变形链球菌表面蛋白遗传多态性与粘附性能关系的研究

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变形链球菌表面蛋白生物学特性的研究现状

变形链球菌表面蛋白生物学特性的研究现状发布时间：2022-10-27T05:37:03.451Z 来源：《健康世界》2022年14期作者：胡丹阳[导读] 变形链球菌是口腔当中十分重要的致龋菌组成部分，并在近些年的研究过程中，证明了这种病菌与全身的系统性疾病，也存在着一定的关系。

胡丹阳联勤保障部队大连康复疗养中心小平岛疗养区，辽宁省大连市，116087 摘要：变形链球菌是口腔当中十分重要的致龋菌组成部分，并在近些年的研究过程中，证明了这种病菌与全身的系统性疾病，也存在着一定的关系。

在细胞外蛋白当中，存在着一定的疾病或者毒性的因子，这对于人体的疾病发生存在着较为紧密的联系。

在本文的分析中，主要阐述了变形链球菌表面蛋白生物学特性，从而为医疗卫生领域的研究提供参考，确保龋齿等相关疾病能够被有效解决。

关键字：变形链球菌；表面蛋白；生物学特性引言：在当下进行变形链球菌的研究过程中，为了实现对表面蛋白生物学的特性研究，就需对其内部组成进行详细的分析与研究。

这种研究方向，不仅仅对于病理研究和抗生素开发有着十分重要的价值，并在不同领域也相应的存在着较高的价值，全面提升了对口腔内部菌群的了解深入程度。

1 研究背景龋齿是一种基于细菌影响下，让引体人体组织发生慢性破坏的疾病、变形链球菌就是一种十分重要的致龋菌。

该菌体是一种革兰氏阳性球菌，在口腔当中的菌群占据着十分重要的比重，也是在近些年的研究进程中，发现对于全身的系统性疾病，带来十分明显影响的关键病害。

在对细胞外蛋白的处理过程中，往往含有这较多的致病菌，同时也相应的存在着一定的毒性因子。

对于这样的疾病发病的机制研究中，存在着较多密切的联系。

蛋白生物学特性的研究中，基本上要从某些特定的时间，对于细胞的蛋白质进行详细的分析，同时加上对于表面蛋白质进行详细的分析，以此了解到蛋白质之间的相互作用情况。

现阶段细菌细胞表面蛋白的研究工作，已经是一个十分重要的研究领域，并取得了十分重要的研究结果。

酸性条件下变异链球菌临床株表面相关蛋白表达差异分析

ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａＩｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｓｕｒｆａｃｅ — ａｓｓＯｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｓｔｒｅＤｔ０ｃＯＣｃｕＳｍｕｔａｎｓｓｔｒａｉｎｓ
相似之处；两菌株间蛋白表达差异可能是耐酸性存在差异的原因。
关键词：链球菌，变异；蛋白质组学；临床分离株；表面相关蛋白；耐酸性
中图分类号：Ｒ７８１．１文献标志码：ＡＤＯＩ：１０．１１９５８￣．ｉｓｓｎ．０２５３ — ９８９６．２０１５．０７．００１
ＪＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＥｎｄｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ，ＴｉａｎｉｆｎＳｔｏｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌＨｏｓｐｉｔａｌｆＮｏａｎｋａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｉｆｎ３０００４１，Ｃｈｉｎａ；２ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｆＥｏｎｄｏｄｏｎｔｉｃｓａｎｄＯｐｅｒａｔｉｖｅＤｅｎｔｉｓｔｒｙ，ＳｃｈｏｏｌａｎｄＨｏｓｐｉｔａｌｆＳｏｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，ＦｕｊｉａｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；３ＩｎｓｔｉｔｕｔｅａｎｄＨｏｓｐｉｔａｌｆＳｏｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，ＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ

变形链球菌蛋白组学研究进展

DE）、二维凝胶电泳（two- dimensional gel elec trophoretic，2- DE）和高效液相色谱法等。 2- DE 是当前唯一可将数千种蛋白同时分离与展示的分离技术，随着此技术的不断改进，已成为蛋白组学和差异蛋白组学研究中的首选分离技术； [3] 但该技术具有重复性差，某些疏水蛋白不适合进行第一相等电聚焦，检测不出低丰度蛋白等缺点。 1.2 消化技术
Svens"ter等用 [6] 14C示踪定位和 2- DE 分析了 S. mutans H7 分别在氧、酸、饥饿、盐和热刺激下的蛋白表达变化情况，结果发现在各种情况下有 6 种蛋白表达均上调，这 6 种蛋白为一般应激反应蛋白。Wilkins等研 [7] 究发现，一般应激反应蛋白包括相对分子质量为 6.0×104 伴侣蛋白、Hsp33 和超氧化物歧化酶、ABC 转运蛋白等。
20 世纪 90 年代中期，人类基因组草图绘制完成预示着功能基因组时代的到来，对基因的终产物及生命的执行者— — —蛋白质的研究已成为目前生命科学研究领域中的一大热点。 [1] 蛋白组学是功能基因组学的重要组成部分， [2] 其主要任务是识别和鉴定细胞、组织或机体的全部蛋白，并分析其功能和模式。已有研究表明，仅有约 2% 的疾病与基因序列有关，而 98%的疾病与蛋白表达密切相关，由此可见蛋白组学研究在探索病因、致病机制以及治疗方法中的重要性[2]。
国际口腔医学杂志第 35 卷增刊 2008 年 4 月 Internat ional Journal of Stomat ology Vol.35 Suppl. Apr. 2008
2.1.2 涉及代谢反应的蛋白酸性条件下，为了减少酸性产物，以及减少由于质子移位膜三磷酸腺苷酶消耗大量三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和分解代谢增强所引起的不良后果， S. mutans 代谢反应发生变化，这些变化主要涉及细胞分裂、糖酵解、酸的产生和支链氨基酸的生物合成[11- 。 12]

应用原子力显微镜对口腔变异链球菌黏附机制的研究

应用原子力显微镜对口腔变异链球菌黏附机制的研究盖阔;郝丽英;蒋丽【摘要】原子力显微镜(AFM)是一种理想的探测细菌与生物材料之间基本相互作用力及研究微生态系统形态和力学的工具,被应用于包括口腔变异链球菌在内的多种微生物的形态及力学研究中.本文就AFM在口腔变异链球菌黏附研究中的应用及在相关黏附机制、黏附影响因素等方面的研究成果进行综述,总结阐述口腔变异链球菌黏附的分子生物学机制,为细菌黏附的研究提供力学基础及新思路.%Atomic force microscope(AFM) is an ideal tool for detecting the fundamental interactions between bacteria and biomaterials and studying the morphology and mechanics of microsystems including oral Streptococcus mutans. In this paper, the application of AFM in study of the adhesion mechanisms and influencing factors are reviewed, which summarizes the molecular mechanism of the adhesion of oral Streptococcus mutans. Thus, it provides mechanical basis and a new way for studying bacterial adhesion.【期刊名称】《国际口腔医学杂志》【年(卷),期】2017(044)003【总页数】5页(P320-324)【关键词】原子力显微镜;变异链球菌;细菌黏附【作者】盖阔;郝丽英;蒋丽【作者单位】口腔疾病研究国家重点实验室,国家口腔疾病临床研究中心,四川大学华西口腔医院成都 610041;口腔疾病研究国家重点实验室,国家口腔疾病临床研究中心,四川大学华西口腔医院成都 610041;口腔疾病研究国家重点实验室,国家口腔疾病临床研究中心,四川大学华西口腔医院成都 610041【正文语种】中文【中图分类】R37原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）结合单细胞力谱（single-cell force spectroscopy，SCFS）分析、单分子力谱（singlemolecule force spectroscopy，SMFS）分析等技术可以实现对单个细菌黏附性能的研究，是一种理想的探测细菌与生物材料之间基本相互作用力及研究微生态系统形态和力学的工具。

