线粒体蛋白组学图谱

• D:生物素化标记线粒体基质蛋白的凝胶电泳 分析，前（泳道1-3）和后（泳道4-6）链霉 素亲和珠的丰富度。样品在（B）中被标记。 生物素-苯酚和过氧化氢是酶作用物。哺乳动 物细胞有4个内源性生物素化的蛋白，其中 通过链霉亲和素电泳后，3个蛋白在阴性泳 道（2和3）中被观察到。

• E：电子显微镜下的人类胚胎肾细胞表达线 粒体-工程抗坏血酸过氧化物酶（mitoAPEX）。过氧化氢和二氨基联苯胺的固定 细胞作为电子显微镜的对照组。工程抗坏 血酸过氧化物酶（APEX）能催化二氨基联 苯胺的聚合物变成一个特定的产物，随后 用电子致密的OsO4（5）进行染色。在线 粒体基质中，明暗对比明显，但并非在线 粒体膜间隙。
摘要
• 显微镜和质谱是两种互补的技术：前者在 活细胞内提供时间与空间上的信息，但是 这种技术在同一时间内只能看到极少的重 组蛋白。然而，后者能探测到成千上万的 内源性蛋白，不过这种技术仅仅使用于被 溶解的细胞样品（死细胞）中。在这，我 们将介绍一种技术。这种技术结合了上述 两种技术的优势，为活细胞内的内源性蛋 白的蛋白质图谱提供了空间与时间上的解 决方案。
• 我们的方法依赖于基因定位的过氧化物酶，这些 酶与邻近的蛋白质进行生物素化 ，随后被纯化和 质谱鉴定。我们用这种方法识别了人类线粒体基 质中495种蛋白，包括31种以前认为与线粒体无 关的蛋白质。这种标定方法很特别，而且能够很 好地辨别位于线粒体基质、线粒体膜间腔及线粒 体内膜上的内膜蛋白。一些蛋白以前被认为存在 于线粒体膜间腔或者线粒体外膜上，包括原卟啉 原氧化酶 ，经过我们的蛋白质组学数据分析，它 被重新认定存在于线粒体基质中，并且得到了电 子显微镜证实。
• 在活细胞中的过氧化物酶介导的蛋白质图 谱的特异性，与它的容易使用性相互结合， 为生物学家认识活细胞的分子组成提供了 强有力的工具。
原卟啉原氧化酶（PPO）
在分子氧存在的条件下，原卟啉原氧化酶 催化无色的原卟啉原IX，失掉6个电子生成 共轭的光敏性物质原卟啉IX。在动物与真菌 中，它一般位于细胞的线粒体内；而植物 体中，存在两种同工酶，其中一种位于线 粒体内，另一种位于叶绿体内。它是叶绿 素和亚铁血红素相同生物合成步骤中的最 后一个酶。
• 为了检验工程抗坏血酸过氧化物酶（APEX）能否 用于蛋白质组学的标记中，我们把工程抗坏血酸 过氧化物酶（APEX）靶定于人类胚胎肾细胞 （HEK）的线粒体基质中（mito-APEX），在细 胞培养基中通过加入生物素-苯酚和1毫摩尔的过 氧化氢开始标记，最终通过细胞固定或裂解一分 钟后结束标记。通过共聚焦显微镜成像或者随机 光学重组显微镜观察，我们发现生物素化的蛋白 质与线粒体- APEX复合结构之间存在紧紧的重叠 部分。对细胞裂解物进行链霉亲和素印迹分析， 表明许多内源性蛋白以APEX-和过氧化氢-依赖性 的方式进行生物素化结合。
• 一种候选酶是混杂的生物素连接酶，但这 种酶的标记速度极其缓慢（需要24小时）。 通过一种半衰期只有几分钟的生物素-腺苷 酸酯，可以使这种被提出的机制得以继续 进行，但生物素-腺苷酸酯标记半径很大。 （所以蛋白质比较远）另一种可能的候选 酶是催化氮烯产生的辣根过氧化物酶，但 是我们无法检测到这种标记，而且在哺乳 动物的胞质溶胶中，辣根过氧化物酶无活 性。
