生化工程,第三章固定化酶反应动力学
生化反应工程酶促反应动力学课件ppt1
1 Km 1 1 r rmax [S ] rmax
则
1 23.1 1 1.98
r
[S]
Vmax
1 1.981
0.505
(mmol/L min)
Km 23.100 0.505 11.661 (mmol/L)
操作参数对酶促反应的影响
pH对酶反应速度的影响
① pH改变可破坏酶的空间构象，引起酶活的丧失。 ② pH的改变影响酶活性中心催化基团的解离，从而
d[ S ] 难以被化学物质或蛋白酶等破坏
VS0为在外扩散速率很快时的最大的反应速率。
r “经典”酶学理论：酶→蛋白质。 dt 2、提高底物浓度可消除竞争性抑制。
c、酶的高级结构变化；
内部因素（酶的结构等）
• 若用单位时间内生成物浓度 把酶包在超薄半透性的聚合物膜中，制成球状含酶微型胶囊。
a ——传质比表面积；
对rmax和Km的确定的方法有：
当[S]>>Km时，
，属零级反应。
诱导契合模型（Induced-Fit Model）
r d[dPt ] k k [Ek ][S[]S ] Kr [[SS]] 未均底 c、反相物酶应 酶 传的时促递高酶反至级的应载结失动体构活力外P变动学表化力：面；学酶；与底物的作用方式12、影响02酶促反应的因素、单Pmm底a物x酶促反应动力学方程的推导。
①零级反应
反应速率与底物的浓度无关，称为零级反应。
d[s] dt
rmax
（[S]-底物浓度，rmax-最大反应速率）
酶促反应动力学分类----反应级数
②一级反应
反应速率与底物浓度的一次方成正比，称为一级反应。 即酶催化A→B的过程。
d [S] r dt k1[S]
生化反应工程
生化反应工程1.生物技术产品的生产过程主要由哪四个部分组成？答：1）原材料的预处理（2）生物催化剂的制备；（3）生化反应器及其反应条件的选择和监控；（4）产物的分离纯化。
2.什么是生化反应工程,生化反应工程的研究的主要内容是什么?定义：以生化反应动力学为基础，运用传递过程原理及工程学原理与方法，进行生化反应过程的工程技术分析、开发以及生化反应器的设计、放大、操作控制等综合边缘学科。
主要内容：建立生物反应过程动力学和生物反应器的设计，优化和放大。
3. 生化反应工程研究方法.经验模型法、半经验模型法、数学模型法；多尺度关联分析模型法（因次分析法）和计算流体力学研究法。
.在建立生物反应过程数学模型时，常按下述几个步骤进行： （1）反应过程的适当简化；（2）定量化研究； （3）过程分离原理；4）数学模型的建立。
理想的模型建立通常要考虑的因素1.要明确建立模型的目的2.明确地给出建立模型的假定条件3.希望所含有的参数，能够通过实验逐个确定4.模型应尽可能简单。
第1章 酶催化反应动力学1.有高效的催化活性2.有高度的专一性3.酶反应常需要辅因子的参与4.具有温和的反应条件5.酶的催化活性可被调控6.酶易变性与失活酶反应专一性机制：锁钥学说，诱导契合学说，过渡态学说。
什么叫抑制剂？任何能直接作用于酶并降低酶催化反应速率的物质称为酶的抑制剂1.M-M 方程的建立： E + S 11k k - [E 2k −−→E + P （1）快速平衡假设：2[],p ES r k C =11[],E S ES k C C kC -=[],EO E ES C C C =+得2m axE O S SP S SS S k C C rC r K C K C ==++（2）拟稳态假设：11[]2[]0E S ES ES k C C kC k C ---=得2m axEO S SP m Sm S k C C rC r K C K C ==++2. M-M 方程参数的确定：m ax20E rk C =，mK（1）微分法：* L-B 法 ：m axm ax111m SSK r rC r =+* E-H 法：m axss mSr r rK C =- H-W 法：m axm axSm S sC K C r rr=+E-C-B 法：m ax1m sSrK r C =+（2）积分作图法：m ax0m()lnSO S S S C r t C C KC =-+一级反应时，m axmlnSOSC rt K C = 零级反应时，max 0()S S r t C C =-3.