丙酮酸氧化酶速率法与赖氏法检测ALT的比较

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ALT和AST测定方法

ALT和AST测定方法

ALT和AST测定方法ALT(Alanine Aminotransferase)和AST(Aspartate Aminotransferase)是两种常用的生物化学指标,用于评估肝脏功能和肝细胞损伤程度。

本文将详细介绍ALT和AST的测定方法。

一、ALT的测定方法1.酶动力学法:该方法是最常用的ALT测定方法。

原理是将肝脏组织或血浆样品与丙酮酸转氨酶(LDH)反应,通过测定产生的谷草转氨酶(AST)的酶活力来反映样品中ALT的含量。

该方法准确可靠,具有较高的灵敏度和特异性。

2.免疫测定法:ALT测定的另一种常用方法是免疫测定法,包括免疫比浊法、免疫荧光法和免疫酶联免疫吸附测定法(ELISA)。

这些方法利用ALT特异性抗原和抗体的结合反应来测定ALT的浓度,具有高灵敏度和高特异性。

二、AST的测定方法1.酶动力学法:AST的测定方法类似于ALT的测定方法,也是通过与丙酮酸转氨酶(LDH)反应来测定AST的酶活力。

该方法较为简单快速,适用于大量样本的测定,但其灵敏度和特异性相对较低。

2.免疫测定法:AST的免疫测定法与ALT的免疫测定法类似,包括免疫比浊法、免疫荧光法和免疫酶联免疫吸附测定法(ELISA)。

这些方法通过AST特异性抗原和抗体的结合反应来测定AST的浓度,具有高灵敏度和高特异性。

三、ALT和AST测定的注意事项1.样本的采集:ALT和AST的测定常用的样本是血浆或血清。

在采集样本时,应避免血液污染或其他杂质的干扰,以保证测定结果的准确性。

2.技术操作:在进行ALT和AST的测定过程中,需要严格遵守相关实验操作规范,确保实验条件的一致性和稳定性。

包括标本处理、试剂配制、反应时间和温度的控制等。

3.器材和试剂的选择:选择合适的测定仪器和试剂是保证测定结果准确性和重复性的重要因素。

一般情况下,空白对照组和阳性对照组的选取是测定中的重点之一4.数据解读:在进行ALT和AST的测定后,需要对测定结果进行合理的解读和分析。

ALTAST测定方法

ALTAST测定方法

ALTAST测定方法ALT和AST是两种常用的肝功能指标,用于评估肝脏疾病和损伤程度。

本文将介绍ALT和AST的测定方法。

一、ALT(丙氨酸氨基转移酶)的测定方法:ALT是一种肝细胞特异性酶,主要存在于肝细胞的胞浆中。

当肝细胞受损或破坏时,ALT会释放入血液中,因此血液中ALT水平的升高通常与肝脏疾病相关。

ALT的测定方法一般采用酶动力学法或颜色反应法。

1.酶动力学法:这种方法是通过衡量ALT催化丙酮酸和谷氨酸互相转化的速率来测定ALT的活性。

这种方法的原理是ALT催化丙酮酸和谷氨酸生成谷草转氨酶和谷氧化酶,同时反应中NADH的消耗会导致光学密度的变化。

通过测量这种变化可以确定ALT的活性水平。

2.颜色反应法:颜色反应法是用于测定ALT浓度的常用方法,它基于谷氨酸和丙酮酸在特定条件下与ALT催化生成谷草转氨酶和谷氧化酶的反应。

这种方法通常使用的试剂盒包含了特定的底物和酶,当ALT存在时,底物与其催化生成产物,产物的浓度可以通过光度计测量。

二、AST(天冬氨酸氨基转移酶)的测定方法:AST也是一种肝脏酶,但它不仅存在于肝细胞中,还存在于心肌、肌肉、肾脏和红细胞等组织中。

因此AST的升高并不一定代表肝脏疾病,也可能与其他组织的损伤有关。

AST的测定方法与ALT类似,也有酶动力学法和颜色反应法两种常见方法。

1.酶动力学法:该方法是通过测量AST催化天冬氨酸和α-酮戊二酸互相转化的速率来测定AST的活性。

反应中,NADH或NADPH的消耗导致光学密度的变化,可以用于测量AST的活性水平。

2.颜色反应法:AST的颜色反应法原理与ALT的相似,使用特定的底物和酶,当AST存在时,底物与其催化生成产物,产物的浓度可以通过光度计测量。

这些方法虽然有一定的差异,但一般都基于底物与酶的反应原理,通过测量底物与产物的光学密度变化或者测量酶活性来确定血液中ALT和AST的水平。

综上所述,ALT和AST的测定方法主要有酶动力学法和颜色反应法两种。

血清谷丙转氨酶alt的测定

血清谷丙转氨酶alt的测定