正文
• 为了避免蛋白质组学在传统质谱技术中存 在细胞器纯化相关的一系列材料损耗及一 定的特异性，我们寻求发展一种新方法。 我们的方法包括标记连接像生物素这样的 化学手柄的蛋白质，同时细胞仍活着，全 部的膜、复合体及其空间关系都未被破坏。 （在活细胞内标记连接生物素的蛋白质） 因此，在活细胞内，我们需要有一个基因 定位的标记酶，这个酶能与它的相邻物进 行共价结合，且此酶与蛋白质距离不远。
• 为了对工程抗坏血酸过氧化物酶（APEX） 的这种小分子特性进行特征性分析，我们 进行了另外的苯酚氧自由基的膜透性实验， 以及这些共价结合物与氨基酸在体外形成 反应实验（请参照补充材料和方法）
图一：在活细胞内标记线粒体基质蛋白质组
• A:标记计划。将工程抗坏血酸过氧化物酶（APEX） 靶定于线粒体基质中，通过融合作用，连接到一 个24-氨基酸的目标肽上。在活细胞内，通过加入 生物素化的苯酚和过氧化氢，开始标记一分钟。 随后进行细胞裂解。生物素化的蛋白质通过与被 链霉亲和素包被珠回收，洗脱，在凝胶上分离， 并由质谱鉴定。过氧化物酶生成的苯酚氧自由基 的寿命很短，而且不能透过膜。因此，它只能与 相邻物质进行共价标记，不能与有一定距离的内 源性蛋白结合。
• 最近，我们产生了一种工程抗坏血酸过氧化物酶 （APEX），让它作为电子显微镜的一种遗传标记。不像 辣根过氧化物酶，工程抗坏血酸过氧化物酶在所有活细胞 内都是有活性的。另外，工程抗坏血酸过氧化物酶不仅能 催化用于电子显微镜对照的显色底物二氨基联苯胺的过氧 化氢-依赖性的聚合物，而且能氧化众多苯酚衍生物，从 而产生苯酚氧自由基。这种自由基的寿命十分短暂（<1毫 秒），它们的标记半径很小（<20纳米），而且它们能和 酪氨酸、色氨酸、组氨酸及半胱氨酸等富电子氨基酸进行 共价反应，这种化学反应构成了酪胺信号放大效应的基础， 但它还并没在活细胞中得以应用。
• 为了测试这种方法的一般性，我们也分析 了在不同细胞区域内进行靶定工程抗坏血 酸过氧化物酶（APEX）的其他构建复合体 结构。在链霉素亲和酶印迹分析中，面向 细胞质的7种不同的工程抗坏血酸过氧化物 酶（APEX）融合体存在独特的“指纹”， 这表明工程抗坏血酸过氧化物酶（APEX） 仅仅和一小部分胞质蛋白进行了生物素化， 可能这些工程抗坏血酸过氧化物酶（APEX） 就在那些胞质蛋白附近。
• 一些蛋白以前被认为存在于线粒体膜间腔 或者线粒体外膜上，包括原卟啉原氧化酶 ， 经过分析，重新认定于线粒体基质中。
• B:生物素。（B）按照（A）过程，在标记人类胚 胎肾细胞表达线粒体-工程抗坏血酸过氧化物酶 （mito-APEX）后，生物素化的蛋白（进行中性 亲和素染色）进行共焦荧光成像。我们通过有目 的的性地去除生物素-苯酚或过氧化氢对实验进行 控制。 • C:DIC，微分干涉对比。（C）按照（B）过程， 超分辨率（STORM）成像系统显示：链霉亲和素 和工程抗坏血酸过氧化物酶（AF405/AF647）被 定位在U2OS细胞的22纳米分辨率位置上。样品 在（B）中被反应出来。