有抑制的酶催化反应动力学----由方程推机理，抑制方式（1）竞争性抑制：E + S 11k k - [ES 2k −−→E + PE + I 33k k -−−−→←−−−[EI] 得m ax *SSI Smr C r KC =+，I *m IC 1+)K K mK=（（2）非竞争性抑制：E + S 11k k - [E2k −−→E + P ，E + I 33k k -−−−→←−−−[EI]， [ES] + I 4-4k k −−−→←−−−[SEI] , [EI] + S 5-5k k −−→←−− [SEI] 得 *max s m I SSr C r K C =+，I *m ax m ax I C /1+)K r r =（ （3）反竞争性抑制：E + S 11k k - [E2k −−→E + P ，[ES] + I 33k k -−−−→←−−−[SEI] 得m axI m IC 1+)K SSI S rC r K C =+（（4）底物抑制：E + S 11k k - [ES2k −−→E + P ，[ES] + S 33k k - [SES]得m axm 1+)SSS s S SIrC r C K C K =+（，,m axS C =4.双底物酶催化反应（了解）：S 1 + S 2 P 1 +P 2(1)随机机制：E + S 1 11k k - [ES 1]， E + S 2 2-2k k −−−→←−−−[ES 2]， [ES 1] +S 2 12k [ES 1S 2], [ES 2] +S 1 21k [ES 1S 2],[ES 1S 2]K−−→E +P 1+P 2 (2)乒乓机制: E + S 1 11k k - [ES 1]−−→ P 1 +E’,E’ + S 2 2-2k k −−−→←−−−[E’2] −−→ E +P 2(3)顺序机制：E + S 1 11k k - [ES 1]，[ES 1] +S 2 2k −−−→←−−−[ES 1S 2]，[ES 1S 2]3k −−→ E +P 1+P 2 5.酶的失活动力学：E adrk k −−→←−−E i()[]d r E O k k E a r d d rC tC k k ek k -+=++， 若为不可逆失活，Kr=0，0dK Ea E tC C e-=,K d =1/t d =ln2/t 1/2，K d 为衰变常数，t 1/2为半衰期第2章 细胞反应过程计量学1. 呼吸商：在一定时间内放出的二氧化碳量和消耗的氧气量的比 。
3第三章酶催化反应动力学
v0
k2
[E0 ][S ] [S] Ks
vmax k2[E0 ]
v0
vmax[S ] [S] Ks
v0
vmax [S0 ] [S0 ] Ks
v0
vmax [S0 ] [S0 ] Ks
1.当 [S] 时K,s 应特征。
v0 vm，[aSx[表]S ]现 v出max零级反
2系.当，[表S]现时出K，一s 级反v0应，特vmKa征x与[sS。] 成v正0 比关[S]
[
S0
]
v
Vmax (不 变 )
Vmax/2
加 竞争性 抑 制 剂
[I]增 大
加 竞争性 抑 制 剂
Km K'm
[S]
1
1
Km Km(1[I]/ Ki )
1 V max
1 v
=
Km (1+ Vmax
[I]) 1 + 1 Ki [ S ] Vmax
竞争性抑制作用的特点
抑制剂和底物竞争酶的结合部位 抑制程度取决于I和S的浓度以及与酶
E S k1 ES K2 E P k1 d[ES] 0 dt
或者
d[ES dt
]
k1[
E][S
]
(k1
k2
)[
ES
]
0
k1[E][S] k1[ES] k2[ES]
[ E ][S ] [ ES ]
k1 k2 k1
km
[E] [E0 ] [ES]
([E0
]
[ ES ])[S ] [ ES ]
SH CH2S
二巯基丙醇
例2： 羟基酶的抑制
羟基酶: 以丝氨酸侧链上的羟基为必需基团的酶 有机磷(敌百虫、敌敌畏、对硫磷)不可逆抑制羟基酶的活性中心
生物反应器工程课件-3
酶固定化原因： 游离酶不易回收，易污染产物溶液； 固定化有益酶热稳定性； 为使用固定床和流化床反应器提供条
固定床 开始流态化 均匀流态化 颗粒飞出
(a)上行流动方式
(b)下行流动方式
分布板 流体 低流速 流体 流体 流体 高流速
图31-17 固定床反应器流动方式