血清谷—丙转氨酶活性的 测定(改良赖氏法)


【目的要求】 1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作 方法。 3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。

【实验原理】 血清中的谷-丙转氨酶(ALT),在37℃、 pH7.4的条件下,可催化基质(底物)液中 的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸:

改原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度(改为低 浓度)的改良赖氏法,对卡门氏单位的科学套用,使比色 法一些缺陷得到了卓有成效的克服,使其结果与速率法较 为一致,能较好反映酶的真实活性。 由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足,反应速度 只能达到最大速度的65%;显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只 及反应液中酮酸浓度的一半;保温30min的酶促反应后, 新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控 制的竞争显色的几率问题,如此等等,使赖氏法的重现性 较差,在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。



【方法评价 】 ALT活性测定主要有两类。一是卡门氏(Karman) 分光光度法,测定的是酶促反应速率性可通过NADH的减少量,亦即通过 340nm吸光度的减少量间接作出定量测定。这一 方法特异性、准确性高。但是此法除要加入待测 酶ALT的底物外,还需要加入指示酶LDH及其辅 酶NADH,又需用紫外分光光度计,因此不易为 一般临床化验室推广。
生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加 成反应,生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙,进而在碱性环境中 生成红棕色的苯腙硝醌化合物,其颜色的深浅在一定范围 内与丙酮酸的生成量,亦即与ALT活性的高低成正比关系。 据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较,便可算出或通过 标准曲线查出血清中ALT的活性。

改良赖氏法测定ALT 医学课件

改良赖氏法测定ALT   医学课件
10
操作步骤
1.ALT校准曲线绘制 (标准曲线制备是反应原理的第二步 )
(1)按下表向各管加入相应试剂
加入物(ml)
1 23 4 5
0.1mol/L磷酸盐缓冲液 2.0mmol/L丙酮酸标准液 基质缓冲液 2,4-二硝基苯肼溶液
0.4mol/LNaOH溶液 相当于酶活性浓度(卡门 氏单位)
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
7.加入2,4-二硝基苯肼溶液后,应充分混匀,使反应完全。 加入NaOH溶液的方法和速度要一致,NaOH浓度要准确。
18
【注意事项】
8.绘制校准曲线时必须注意:由于赖氏方法的特点,每一个 点必须做3管以上的重复测定,显色后以蒸馏水调节吸光度 为零,读取各管的吸光度。求出各标准管的吸光度均值, 减去“1”管吸光度均值后,对照赖氏单位绘制校准曲线。 由于每批试剂都有差异,因此每换一个批号的试剂必须重 新绘制曲线。
【标本的采集、处理和贮存】红细胞中AST和ALT分 别为血清含量的15倍与7倍,所以明显溶血标本不 宜测此二酶,特别是AST。
【临床应用】
根据此二酶在人体器官中分布情况,临床医生 习惯将ALT、 AST用在诊断肝脏疾病,测定AST用 于诊断AMI。在AMI时,不论在出现升高时间,还 是升高持续时间,其变化介于CK和LD之间,无特 殊价值,随诊断AMI的新试验日益增多,国外已建 议不用。目前转氨酶测定主要用于肝胆疾病的诊断 和鉴别诊断。还可进一步检测AST/ALT比值,反映 肝损害的严重程度。在重症肝炎时比值上升,轻型 肝炎,比值下降。
L-丙氨酸 + α-酮戊二酸 ALT α-丙酮酸 + L-谷氨酸

