实验方案-细胞表型检测
医学细胞生物学实验
细胞凋亡诱导与检测
细胞凋亡检测
细胞凋亡诱导
自噬诱导
通过饥饿、药物刺激等手段诱导细胞自噬，以研究自噬的生物学意义和作用机制。
自噬检测
采用荧光染色、电镜观察、蛋白质印迹等方法检测自噬体的形成、数量和相关蛋白的表达。
自噬诱导与检测
03
02
01
实验原理
实验设计
根据实验目的和原理，设计具体的实验方案和操作流程。
实验操作
按照实验方案进行实验操作，包括细胞培养、显微观察、分子生物学检测等步骤。
数据收集与分析
收集实验数据，进行统计分析，得出实验结果。
结果汇报与讨论
将实验结果以书面形式汇报，并进行讨论和总结。
实验步骤
02
细胞培养
CHAPTER
利用免疫荧光染色、荧光共振能量转移等技术，可以检测和定位细胞内特定信号分子的分布和动态变化，进而揭示其在信号转导中的作用机制。
详细描述
总结词
信号转导抑制剂的应用
总结词：信号转导抑制剂是一类能够干扰细胞信号转导过程的化合物，具有潜在的治疗作用。
07
细胞凋亡与自噬研究
CHAPTER
通过使用化学物质、射线、病毒等手段诱导细胞凋亡，以研究其发生机制和生物学意义。
电子显微镜
利用电子束代替可见光，观察细胞超微结构。
显微镜观察
通过显微镜或细胞计数板，统计细胞数量。
细胞计数
利用染色剂或荧光染料，检测细胞活性，如MTT法、染色排除法等。
细胞活力检测
细胞计数与活力检测
利用染色剂对细胞进行染色，以便观察细胞形态和结构。
染色技术
细胞表型分析标准操作规程
【范围】：
【责任】：
【内容】：
将鼠抗人CD54、CD11a、CD28、检测用CD3、HLA-DR、CD86、CD80、CD3CD56抗体及其相应的阴性对照IgG1K-FITC、IgG1K-PE、IgG1-FITC、IgG1-PE各20Ll,分别加入FCM专用试管内。取培养20天的CIK细胞,用无钙镁PBS洗2次后,各取1@106/015ml,分别加入相应的FCM管中,4e避光孵育30min,每10min摇晃1次,使细胞与抗体充分接触。用PBS洗2次,采用BD公司FACSCAN/STArplus/so型流式细胞仪检测。
北京汉氏联合生物技术有限公司
文件编码
SMP-EP-PC-006-00
文件页数
共2 页
文件名称
细胞表型分析标准操作规程
执行日期
颁发部门
研发部
分发部门
研发部
起 草 人：张斯琴
起草日期：
审 核 人：
审核记载
修 订 号 批准日期 执行日期
变更原因及目的：
细胞表型分析标准操作规程
实验方案细胞表型检测
CD44- FITC BD公司 货号：
CD31- FITC BD公司 货号：
IgG-PE BD公司 货号：555749
CD11b-PE
BD公司
货号：
555483CD45-PEB源自公司货号：555388
CD73-PE
BD公司
货号：
550257
CD90-PE
3、用流式细胞仪检测荧光值,每管计数3000-10000个细胞；
4、分析数据。
1.3
（一）开机
1、 启动控制计算机，进入软件，此时信号灯为红灯，显示还没有与C6连 接。
2、检查四个液体容器，如有需要，则先充满液体或清空废液。
3、启动C6前方的电源按钮，此时信号灯变为黄色，显示C6正在启动，等 待3分钟左右直至信号灯变绿，显示C6已经连接并就绪。
4、在载物台上放置一个空管， 点击控制Backflush按钮， 可以看到少许液 体流出来。
5、在96孔样品格中任选一孔， 载物台换上去离子水， 选择高速，10分钟， 点击RUN（激光器预热）
6、该孔因为收集了数据变成蓝色，点击Delete Sample Data删除。至此 启动步骤已完成，可以开始检测样品。
BD公司
货号：
555596
CD105-PE
Serotec
公司
货号：MCA1557PE
HLA-DR-PE BD公司
货号
：555812
CD29-PE
BD公司
货号：
1.1.3主要仪器
CO2培养箱
离心机 超净工作台 显微镜
1.1.4主要耗材
50ml离心管、5ml/10ml移液管、1.5ml EP管。
细胞表型实验介绍ppt
2020/2/8
18Байду номын сангаас
4.细胞增殖（克隆形成）