图31-18 固定床到流化床的过渡过程
不同速率表示法及其参数的意义： 固定化作用 空间效应 游离酶 分配效应 本征动力学和参数 扩散作用
固有（本征）速率和参数 rmax c S 0 rp = K m + cS 0 r c ηT × max S 0 有效速率和参数 K m + cS 0 表观速率和动力学参数 rmax c S 0 K m + cS 0
注意：CSi表示颗粒表面底物浓度 在稳定态：
k L a (c S 0 − c Si ) = rmax c Si K m + c Si
方程求解的无因次化——减少变量： c S = c Si c S 0
K = K m cS 0
rmax Damköhler Da = k L ac S 0 丹克莱尔准数：
cS 1 − c S = Da K + cS 解得
应用实例与前景： 固定化青霉素酰化酶生产6－氨基青霉烷酸； 分子酶工程的相关过程工业化 3.1 固定化酶反应动力学特征 Rp(固定化酶本征动力学，传质与扩散速率） 3.1.1 固定化方法 3.1.2 固定化对动力学特性的影响 （1）活性的下降（表观米氏常数增加）； （2）热稳定性的增加
3.1.3 影响固定化酶反应动力学的因素 （1）空间效应 来源：酶分子的构象改变 （2）分配效应 基本概念：微环境、大环境（主体溶液） 分配效应结果：动力学常数相对游离酶而变 c Sg 分配系数 K = c Si （3）扩散效应
3.固定化生物催化剂反应过程动力学
(2) 分配效应（微环境效应）：当固定化酶处在
反应体系的主体溶液中时，反应体系成为固液非均相 体系。由于固定化酶的亲水性、疏水性及静电作用等 引起固定化酶载体内部底物或产物浓度与溶液主体浓 度不同的现象。
第十四页，编辑于星期四：十点 五十七分。
静电效应的影响为例讨论分配效应对酶催化动力 学的影响。
第三十页，编辑于星期四：十点 五十七分。
`
第三十一页，编辑于星期四：十点 五十七分。
2 底物抑制
第三十二页，编辑于星期四：十点 五十七分。
第三十三页，编辑于星期四：十点 五十七分。
3 产物抑制
第三十四页，编辑于星期四：十点 五十七分。
[例3-1]某酶固定在无微孔的球载体上，在无外扩散
时测得rmax=4×10-5mol/L，Km=2×10-5mol/L，将其 放在一底物浓度为1×10-5mol/L液相反应器中，已知 体积传质系数为4×10-1/s。求(1)底物在固定化酶外表 面上的反应速率 (2) 该固定化酶的外扩散有效因子
Cs＝Csi/Cs0， K Km/Cs0 Da rmax
kLaCs0
1Cs＝Da Cs KCs
第二十四页，编辑于星期四：十点 五十七分。
Da：Damkohler，丹克莱尔数
最大反应速率 Da 最大传质速率
当Da《1时，酶催化最大反应速率要大大慢于 底物的扩散速率，此时该反应过程为反应动 力学控制。 当Da 》1时，则底物最大扩散速率要大大慢 于酶催化底物的反应速率，此时该反应过程 为传质扩散控制。
第二十三页，编辑于星期四：十点 五十七分。
过渡区宏观反应速率Rsi的求解 （1）由Csi值确定Rsi
kLa(C s0C s)iK rm m aC C xssii
霉学 第三章 固定化酶
二、固定化酶的制备方法
• (一) 吸附法 • （二）包埋法 • （三）共价结合（偶联）法 • （四）交联法 • （五）四种固定化酶制备方法的特点小结
Hale Waihona Puke 固定化酶的制备方法的选择• 固定化酶的制备方法、制备材料多种多样， 不同的制备方法和材料，固定化后酶的特 性不同。对于特定的目标酶，要根据酶自 身的性质、应用目的、应用环境来选择固 定化载体和方法。
（2）酶与载体必须有一定的结合程度。酶的固 定化既不影响酶的原有构象，又能使固定化酶 能有效回收贮藏，利于反复使用。
（3）固定化应有利于自动化、机械化操作。这 要求用于固定化的载体必须有一定的机械强度， 才能使之在制备过程中不易破坏或受损。
（4）固定化酶应有最小的空间位阻。固定化应 尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高催化效 率和产物的量。
世界第一例获得工业应用的固定化酶是 DEAESephadex A-25吸附的氨基酰化酶反应用于
DL-AA的光学分析。
（二）、包埋法
1、凝胶包埋法（胶格包埋法）：