血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定(赖氏法)

血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定(赖氏法)

授课对象:06级检验1-5班课时:2学时血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定(赖氏法)目标:1.掌握赖氏法测血清ALT的原理及注意事项2.掌握试剂的配制熟练地制作标准曲线3.规范地进行ALT测定4.了解血清ALT测定的临床意义实验用品:配制试剂用的各种器皿(烧杯、容量瓶、电炉、分析天平等)、37℃水浴箱、721型风光光度计、坐标纸等原理:丙氨酸和α-酮戊二酸在血ALT的作用下生成丙酮酸及谷氨酸,在酶反应达到规定时间时,加入2.4-二硝基苯肼-盐酸溶液以终止反应。

生成的丙酮酸与入2.4-二硝基苯肼作用,生成丙酮酸入2.4二硝基苯腙,苯腙在碱性条件下显红棕色。

根据显色之深浅,求得血清中丙氨酸氨基转移酶活力。

试剂:1. 0.1molPH7.4磷酸盐缓冲液称取磷酸氢二钠(Na2HPO4AR)11.928g,磷酸二氢钾(KH2PO4AR)2.176g,加少量蒸馏水溶解并稀释至1000mL。

2. ALP基质液称取DL丙氨酸[CHCH(NH)COOH]1.79g,α-酮戊二酸[COOH (COCOOH)29.2mg于烧杯中,加入0.1mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液80mL,煮沸溶解后待冷,用摩尔NaOH溶液调节PH至7.4(约加入0.5ml),再用0.1mol/LPH7.4磷酸盐缓冲液稀释至100mL,混匀,加氯仿数滴,置冰箱保存数周。

3.1mmol/L2.4-二硝基苯肼溶液称取 2.4-二硝基苯肼[(NO)CHNHNH AR]19.8mg,用10mol/L HC110mL溶解,然后加蒸馏水至100mL,置棕色瓶内,冰箱保存。

4.0.4mol/L NaOH溶液。

5.2mmol/L丙酮酸标准液精确称取丙酮酸钠[CHCOCOONa AR]22.0mg于100mL容量瓶中,加0.1mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液至刻度。

此液应新鲜配制,不得久放。

操作:血清ALT测定步骤(赖氏法)加入物(mL)R B血清0.1 0.1ALP基质液0.5 —混匀,置37o C水浴30min2.4-二硝基苯肼0.5 0.5ALP基质液—0.5混匀,置37o C水浴20min0.4mol/L NaOH 5.0 5.0将上述两管混匀,10min后,用蒸馏水调零,λ=505nm比色读取各管吸光度值,用测定管A-对照管A,查标准曲线得ALT活力单位。

速率法与微板法检测献血者谷丙转氨酶比较

速率法与微板法检测献血者谷丙转氨酶比较

速率法与微板法检测献血者谷丙转氨酶比较张孝山;李研;李忠平;潘彤;朱秀文;李瑞兰;赵莉;陈连旺;张付华;董磊【期刊名称】《中国输血杂志》【年(卷),期】2005(18)1【摘要】目的比较速率法和微板法检测献血者血样本谷丙转氨酶(ALT)。

方法对献血者血样本用速率法和微板法检测ALT,比较检测结果的阳性率、阳性符合率、假阴性率和假阳性率。

结果初检样本1057份,速率法和微板法检得阳性率分别为6.34%和5.87%(P>0.05),微板法符合率68.66%(P<0.01),假阳性率1.51%(P< 0.001),假阴性率1.99%(P<0.01);复检样本3239份速率法和微板法检得阳性率分别为4.11%和2.93%(P< 0.05),微板法符合率68.42%(P<0.001),假阳性率0.12%(P<0.05),假阴性率1.30%(P<0.01)。