单个细胞在体外增殖6代以上（时间约1周以上），其后代所组 成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞， 大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力强弱。 细胞培养环境的改变或药物、基因等外源性因素的作用能导致细胞 克隆形成能力以及细胞集落的大小发生改变。
细胞感染
克隆形成
细胞固定
克隆计数
细胞染色
2020/2/8
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5.细胞生长（MTT法）
MTT法原理
MTT比色法：是一种检测细胞存活和生长的方法。 原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的 蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。 二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪490nm波 长处测定其吸光值，可间接反映活细胞数量。
2020/2/8
8
荧光信号与细胞特性
荧光染料被激发而发射的光信号。
定量染色 荧光信号大小 被标记组分含量的定量
多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量
2020/2/8
9
激光束 侧向散射光， 荧光
细胞
前向散 射光
收集透镜
二色镜
1
2
3
带通滤波片 光电倍增管
2020/2/8
10
流式结果分析
散点图
密度图
细胞表型实验介绍
2018
2018年8月30日
目录
1. 研究内容目的与意义 2. 实验原理 3. 实验过程 4. 结果分析
2020/2/8
2
细胞表型实验
免疫细胞表型检测的方法
免疫细胞表型检测的方法
免疫细胞表型检测的方法主要包括流式细胞术、免疫组化、免疫印迹、免疫荧光等技术。
其中，流式细胞术是最常用的技术之一。
它通过标记不同的抗原，使不同种类的免疫细胞在荧光染色后产生不同的信号，再通过流式细胞仪对这些信号进行检测和分析。
流式细胞术具有高通量、高灵敏度、高分辨率等优点，能够同时分析多个细胞表面分子的表达情况，可用于分析免疫细胞亚群的分布、测定细胞表面分子的表达量和分子结构等。
但是，其结果受到样本制备、实验条件等多种因素的影响，需要严格控制实验条件，保证结果的准确性和可重复性。
免疫细胞表型检测的方法在免疫学研究、疫苗开发、临床诊断和治疗等方面具有广泛应用。
例如，在肿瘤治疗中，流式细胞术可用于鉴定和分离肿瘤免疫细胞，评估肿瘤免疫监视功能，指导肿瘤免疫治疗策略的选择和调整。
在感染性疾病的诊断中，免疫组化、免疫印迹等技术可用于检测病原体的抗原或抗体，加强病原体的鉴别和定量分析。
- 1 -。
流式细胞仪细胞表型分析
流式细胞仪细胞表型分析近年来，流式细胞仪凭借其高效准确的细胞表型分析能力，成为生物医学研究和临床诊断中不可或缺的仪器设备。
本文将介绍流式细胞仪的基本原理、使用方法以及在细胞表型分析中的应用。
一、基本原理流式细胞仪利用流体动力学和光学原理，实现对单个细胞的快速、准确分析。
其基本原理可概括为：将细胞悬浮液通过细长的柱状流动池，使细胞以单个颗粒的形式流过光源，光源照射在细胞上后，被激发的荧光和散射信号被光电倍增管接收并转化为电信号，最终通过电子学系统分析和记录。
二、使用方法1. 仪器准备：确保流式细胞仪处于正常工作状态，检查流体通路是否畅通，校正并调节光路。
2. 细胞样本制备：根据实验要求，选择并处理相应的细胞样本。
常见的样本处理包括细胞染色、标记和固定等，以增加细胞的可检测性。
3. 参数设置：根据实验需求，设置相应的参数，如激发波长、光敏元件的灵敏度和门限等。
4. 仪器清洗：使用流式细胞仪专用清洗液进行清洗，避免样本间的交叉污染。
5. 实验操作：将处理后的细胞悬浮液注入仪器流动池，并按照设定参数进行实验操作。
6. 数据获取与分析：流式细胞仪将采集到的信号转化为数字信号并存储，利用相应的软件进行数据分析、细胞计数、细胞分类、细胞周期分析等。
三、在细胞表型分析中的应用1. 免疫表型分析：通过选择性标记细胞表面或细胞内的免疫标记物，如细胞膜受体、蛋白质和胞内信号分子等，可以对免疫细胞的种类、活性和功能进行准确分析。