将酶分子包埋在高聚物网格内的包埋方法。 聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法 ：
先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的 酶混合，然后加入聚合催化系统使之开始聚合，结果就 在酶分子周围形成交联的高聚物网络。它的机械强度高， 并可以改进酶脱落的情况，在包埋的同时使酶共价偶联 到高聚物上，可以减少酶的脱落。
固定化酶
（Immobilized Enzyme）
酶在水溶液中不稳定，一般不能反复使用，而 且不易与产物分离，不利于产物的提纯和精制。
针对这些限制酶广泛应用的因素，将水溶性酶 或游离细胞经过化学或物理手段处理，将酶束缚 在一定的空间内，限制酶分子在此区间进行活跃 的催化作用，成为不溶于水的固定化的酶。
酶的固定化和固定化酶反应动力学
引聚剂：
过硫酸铵、核黄素
（3）制备的固定化酶
凝胶或膜 聚丙烯酰胺凝胶
淀粉 琼脂
酶 α、β－淀粉酶 葡萄糖氧化酶 乳酸脱氢酶 胆碱酯酶 青霉素酰胺酶
2 微型胶囊法 （1）原理 把酶包在超薄半透性 的聚合物膜中，制成 球状含酶微型胶囊。
（2）特点
微囊直径几微米～几百微米。 低分子底物可以自由通过并进入微囊内。 与酶反应后的生成物被排除在微囊外， 酶本身是高分子物质不能通过微囊而被留在微囊中， 外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内
2 共价交联法
双功能试剂与酶蛋白质中的氨基酸残基作用，使
酶与酶之间交联成网，凝集成固定化酶.
常用的是戊二醛
O O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
发生作用的氨基酸残基
：
酪氨酸的酚基 胱氨酸的SH巯基 N－末端的a－氨基。
常用的双功能或多功能试剂：
戊二醛 聚甲叉双碘乙酰胺 双重氮联苯胺
包埋方法有两种： •格子型固定化酶
•微型胶囊法
•格子型固定化酶
（1）原理
以丙烯酰胺、硅胶、淀粉琼脂等材料，在酶存 在下聚合成凝胶，酶被包埋在聚合物的细小多孔的 网状格子中。反应为厌氧反应。
（2）方法（以丙烯酰胺为材料是最常用的方法）
丙烯酰 胺
固定化 酶
光照 切 割 聚合反应 凝胶酶块
酶液
N，N－ 双丙烯 酰胺
（3）微型胶囊法优缺点
优点： A 制备条件温和，制得的胶囊不易变化。
B 能很好地保存天然酶的活性和特性。 C 大小可任意调节，制备时间短。
缺点： 单体很活跃。在胶囊化过程中要充分注意防
治酶的失活和变性。
固定化酶的制法及其特性比较
生化反应工程酶促反应动力学
d[ S ] r dt
• 若用单位时间内生成物浓度 的增加来表示，则：
r d[ P ] dt
2.2.1.4酶促反应动力学分类----反应级数
①零级反应 反应速率与底物的浓度无关，称为零级反应。
d [ s] rmax dt
（[S]-底物浓度，rmax-最大反应速率）
E ＋ S
k1
k-1
ES
k2
E ＋ P
稳态学说
稳态学说的几点假设条件： 1. 底物浓度[S]远大于酶的浓度[E]，因此[ES]的形成不会降
低底物浓度[S]，底物浓度以初始浓度计算。
2. 在反应的初始阶段，产物浓度很低，P+E→ES这个可逆反应
的速率极小，可以忽略不计。
3. [ES]的生成速率与其解离速率相等，其浓度不随时间而变 化。
• 当底物接近酶 的活性中心并 与之结合时， 酶的构象能发 生改变，更适 合于底物的结 合。
2.2.1.2影响酶促反应的因素
浓度因素（酶浓度，底物浓度，产物浓度等） 外部因素（温度，pH，压力，溶液的介电常数，离子 强度等） 内部因素（酶的结构等）
2.2.1.3反应速率及其测定
• 反应速率：单位时间内反应物或生成物浓度的改变。
酶量守恒 产物生成速率 动力学方程
KS
[E0 ] [E] [ ES ]
rP k2 [ ES]
rP rP max[ S ] K S [S ]
rP rP max[ S ] K m [S ]
与 Km
k K S 1 k1
k1 k 2 Km k1
动力学参数的求解
(9)
k 2 [ E0 ][S ] rP max[ S ] d[ P] rP k 1 k 2 dt [S ] K m [S ] k1