结论微板法测定ALT的影响因素很多,建议使用自动生化分析仪测定ALT。

【总页数】3页(P32-34)【关键词】速率法;微板法;丙氨酸氨基转移酶;阳性率;假阴性率【作者】张孝山;李研;李忠平;潘彤;朱秀文;李瑞兰;赵莉;陈连旺;张付华;董磊【作者单位】天津市血液中心【正文语种】中文【中图分类】R446.1【相关文献】1.速率法与干式生化法检测献血者丙氨酸氨基转移酶比较 [J], 许学明2.速率法、丙酮酸氧化酶法与微板赖氏法检测ALT的对比试验 [J], 石海鹏;田东媚;徐凌中3.速率法与微板法测定定值血清谷丙转氨酶比较 [J], 张孝山;李研;李忠平;朱秀文;潘彤4.应用微板速率法替代生化分析仪检测献血者丙氨酸氨基转移酶研究 [J], 王海宝;张婷;冯倩;李锡金;郭广宏5.微板丙酮酸氧化酶及赖氏法与速率法检测ALT的比较 [J], 李伍升;方建华;刘玉振因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。

谷丙转氨酶测定方法

谷丙转氨酶测定方法

谷丙转氨酶测定方法一、赖式比色法赖氏法并没有自己的酶活为单位定义。

作者以当时卡门氏的速率法为准,测得多份不同ALT活力血清的ALT卡门氏单位。

然后在赖氏比色法条件下,测得各份血清反应显色的吸光收值。

将每份血清的卡门氏单位和对应比色法吸光值在坐标纸上作图。

经过大量实验,对所有实验点以最佳曲线拟合,形成了比色法在某指定比色计上的标准曲线。

坐标横轴为卡门氏单位,纵轴为吸光值,比色法结果和卡门氏速率法结果一致。

继后作者以底物溶液及丙酮酸标准溶液,按照酶反应实际情况配制成不同浓度的丙酮酸标准溶液系列与2.4二硝基苯肼显色,并与速率法的结果比较。

经多年反复实验,最后作者正式报告可通用于各种比色计的结果为ALT28卡门单位的鼍清在比色法条件下产生相当于0.1μmol丙酮酸,ALT57卡门单位的血清产生相当于0.2μmol丙酮酸,ALT97卡门单位? 的血清产生相当于0.3μmol丙酮酸。

这样就使赖氏法标准曲,线上丙酮酸量和对应卡门单位确定下来。

1970年将曲线延伸至150卡门单位。

赖氏法报告的结果与速率法结果一致。

没有条件采用速率法的实验室可以采用此法。

(一)赖氏比色法测定血清ALT1、试剂(1)Imol/L磷酸氢二钠:称取磷酸氢二钠(含两个结晶水)17.6g溶解于水中,并加水至1000ml,冰箱内保存。

(2)0.1mol/L磷酸二氢钾溶液:称取磷酸二氢钾13.6g溶解于水中,加水至1000ml,冰箱内保存。

(3) 0.1mol/l磷酸缓冲液(pH7.4):将420ml 0.1ml/L磷酸氢二钠溶液和80ml 0.1mol/L磷酸二氢钾溶液混匀,置冰箱内保存。

(4)底物缓冲液(DL—丙氨酸200mmol/L,α-酮戊二酸2m—mol/L):精确称取1.79g DL-丙氨酸和29.2mgα-酮戊二酸,先溶于约50ml 0.1mol/L磷酸缓冲液中,用lmol/L氢氧化钠(约0.5m1)调到pH7.4,再加磷酸缓冲液至100ml,置冰箱保存,可稳定两周。

血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性测定(改良赖氏法)

血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性测定(改良赖氏法)