2. 细胞周期分析：通过标记细胞核的DNA含量，流式细胞仪可以对细胞的周期进行准确测定，包括G0/G1、S和G2/M期等，从而揭示细胞分裂、增殖和凋亡等过程。
3. 细胞凋亡检测：通过荧光标记细胞凋亡相关的指标，如磷脂外翻、DNA断裂和半胱氨酸蛋白酶活性等，流式细胞仪可以对细胞凋亡的程度和机制进行精确分析。
4. 细胞表面标记物表达分析：通过选择性标记细胞表面的特定抗原，流式细胞仪可以对细胞亚群和表面标记物的表达进行定量和定性分析，如免疫表型分析和肿瘤细胞表面标志物检测等。
细胞表型实验
细胞表型实验前提：设计实验组和对照组目的：研究肿瘤细胞表型特征或在特定情况下（相关基因或蛋白改变）肿瘤细胞的表型变化。
内容：细胞凋亡、周期、迁移、侵袭、迁移、趋化、增殖、生长等。
1.细胞凋亡➢概念：是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制的控制自动结束生命的过程。
➢实验方法：检测试剂盒和细胞流式。
➢注意点：进行细胞凋亡实验时，要用不含EDTA的胰酶进行消化。
磷脂酰丝氨酸（PS）正常位于细胞膜内侧，但在细胞凋亡早期，PS可以从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境。
Annexin V是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。
将Annexin V进行荧光素FITC标记可以用流式细胞仪进行检测。
胰酶中的EDTA能够螯合钙离子，从而削弱Annexin V结合效率，对凋亡实验造成不可控影响。
因此实验时，需要另外购买不含EDTA的胰酶，不能直接使用实验室现有的胰酶。
2.细胞迁移➢目的：测定肿瘤细胞的运动特性方法之一。
➢原理：体外培养单层细胞，人为制造空白区域——“划痕”，细胞逐渐进入空白区使划痕愈合。
➢实验方法：1）培养板接种细胞之前先用marker笔在培养板背面画横线标记（方便定位同一个视野）。
2）Day1, 种板，数量以贴壁后铺满板底为宜（也可在划痕前做其它处理如转染、感染）。
3）Day2，细胞铺满板底后，用10ul枪头比着直尺，垂直于孔板制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致。
4）用PBS冲洗孔板三次，去除划痕产生的细胞碎片，加入有血清/无血清培养基。
注意点：✧根据不同细胞系的贴壁情况，选择是否立刻用PBS清洗。
例如转染后的huh7细胞系划痕后易飘起。
✧关于有血清/无血清培养基的选择：当划痕实验周期比较短的时候（小于48h），或者不考虑增殖对实验造成的影响，可以用有血清培养基培养。
当划痕实验周期比较长的时候，用无血清或者低血清或者用放线菌酮抑制细胞增殖。
5）将培养板放入培养箱培养，每隔8-12小时（至少一天2次）取出拍照。
T细胞表型及脾细胞分离
实验步骤
标本的制备：淋巴细胞悬液的制备 标本的染色：
结果的观察：
标本制备：淋巴细胞悬液的制备
（1）取肝素抗凝血5ml与5ml Hank’s液稀释混匀，每组取2ml，用 滴 管 贴 管 壁 轻 轻 叠 加 于 2ml 分 离 液 上 ， 配 平 后 1500rpm 离 心
10mins。
（2）洗涤细胞：用滴管仔细吸出位于血浆和分离液之间乳白色的
淋巴细胞，放入盛有2ml Hank’s液的试管，1500rpm离心10mins，
弃上清，将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入 Hank’s 液重复洗涤
一次，最后一次用PBS洗涤。 下一次实验检测T细胞亚群用。
（3）弃去上清，淋巴细胞沉淀用 200μlPBS溶解，取20μl细胞涂片，
标本染色
细胞涂片用记号笔划圈，滴固定液1滴，室温固定2～3分钟。 滴加鼠抗人CD3、CD4、CD8抗体15μL，轻轻摇晃，使单抗均
③弱阳性：细胞表面呈淡红色，可见淡兰色细胞核；
④阴性细胞：细胞表面无着色反应，呈淡兰色。
注意事项：
为防止试剂受到污染，加样器吸头最好为一次性使用。
分离单个核细胞中，将稀释血液加于分层液上时，务必要使之 形成良好的界面，否则影响分离结果。
孵育过程中，应将涂片置于湿盒中，操作中始终要注意保持涂