聚氨酯复合材料表面变形链球菌黏附状况的实验研究

聚氨酯复合材料表面变形链球菌黏附状况的实验研究李静;孔方圆;郑元俐【摘要】Objective To investigate the Streptococcus mutatis adhesion to polyurethane composites containing polyphosphazene. Methods Polyurethane composites containing 1% polyphosphazene ( PZS-1 % group), polyurethane composites containing 5% polyphosphazene (PZS-5% group) and silicone rubber soft liner (control group) were solidified under room temperature. These specimens were incubated with Streptococcus mutans suspension. Forty-eight hours after anaerobic culture, Streptococcus mutans adhesion to specimens was observed by light microscopy with Gram staining. Suspension with bacteria detached from specimens after ultrasound and vortex vibration was collected, and colonies of Streptococcus mutans were counted. Results Light microscopy revealed that the morphology of Streptococcus mutans adhered to specimens in three groups was similar, and exhibited typical chain arrangement of Gram positive coccus. The numbers of colonies of Streptococcus mutans adhered to specimens in three groups were well in line with corresponding absorbance. The numbers of colonies of Streptococcus mutans adhered to specimens in PZS-1 % group, PZS-5% group and control group were (405. 000 ± 60. 046), (253. 000 ± 62. 946) and (1 008. 000 ± 119. 955)(× 102 CFU/m) accordingly, and the number of PZS-5% group was significantly lower than those of PZS-1 % group and control group ( P < 0. 001). Conclusion Relatively less Streptococcusmutans is adhered to polyurethane composites containing 5% polyphosphazene, which may be related to the addition of polyphosphazene.%目的观察含纳米聚磷腈的氨酯复合材料表面变形链球菌的黏附情况.方法室温下分别固化含1％和5％纳米聚磷腈的氨酯复合材料(PZS-1％和PZS-5％组)和硅橡胶软衬材料(对照组),经试件准备和变形链球菌菌液制备后行黏附试验.厌氧培养48 h后,光学显微镜下观察经革兰染色试件表面的细菌黏附情况；经超声和漩涡震荡后,试件表面黏附的细菌脱落,收集菌悬液行变形链球菌菌落计数.结果光学显微镜观察发现,3组试件表面黏附的变形链球菌形态相近,呈典型链状排列的革兰阳性球菌.3组试件表面黏附的变形链球菌菌落形成数与相应吸光度值具有较好的一致性.PZS-1％组、PZS-5％组和对照组试件表面变形链球菌菌落形成教分别为(405.000±60.046)、(253.000±62.946)和(1008.000±119.955)(×102 CFU/mL),PZS-5％组显著低于PZS-1％组和对照组,差异均有统计学意义(P＜0.001).结论含5％纳米聚磷腈的氨酯复合材料表面的变形链球菌黏附数量较少,可能与其添加的聚磷腈成分有关.【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2012(032)005【总页数】4页(P594-597)【关键词】聚氯酯;聚磷腈;软衬;变形链球菌;黏附【作者】李静;孔方圆;郑元俐【作者单位】上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔修复科上海市口腔医学重点实验室,上海200011;上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔修复科上海市口腔医学重点实验室,上海200011;上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔修复科上海市口腔医学重点实验室,上海200011【正文语种】中文【中图分类】R783.1变形链球菌因具有很高的耐酸性和产酸性，是口腔内常见的致病菌。

变形链球菌蛋白质组学研究进展

ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓｉｎＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｒｅｓｅａｒｃｈ．
同时也通过蛋白质组学技术来研究变形链球菌的致病特性。本文将系统介绍蛋白质组学在变形链球菌致病性研究
中的应用。
关键词：变形链球菌；细胞外蛋白；蛋白质组学粘附
［中国图书分类号］Ｒ７８１
［文献标识石５－】Ａ
［文毒｝编号］ｌ６７２ — ２９７３（２０ｌ６）０６ — ０３５２ — ０５
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ；ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｔｅｉｎ；ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ；ａｄｈｅｒｅ
龋病是一种以细菌为主的多因素影响下，牙体硬组织发生的慢性破坏性疾病，变形链球菌是其最主要的致龋菌。变性链球菌属于革兰氏阳性球菌，是口腔菌群中占比最大的链球菌中的一支，也被证明与许多全身系统性疾病有密切的关系，其细胞外蛋白往往含有致病或毒性因子，与疾病发病机制密切相关，对病理研究和抗生素开发等具有重要意义。蛋白质组即
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａｌｗａｙｓｃｏｎｔａｉｎｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｏｒｔｏｘｉｃｆａｃｔｏｒｓ，ａｒｅｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆ

表面蛋白抗原P及其在变异链球菌生物膜形成中的作用

表面蛋白抗原P及其在变异链球菌生物膜形成中的作用变异链球菌表面蛋白抗原（SPA）P是一类介导细菌黏附和生物膜形成的重要的黏附毒力因子，具有高度保守性。

SPAP含有1561个氨基酸残基，其线性结构氨基酸序列由前导肽区、N端、A区、V区、P区、C端和细胞壁锚着端组成。

SPAP具有的淀粉样纤维特性，在细菌生物膜形成中十分重要。

SPAP可与牙面获得性膜中的唾液成分结合，介导变异链球菌对牙面的初始黏附。

SPAP通过分选酶转移肽共价结合到细菌胞壁表面，在内源性的表面蛋白释放酶作用下又可从细菌胞壁表面释放出来，从而使变异链球菌生物膜降解。

本文就SPAP的结构、淀粉样纤维特性，变异链球菌黏附，SPAP各区在生物膜形成中的作用等研究进展作一综述，明确其生物学特性，对于龋病病因学和龋病防治的意义不言而喻。

标签：表面蛋白抗原P；变异链球菌；生物膜形成[文献标志码]A变异链球菌（以下简称变链菌）对牙面的黏附是其定植、致龋的基础。

该菌表面的蛋白抗原P是一类介导细菌黏附和生物膜形成的重要的黏附毒力因子，具有高度保守性。

SPAP与宿主唾液成分、基质蛋白和其他口腔细菌的相互作用，与变链菌在牙面上的初始黏附、菌斑形成和龋病的发生密切相关。

1 SPAP1.1SPAP的结构SPAP含有1561个氨基酸（amino acid，aa）残基，其线性结构氨基酸序列由7个区组成：前导肽区（a leader peptide，aa-38），N端（anN-terminal region，aa-80），丙氨酸富集区A区（an alanine-rich region，aa-320），可变区V区（a variabledomain，aa-360），脯氨酸富集区P区（a proline-rich region，aa-180），C 端（a C-terminaldomain，aa-500），细胞壁锚着端（acell wall-anchoring segment）。

免疫防龋的研究新进展

免疫防龋的研究新进展龋病被以为是人类最普遍的感染性疾病。

关于免疫防龋的研究已有近30年历史。

早在60年代末期，国外学者即开始了防龋疫苗的探讨，期望通过接种某种防龋疫苗，有效地阻止致龋菌在宿主口内的粘附与定殖，达到预防龋齿的目的。

最近几年来，运用免疫学手腕操纵龋病更为其研究的热点。

大量研究证明，主动免疫与被动免疫均为有效的防龋手腕。

咱们就近期国内外免疫防龋的研究动态作一评述。

一、主动免疫防龋研究主动免疫是用人工接种的方式给机体输入抗原性物质，刺激机体免疫系统产生免疫应答，从而提高机体抗病能力。

在主动免疫防龋研究进程中，存在着一些障碍，要紧包括三个方面：①变形链球菌（简称变链菌）等致龋菌一样定殖在宿主组织表面，在这些部位难以激发有效的免疫反映；②抗变链菌抗体能与机体组织蛋白专门是心脏组织发生交叉反映，产生免疫复合物介导的疾病如细菌性心内膜炎；③变链菌与口内其他链球菌具有交叉反映性抗原，防龋疫苗介导的免疫反映可能破坏口内正常菌群的生态平稳。

因此，连年来学者们一直致力于通过改变免疫原、免疫途径、免疫佐剂和免疫频率等手腕，寻觅一种平安有效的防龋疫苗。

1．全菌疫苗：初期的防龋疫苗研究，主若是利用变链菌全细胞制备灭活死疫苗和减毒活疫苗。

通过对大鼠、猴等实验动物的免疫研究发觉，免疫后的动物唾液和血清中抗变链菌抗体水平明显升高，能有效地抑制变链菌在牙面的聚集，降低龋病的发生率。

这一时期的研究充分说明，利用变链菌全细胞多价疫苗可避免龋病的发生。

但进一步研究显示，与其他链球菌相似，变链菌某些抗原或成份可诱发与人心脏组织发生交叉反映的抗体。

2．纯抗原亚单位疫苗：80年代开始，随着对变链菌细胞壁各类抗原性多聚物的慢慢熟悉，免疫防龋转入以变链菌单一抗原成份制备亚单位防龋疫苗的研究。

研究的核心集中于两种候选疫苗，即变链菌要紧表面蛋白抗原（pAc或agⅠ／Ⅱ、pl、spaA等）和葡糖基转移酶（gTase），它们在介导变链菌对牙面的粘附和定殖进程中起着重要作用。

