin Amino acids Peptides Antibiotics Organic acids metabolism Bio-fuels Enzymes
Ratio PEP from PPP pathway OAA from PEP OAA from glyoxylate Pyruvate from malate PEP from OAA Experiment U U U U U
Serine from glycine
Glycine from serine Erythrose-4-P from pentose-5-P Pentose-5-P from glucose-6-P Pentose-5-P from erythrose-4-P Serine through glycolysis Pyruvate through ED pathway
U
U U U U 1 1
细胞代谢途径通量计算
13C标记代谢技术的应用
1 发酵生产中底物（糖、前体等）消耗较大造成发酵原材料成本较高， 如青霉素、头孢、环孢菌素、维生素、7-ADCA发酵等。
2 发酵生产过程中副产物的组分含量较高，如谷氨酸发酵过程中乳酸的 积累、维生素B12发酵过程中丙酸积累。 3 发酵产物合成途径的分析，初级代谢与次级代谢启动之 间的关系，干 扰素的合成，免疫抑制剂。 4 生产菌株工程菌改造的基础分析，表型与基因型之间的关系的阐明， 更好地指导工程菌构建。
System for study of the CO2 on vitamin B12fermentation
Fig.
Effect of CO2 concentration on vitamin B12 fermentation
技术研究及应用的发展
OUR and CER (mmol/l/h)
补加甜菜碱 OUR
CER
pH
基于非稳态标记实验的CO2对VB12合成影响的研究
Flux rates PEP from PP Pathway SER from GLY GLY from SER PYR from MAL OAA from PYR PEP from OAA
OAA Phe 1 Val CO2
Phe 1 Val CO2 1 [1-13C]Alanine
PK 1 Pyruvate PDH External 13CO2 Ac-CoA
Phe 1 Val CO2
Pyruvate PDH
Ac-CoA
Ac-CoA
calculate ratios from MS
external feed
Distribution of total pool (mean% ± SD) Point A Point B 35.9 ± 1.9 15.7 ± 1.7 33.3 ± 2.6 52.0 ± 0.9 81.8 ± 0.7 27.6 ± 1.5 1.5 ± 2.6 -0.8± 0.9 44.4 ± 1.9 44.8 ± 2.2 35.9 ± 1.2 19.8 ± 1.6