片的湿润，以确保得到完美的实验结果。 淋洗时不要直接对着细胞冲，避免细胞脱落。 淋洗后，加试剂前须擦干细胞圈外水分，以免试剂流散。
蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，被染成淡蓝
色，而活细胞能阻止染料进入细胞内，可以鉴别死细胞与 活细胞。
细胞计数：采用细胞计数板。
台盼蓝染色
材料： 4%台盼蓝母液（称取4g台盼蓝，加蒸馏水研磨，加双 蒸水至100ml，用滤纸过滤，4℃保存。使用时，用PBS稀释至 0.4%）、 血细胞计数板、显微镜等。 步骤：①制备单细胞悬液；②染色：取10μl细胞悬液与10μl台 盼蓝溶液并混匀；③计数：在三分钟内，用计数板分别计数活 细胞和死细胞。 注意事项：台盼蓝对人体有毒，尽量避免直接接触。染色时间 不宜过长，否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。
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细胞表型检测1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 供试品名称：人胎盘间充质干细胞、猴胎盘间充质干细胞的P4、P6、P8细胞1.1.2 主要试剂B液自配天津昂赛细胞基因工程有限公司D液自配天津昂赛细胞基因工程有限公司血清新西兰胎牛血清(特级) 上海依科赛生物制品有限公司 IgG-FITC BD公司货号：555748CD19-FITC BD公司货号：555412CD34-FITC BD公司货号：555821CD44- FITC BD公司货号：CD31- FITC BD公司货号：IgG-PE BD公司货号：555749CD11b-PE BD公司货号：555483CD45-PE BD公司货号：555388CD73-PE BD公司货号：550257CD90-PE BD公司货号：555596CD105-PE Serotec公司货号：MCA1557PEHLA-DR-PE BD公司货号：555812CD29-PE BD公司货号：1.1.3 主要仪器CO2培养箱离心机超净工作台显微镜1.1.4 主要耗材50ml离心管、5ml/10ml移液管、1.5ml EP管。
1.1.5 实验设计依据通过传代培养，我们可以得到相对纯的间充质干细胞，参考国际细胞治疗协会提出的间充质干细胞表型方面的标准，CD73、CD90和CD105阳性率不低于95％；CD45、CD34、CD11b、CD19 和HLA-DR阳性率不高于2％[1]。
检测在传代过程中的细胞的表型是否会发生变化。
我们设计检测P4代、P6和P8代细胞表型。
1.2 实验方法1.2.1细胞消化1、将原培养液倒净,用移液管取D液10ml冲洗细胞，倒净,此操作重复洗2 次；2、用移液管吸取加入B液2ml,盖上培养瓶盖子,摇晃使B液均匀覆盖瓶底,待细胞从培养壁脱落下来；3、用移液管吸取加入C液0.5ml, 终止消化，再加D液10ml，吹打细胞制成细胞悬液，将细胞悬液收集至离心管中；1.2.2 流式检测方法1、收集细胞，1000rpm离心5min，用D液洗一次，过滤；2、用适量D液将细胞重悬，100μl每管分装到1.5mlEP管中，每管细胞不少于用1×105，在每管中加入4μl要检测表型的抗体,室温避光放置30min；加入1mlD液混匀，离心弃上清，再用1mlD液混匀，离心弃上清，每管加入350-500μl D液重悬，移入流式管待测即可；3、用流式细胞仪检测荧光值,每管计数3000-10000个细胞；4、分析数据。
1.3 C6操作步骤（一）开机1、启动控制计算机，进入软件，此时信号灯为红灯，显示还没有与C6连接。
2、检查四个液体容器，如有需要，则先充满液体或清空废液。
3、启动C6前方的电源按钮，此时信号灯变为黄色，显示C6正在启动，等待3分钟左右直至信号灯变绿，显示C6已经连接并就绪。
4、在载物台上放置一个空管，点击控制Backflush按钮，可以看到少许液体流出来。
5、在96孔样品格中任选一孔，载物台换上去离子水，选择高速，10分钟，点击RUN。
（激光器预热）6、该孔因为收集了数据变成蓝色，点击Delete Sample Data删除。