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基金项目：国家自然科学基金（编号30171013）、国家教委博士点基金（编号01061033）320临床医学变形链球菌表面蛋白遗传多态性与粘附性能关系的研究庄姮，刘天佳，杨德琴，李颂（四川大学华西口腔医学院，四川省成都市 610041）[摘要] 目的了解高、低粘附力变形链球菌临床分离株表面蛋白各粘附功能区遗传多态性与其粘附性能的关系。

方法实验菌株选自本实验室前期工作所获得的粘附力较强和较弱的血清c 型变形链球菌临床分离株，提取全菌DNA ，经PCR 分别扩增表面蛋白A 区，P 、V 区及C 末端编码基因spaP-a 、spaP-pv 、spaP-c 后，用限制性内切酶Hae Ⅲ、Alu I 进行限制性片段长度多态性分析。

19株菌株进行spaP-pv 的序列测定。

结果 1. 高、低粘附力变链菌临床株扩增产物spaP-a 经Hae Ⅲ酶切后，出现了4种基因型，其分布无统计学差异。

2. spaP-pv 经Alu I 酶切后，出现的a 、b 2种基因型菌株在不同粘附力菌株的分布不同（P <0.05）。

测序发现，a 型有2个片段与b 型出现差异，并且均位于V 区。

3. spaP-c 经Alu I 酶切后呈现2种基因型，其分布无统计学差异。

结论表面蛋白V 区编码基因出现变异可能是导致变链菌临床株粘附性能出现差异的原因之一。

[关键词] 变形链球菌; 表面蛋白; 遗传多态性; 粘附力A study on the Relationship between genetic diversity within surface protein of Streptococcus mutans and Adherent abilitiesZhuang Heng, Liu Tianjia, Yang Deqin, Li Song,. West China College of Stomatology, Sichuan University. Sichuan, Chengdu, 610041, China.[Abstract] Objective To study the relationship between genetic diversity within surface protein of Streptococcus mutans (serotype c) and their adherent abilities. Methods The clinical isolates of S.mutans included two groups with different adherent abilities, which were derived from previous work in our experimental lab. The bacterial DNA was extracted, and spaP-a 、spaP-pv 、spaP-c were amplified respectively by PCR. Genetic diversity were assessed by restriction fragment-length polymorphism(RFLP) with restriction endonucleases Hae Ⅲ and Alu I . Sequence of spaP-pv in 19 strains was performed. Results 1. Four different patterns of spaP-a PCR-RFLPs and two genotypes of spaP-pv were revealed when digested with Hae Ⅲ and Alu I respectively . The distribution of genotypes in strains with different adherent abilities was not different. 2. Two different genotypes(a, b) of spaP-pv were revealed and the distribution of two genotypes in strains with different adherent abilities was different(p<0.05). Sequence of spaP-pv revealed two different DNA fragments between a, b genotype strains and they were located in V-region of surface protein. Conclusion It suggests variation of gene encoding V-region may account for different adherent abilities of surface protein of S. mutans isolates._______________________________________________________________________________[Key words] Streptococcus mutans; surface protein; genetic diversity; adherent ability细菌感染机体并引起疾病的过程是一个复杂的细菌与机体相互作用的过程，细菌的粘附作用在此过程中发挥着重要的作用。

表面蛋白P1是人类主要致龋菌——变形链球菌（以下简称变链菌）重要的毒力因子之一，主要介导变链菌的非蔗糖依赖性粘附。

变链菌表面蛋白的分子结构现在已比较清楚，包括A区﹑P区﹑V 区及C末端[1] 等粘附功能区。

许多研究表明细菌毒力基因存在遗传多态性。

变链菌不同菌株的粘附性能不同，此差异的物质基础是其毒力因子的遗传变异。

本实验通过对变链菌临床分离株表面蛋白各粘附功能区编码基因遗传多态性的研究，探讨其与粘附性能的关系。

材料和方法1 主要试剂和仪器10×PCR缓冲液，MgCl2，dNTP，Taq DNA聚合酶，限制性内切酶HaeⅢ、Alu I，DNA胶回收试剂盒（均为上海生工生物工程技术服务有限公司），基因组DNA纯化试剂盒（北京赛百盛），厌氧培养箱（DY-2，浙江），紫外分光光度计（UV-1601，日本），PCR扩增仪(PERKIN ELMER9600，美国)，离心机(GmbH22331，德国)，电泳仪(BIO-RAD PAC3000，美国)，电热恒温水槽（DK-8B 型，上海）。