谢谢!
实验试剂



1.ALT底物液:称取分析纯α-酮戊二酸39.2mg,丙氨酸1.78g,置于干 净小烧杯内,先用50ml碳酸缓冲液(pH=7.4)溶解,然后用 1mol/LNaOH校正pH至7.4(约需0.5ml),再以pH7.4的磷酸缓冲液稀 释至100ml,加氯仿数滴,防止变质。 2.pH=7.4磷酸缓冲液(PBS):称取磷酸氢二钠(Na2HPO4)13.97g及 磷酸二氢钠(KH2PO4)2.69g溶解于1000ml蒸馏水中 3.丙酮酸标准液(2mmol/L):准确称取干燥至恒重的丙酮酸钠22mg, 以磷酸缓冲液洗入100ml容量瓶中,混合,再以磷酸缓冲液稀释至刻度。 本液应新鲜配制。 4. 2,4-二硝基苯肼溶液(1mol/L):称取2,4-二硝基苯肼19.8mg先溶 于10ml 1.0mol/LHCL中,溶解后,加水至100ml。 5.0.4mol/LNaOH
掌握血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的方法改良赖氏法和临床意义酮戊二酸作为第底物经转氨酶的作用生成谷氨酸和丙酮酸然后测定丙酮酸的生成量即可计算酶活性的大生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的24二硝基苯肼发生加成反应生成丙酮酸24二硝基苯腙进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量亦即与alt活性的高低成正比关系
临床意义

ALT(GPT)广泛存在于机体各种组织中,但 在肝细胞中含量最多,当肝脏有病变,特别是 急性肝炎及肝细胞坏死是,血清中ALT活性显 著升高。在肝癌、肝硬变以及胆道疾病时,此 酶活性也可或轻度增高。另外,其他脏器或组 织的疾病,该酶活性也升高。
注意事项


1.不同血清对照管光密度基本相同,因此,同一批标本制作2~3个血清 对照管求其平均值即可,亦可用空白管代替对照管。对超过正常的标本 进行复查时,每份标本均应作对照管。 2.严重脂血症、黄疸或溶血的血清都能引起测定管OD值增加,因此,检 查此类标本时,应做血清对照管。 3.赖氏法标准曲线只到97卡门氏单位,其线性关系良好。超过此活力的 标本,应将血清稀释后再测定,结果乘以稀释倍数。 4.ALT底物液与2,4-二硝基苯肼液配置要准确,每次测定时空白管的 OD值上下波动不应超过0.015.如超出此范围应检查试剂及仪器等方面的 问题。 5.除了丙酮酸与2,4-二硝基苯肼再碱性溶液中能成腙外,α -酮戊酸亦 能与2,4-二硝基苯肼产生苯腙,两种苯腙的吸光度在520nm处有较大 差异,因此超过一定范围时,该方法所绘制的标准曲线呈抛物线。
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・ 21 ・
丙 酮 酸氧 化 酶 速率 法 与赖 氏法 检测 A T的 比较 L
施 淑 琴 于 菏 芳 殷琳 张 春荣 施 克 飞 ( 阳 市 血 站 , 苏 溧 阳 23 0 ) 溧 江 130
22 精 密 度 比较 用 多 次测 定 结 果 的重 复 性 表 示 , .
7 1 光 光度 计 ( 海 分 析 仪 2分 上 同一 样 品用 两种 方 法 同时 测定 2 0次 。两种 方 法 的均
12 仪器 设备 及试 剂 .
厂) 电 热 恒 温 水 浴 箱 ( U 0 型 ) 酶 标 仪 ( 赛 , C 60 , 博
要指 标l 。 自 19 L 1 ] 9 8年《 中华 人 民共 和 国献 血 法》 施 实 后 , 生部 在 对献 血 者 健 康体 检 标 准 中 , 其 列 为 检 卫 将
测项 目之 一 。A J 检 测要 求 采 用 赖 氏法 或 卫 生 部 临 I r r 床检验 中心 认可 的检测 方法 。
输 血传播 疾病 是 医院感 染 的 主要 传播 途 径 之 一 , 丙氨 酸氨 基 转 移 酶 ( L ) 为 肝 功 能 检 测 的 指 标 之 AT作