至此启动步骤已完成，可以开始检测样品。
（二）检测样品1、将样品依次置于载物台上。
2、在96孔样品格中选择不同的位置，依次命名。
3、设定检测停止的条件：（1）无限制，手动点击停止；（2）收集了多少个点停止；（3）收集了多少时间停止；（4）收集了多少体积液体停止。
（2—4可复选，达到任一设定指标就会停止）。
4、设定进样速度：慢速，中速，快速或者自己设定。
5、设定阈值（一般不变，FCS-H>80000）。
6、点击RUN。
注意事项：1、样品之间无需用去离子水冲洗，但是当你完成所有样品检测后，必须运行清洗程序（Instrument菜单下cleaning fluid cycle）。
2、若发生堵塞（观察每秒钟细胞数），则运行Backflush，再用去离子水冲洗2min。
3、切记每测完一个样品必须保存（在开始检测时会提示你保存）。
（三）检测结果分析（四）关机1、在任意一个打开的文件下，在96孔样品格中任选一孔，载物台上放置洗液（0.1%次氯酸钠），选择高速，运行2分钟。
2、在96孔样品格中任选一孔，载物台换上去离子水，选择高速，运行2分钟。
3、将去离子水的检测管一直留在载物台上。
4、按一下C6前方的电源按钮关闭C6，此时信号灯为黄灯，显示C6正在关闭，关闭的过程大约需要10分钟左右。
5、退出控制软件，不用保存之前清洗步骤所收集的数据。
关闭电脑。
注意：与BD FACSAria不同，C6的关机程序所作的一系列相关步骤都是自动的，不需要与控制计算机相连接操作，C6与电脑控制软件相对独立，所以后面两个步骤（关闭C6和退出控制软件）无关先后。
细胞因子检测1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 供试品名称：人胎盘间充质干细胞、猴胎盘间充质干细胞的P4、P6、P8细胞培养上清1.1.2 主要试剂B液自配天津昂赛细胞基因工程有限公司D液自配天津昂赛细胞基因工程有限公司血清新西兰胎牛血清(特级) 上海依科赛生物制品有限公司无血清培养基 Loza人白细胞介素2酶联免疫分析上海泛柯人白细胞介素6酶联免疫分析上海泛柯人血小板生成素酶联免疫分析上海泛柯人α干扰素酶联免疫分析上海泛柯人肿瘤坏死因子α酶联免疫分析上海泛柯人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子酶联免疫分析上海泛柯人粒细胞集落刺激因子酶联免疫分析上海泛柯1.1.3 主要仪器CO2培养箱离心机超净工作台显微镜酶标仪洗板机1.1.4 主要耗材50ml离心管、5ml/10ml移液管、1.5ml EP管、移液枪。
1.1.5 实验设计空白孔1个，标准空2个，待测空3个。
1.2 实验方法1.2.1样品收集细胞融合达80%-90%时进行计数定量培养，细胞融合达70%时，用无血清培养基替换24h后收取细胞上清，-80℃冻存、待测。
操作方法如下：吸弃培养瓶中原有培养基，PBS轻加入培养瓶清洗，弃去洗液，共2次。
加入适量0.25%胰蛋白酶消化，显微镜下观察，细胞开始回缩变圆并漂浮时，立即加入含10%FBS的培养基终止消化，混匀制成细胞悬液。
1000rp离心10min，弃上清。
重悬细胞沉淀，台盼蓝染色计数。
5×104细胞/cm2接种于含有血清培养基1ml 的12孔板中。
37℃、5%CO2培养箱中培养。
每天显微镜观察细胞生长状况，待细胞铺满70%，更换无血清培养基；培养24h后收细胞上清于冻存管中，存放-80℃待测。
重复上述步骤，收取P4、P6、P8细胞上清留作待测样本。
1.2.2 操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
8. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。
测定应在加终止液后15分钟以内进行。
操作程序总结：计算以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。
一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准。
8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。