2 实验菌株本实验室前期工作[2]所获的变链菌(血清型c)不同AP-PCR基因型的临床分离株，采用液体闪烁计测法测量其对唾液包被羟基磷灰石的粘附，获得：低粘附力菌株22株及高粘附力菌株22株。

3 目的基因扩增将甘油保存的菌种复苏、增菌。

用基因组DNA纯化试剂盒提取各菌株DNA，-20℃保存。

据Kelly等[3]对变链菌(血清c型)NG5表面蛋白基因序列的分析及Brady等的文献报道[4],用提供的引物设计软件primer3.0设计3对引物,分别扩增变链菌表面蛋白A区，P、V区及C末端编码基因——spaP-a(473-571bp)、spaP-pv(2060-3157bp)、spaP-c(4003-4851bp)。

引物由上海基康生物技术有限公司合成。

spaP-a引物：上游5ˊCAGCTGAAGAAGCAGTCCAA 3ˊ下游5ˊTCTGCCAGTGCAGCTTTAAT 3ˊspaP-pv引物：上游5ˊTAGGTGTTTTTGCTTCCGCT 3ˊ下游5ˊTAGCCACCAAAGTTCTGTCA 3ˊspaP-c 引物：上游5ˊACAGGCGGGAGTTATGAAGA 3ˊ下游5ˊGCTCAATCTGTGATTTATCGCT 3ˊPCR反应条件：10×PCR缓冲液3.75ul，dNTP 6ul(1mM), MgCL2 2.25ul(25mM)，Taq DNA聚合酶0.5ul(5u/ul)，上下游引物各0.3ul(50uM),模板DNA 2.5ul，加去离子纯水至总反应体积37.5ul。

循环参数：(94℃ 35s，56℃ 35s，72℃ 2.5min)×30；72℃延伸10min。

3种PCR产物分别作1%琼脂糖凝胶电泳，验证是否获得1.1kb、1.1kb及849bp的目的基因片段。

用DNA胶回收试剂盒回收产物，-20℃保存。

4 限制性片段长度多态性分析(restriction fragment-length polymorphism,RFLP)胶回收产物5ul，spaP-a用内切酶HaeⅢ 1ul(10u/ul)，spaP-pv及spaP-c 用内切酶Alu I 1ul(10u/ul)，10×酶切缓冲液2ul, 纯水补足总体积至20ul。

混匀, 37℃水浴24h, HaeⅢ 80℃水浴20m终止酶切反应，Alu I 65℃水浴20m 终止酶切反应。

6%PAGE胶垂直电泳证实酶切彻底，比较各菌株的酶切电泳图谱。

5 核苷酸序列测定变链菌临床株扩增产物spaP-pv经Alu I酶切后，出现的a、b 2种基因型菌株在不同粘附力菌株的分布不同。

选取19株菌株，包括a基因型10株，b基因型9株，委托上海基康生物技术有限公司纯化其spaP-pv的PCR产物，以扩增引物为测序引物，双向测定核苷酸序列。

结果1 PCR扩增产物电泳结果以变链菌全基因组DNA为模板，分别扩增出1.1kb、1.1kb及849bp的目的片段，分子量与预计的相同。

扩增产物电泳结果为单一条带，未见任何杂带，表明扩增特异性高。

2 RFLP分析2．1 spaP-a的RFLP分析变链菌临床株的扩增产物spaP-pv经Alu I酶切后，为6%PAGE胶垂直电泳证实，共呈现4种基因型a﹑b﹑c﹑d（图1）,各种类型在高﹑低粘附力的菌株中所占例数见表1。

经双侧X2检验，各种基因型在不同粘附力菌株的分布无统计学意义（P﹥0.05）。

M: Gene RulerTM 100bp DNA Ladder; 1-11为变链菌临床株(1﹑4﹑5 ﹑6为c型;2﹑8﹑11为b型; 3 ﹑9﹑10为d型; 7为a型)图 1 变链菌临床株spaP-a(473-1571bp)为Hae III酶切后的电泳图表1 不同粘附力变链菌（血清型c）spaP-a(473-1571bp)的PCR-HaeⅢ基因型分布菌株例数基因型分布a b c d高粘附力 22 2 9 8 3低粘附力 22 1 18 1 22．2 spaP-pv的RFLP分析据clone3.1 version软件分析，变链菌NG5 spaP-pv(2060-3157bp)经Alu I酶切后可观察到8条片段。