血 液 筛查 10 —7 3 (0 8 0 —02 — 2 0 8 3 8 20 )3 0 1 0
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【 摘 要 】 目的 : 用 丙酮酸 氧化 酶速 率 法、 氏法测定 丙氨 酸氨基 转移 酶 ( f )探 索适 用 于血 应 赖 AJ , T
站 筛 查 献 血 者 A T的 方 法 , 降 低 医 院 输 血 感 染 疾 病 的 风 险 。方 法 : 定 值 质 控 血 清 、0份 不 同 L 以 对 l A T值 的 血 清 标 本 、 24 献 血 员血 液 标 本 , 丙 酮 酸 氧 化 酶 速 率 法 与 赖 氏 法 的检 测 结 果 比 较 。 L 1 5份 作
141 丙酮酸 氧化 酶 速 率 法检 测 初筛 方法 ( 孔板 .. 微
法) 操作步骤按试剂 盒说 明书操 作 , 标本 与试 剂体 积之
比为 1 1, 1 2为校 准血清 , 3 A :0 A 一A A 一 4为低值血清 ,5 A
A 为高 值血 清 , 余 为测 定 孔 , 博赛 200 6 其 置 1 酶标 仪
定 量检 测 方 法 。为 了寻 找适 合血 站 大 批 量 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 选 A T L 的方法 , 本站 以丙 酮 酸 氧化 酶 速 率 法 为 初 检 方 法 , 以 赖氏法 为复 检 方法 , 对这 两 种 方 法 进 行 比较 分 析 , 现
报告如下 。
1 . 统计 学 处理 采 用 配 对 数据 t 验及 卡方 检 .3 4 检
验。
2 结 果
2 1 不 同 A T值 的血清标 本检 测 结果 丙 酮 酸 氧化 . L 酶速 率 法 测定 结 果 与 赖 氏法基 本 一 致 , 值 在 一05 差 .

1 材 料 与 方 法
1 1 标 本 来 源 1 . 0份 来 自 无 偿 献 血 者 的 标 本 , L AT
化 , 能够保存 每份样 品 的原 始记 录 , 于查 询 , 且 便 比赖氏 法更适合在 采供 血 系统 中进行批 量检 测 。
【 关键词 】 丙氨酸氨 基转 移酶 丙酮酸氧 化酶速 率法 赖氏 法 【 中图分 类号 】 R 4 .1 【 4 6 1 文献标 识 码 】 A 【 文章 编号 】
赖 氏法 是该项 目检 测 的经 典方 法 , 是 规程 推 荐 3 也 7℃孵育60s , 主波 长42n 第 一次判 渎 , 孵育 0 后 用 9 m 再 的方法 之 一 j 但 需 手 工 操 作 以 及 手 工 记 录 实 验 结 ,
10s 行 第 二次 判 读 , s e 实 验室 管理 软 件 进行 计 8 进 hw l l 算, 电脑 自动将标本 读数换 算 成赖 氏法卡 门单位 , 并将
( 批号 H 7 3 5 , X P 0 0 ) 经 O一8 1 1 生化分 析仪确认 , 低值 血 清 2 K ( 门单位 ) 高值 血清 5 K 。 5 U卡 , 0 U
14 操 作 步 骤 .

除 在肝 炎 的诊 断 及 防 治方 面 具 有 重 要 价 值 外 , 在
血站 系统 对献 血 者 排 除 肝病 患 者 的 筛查 也 是 一 项 重
结果: 丙酮酸 氧化酶速 率法与 赖 氏法检 测 A 差异 无 统计 学 意义 ( I P>00 ) .5 。结论 : 丙酮酸 氧 化
酶 速 率 法检 测 试 剂 盒 可 进 行 大批 量 A T 筛 查 , 实现 试 验 的 自动 、 量 、 速 、 果 传 输 的 网 络 L 可 微 快 结
阳性 ( 2 K ) > 5 U 结果在 实验报告 中显示 +。 14 2 赖 氏 法 A T 测 .. L检 按试 剂盒说 明书操作 。
果, 检测 时 间 长 , 为 繁琐 。 丙 酮 酸 氧化 酶 速 率 法 是 较

种快速 、 简便 , 可在 酶 标 仪 上 直 接读 取 测 定 结 果 的
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