5.高效液相色谱法测定克鲁维酵母菊芋发酵液中的乙醇糖和有机酸类代谢成分

第３７卷２００９年６月分析化学（ＦＥＮｘＩＨｕＡｘｕＥ）研究报告ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｍａｌｏｆＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ第６期

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高效液相色谱法测定克鲁维酵母菊芋发酵液中的乙醇，糖和有机酸类代谢成分

袁文杰１孔亮２孜力汗１白凤武“１（大连理工大学生物科学与工程系，大连１１６０２３）２（大连水产学院海洋环境工程学院，大连１１６０２３）

摘要建立了高效液相色谱法同时分析菊芋发酵液中的乙醇和有机酸的方法。采用ＨＰＬＣ有机酸分析柱，

流动相为Ｏ．Ｏｌｍｏｌ／ＬＨ，ｓ０。，流速为０．５ｍＬ／ｍｉｎ，以紫外和示差折光检测器作为双通道检测手段，同时对克鲁维酵母菊芋发酵液中的柠檬酸、ａ．酮戊二酸、葡萄糖、丙酮酸、果糖、琥珀酸、乳酸、甘油、乙酸、乙醇进行了定量分析，本方法的回收率为９５．８％一１０９．６％；ＲＳＤ为０．３３％～４．Ｏ％，结果表明，本方法简单、快速、准确，适用于监控克鲁维酵母发酵产物并指导整个发酵过程条件的优化。

关键词高效液相色谱，双通道检测，克鲁维酵母，菊芋，代谢成分引言利用菊芋替代粮食发酵生产乙醇的研究已引起关注¨。，。克鲁维酵母能够同步糖化发酵菊芋产乙醇，且耐高温，是具有工业化应用前景的理想菌株。测定菊芋发酵液中的酒精、糖及各种有机酸类代谢成分组成变化，对揭示其代谢途径以及控制酒精发酵过程的变化，进而从代谢工程角度改良菌种和优化发酵工艺条件具有重要的意义。目前，采用气相色谱法、酶法和比重法测定乙醇¨ｏ，采用ＨＰＬＣ法测定发酵液中的有机酸Ｈ”１，ＤＮｓ法测定还原糖¨１。由于发酵代谢产物组成复杂且性质差异较大，目前采用的多种手段分析发酵液中各类成分的方式，繁琐费时，故以通用方法同时分析发酵液中的各类代谢成分是目前的发展趋势。Ｄｏｙｏｎ等一。使用ＨＰＬＣ结合示差和二极管阵列检测器同时分析有机酸，糖类和乙醇的的方法；Ｍａｒｔｉｎｅｚ．Ａｎａｙａ等¨叫采用类似的方法测定了面包发酵中的乳酸、乙酸和葡萄糖、果糖等。这些方法的问题是对仪器要求较高，分离的组分种类少，未充分发挥ＨＰＬｃ一多通道检测器的优势。Ｌｅｆｅｂｖｒｅ等¨¨采用示差检测器分析了面团发酵中的糖和有机酸，简化了方法，但其灵敏度较低。本研究采用ＨＰＬＣ法，以紫外和示差折光检测器作双通道检测，建立了同时检测克鲁维酵母发酵菊芋过程中酒精、糖类及各种有机酸等１１种组分的方法，并考察了克鲁维酵母发酵菊芋的代谢行为。

２实验部分

２．１仪器与试剂高效液相色谱系统由ｗａｔｅ璐ＴＭ６００型泵、４１０型示差检测器和２４８７紫外检测器组成（美国ｗａｔｅｒｓ公司）。超纯水经Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ纯水机（美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司）制得。Ｈ：Ｓ０。（分析纯，天津兴华化学试剂厂），柠檬酸、ａ．酮戊二酸、丙酮酸、琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸、葡萄糖、果糖、甘油、乙醇均为分析纯（上海生工生物工程有限公司），其它试剂均为分析纯。２．２实验方法

２．２．１色谱分离条件ＡｍｉｎｅｘＨＰｘ－８７Ｈ有机酸分析柱（３００ｍｍ×７．８ｍｍ；Ｂｉｏ—Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ），流动

相：０．０１ｍｏｌ／ＬＨ：ｓＯ．，流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ，进样量２０斗Ｌ，柱温５０℃，检测波长２０５ｎｍ，示差折光检测器温度５０℃。２．２．２样品的预处理准确量取２ｍＬ菊芋发酵液，经１００００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ后取上清液，适当稀释后经Ｏ．２２斗ｍ水系膜过滤后进样。

２００８·１ｌ－０７收穑；２００９—０１．１６接受·Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｂ矗ｉ＠ｄｌｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ

万方数据第６期袁文杰等：高效液相色谱法测定克鲁维酵母菊芋发酵液中的乙醇，糖和有机酸类代谢成分８５ｌ

２．２．３标准溶液制备精确称取柠檬酸、ａ－酮戊二酸、丙酮酸、琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸、葡萄糖、果糖、甘油、乙醇标准品，用超纯水溶解配制成标准溶液，各标准品浓度分别为１．０、１．０、１．０、５．Ｏ、８．０、６．０、１０．０、１０．０、１０．Ｏ、８．０和１００．０ｇ／Ｌ，然后按比例稀释制备成一系列标准溶液备用。

３结果与讨论３．１检测器的选择由于待测定的葡糖糖果糖、乙醇及甘油等均不含共轭双键，无紫外光吸收，故选用示差折光检测器检测。对于其它的有机酸，因羧基中氧上孤对电子的跃迁，使其在２０５—２１５ｎｍ区间有紫外吸收峰，所以选用紫外检测器检测，并将波长设定为均有较大吸收的２０５ｎｍ。标准品与发酵液样品的色谱图见图ｌ。

＞Ｅ蚤皇三Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ（ｍｉｎ）９暑吝’磊磐三Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ（ｍｉｎ）图ｌ紫外可见检测器（Ａ）和示差折光检测器（Ｂ）的标准品与发酵液样品的色谱图Ｆｉｇ．１Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓｏｆｓｔａｎｄａｒｄｓａｎｄｆｅ珊ｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈ８哪ｐｌｅｂｙＵＶ—Ｖｉｓｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａ）ａｎｄｒｅｆｒａｃｔｉｖｅｉｎｄｅｘｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｂ）１．柠檬酸（ｃｉｔｒｉｃａｃｉｄ）；２．ａ·酮戊二酸（ａ·ｋｅｔｏｇｌｕｔ“ｃ”ｉｄ）；３．葡萄糖（ｇｌｕｃ∞ｅ）；４．丙酮酸（ｐｙⅢｖｉｃａｃｉｄ）；５．果糖（ｆｍｃ－ｔｏｓｅ）；６．琥珀酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃａｃｉｄ）；７．乳酸（１ａｃｔｉｃａｃｉｄ）；８．甘油（ｇｌｙｃｅｍｌ）；９．甲酸（ｆｏｍｉｃａｃｉｄ）；ｌＯ．乙酸（ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）；１１．乙醇（ｅｔｈａｎ０１）。３．２流动相ｐＨ的选择本实验的色谱柱填料是聚苯乙烯二乙烯苯树脂，适合分离有机酸等极性化合物，分离机制包括体积排阻、离子交换、正相与反相分配以及配体交换等。选用稀酸为流动相。各标准品的分子量与ｐ‰见表１。表ｌ各标准品的分子量与ｐＫａＴａｂｌｅ１ＭｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔａｎｄｐＫａｏｆｓｔａｎｄａｒｄｓ由图１和表１可以看到各样品保留时间明显随分子量和ｐＫａ的大小而变化。分子量越大，保留时间越短。柠檬酸的分子量最大（１９２．１４），其保留时间最短（９．５１ｍｉｎ）；乙醇分子量最小（４６），保留时间最长（２４．０４ｍｉｎ）。在分子量相近的情况下，ｐＫａ越小，保留时间越短；反之则保留时间越长。如样品中的丙酮酸与乳酸的分子量比较接近，但是二者的ｐＫａ相差较大（如表ｌ所示），因此其中ｐＫａ较小的丙酮酸保留时间小于ｐＫａ较大的乳酸的保留时间。实验发现，流动相中加入稀Ｈ：ｓｏ。或稀Ｈ，ＰＯ。均可使１１种标准品得到分离，但以稀Ｈ：ＳＯ。作流动相的样品保留时间要略长于稀Ｈ，ＰＯ。为流动相时的情况，分离效果更好。所以选择Ｈ：ＳＯ。作流动相。菊芋发酵液中的有机酸均为弱酸，在水溶液中存在解离平衡，懈离程度受溶液ｐＨ值影响，提高［Ｈ＋］可改善峰形。考虑到该色谱柱填料的ｐＨ适用范围在ｌ一３之间，故考查ｐＨ影响时，将流动相的ｐＨ用１０ｍｏＬ／ＬＮａＯＨ分别调至１．４０、１．７５、２．０５、２．３５和２．７０，相应分离结果如图２所示。各成分保留Ｏ０ＯＯＯＯＯ０ＯＯ邪∞弱如笛加＂，ＯＯ０ＯＯＯＯＯ

”如筋加ｂｍ，

万方数据８５２分析化学第３７卷

时间随ｐＨ的上升而增大。当ｐＨ＞２．０５时，柠檬酸与酮戊二酸不能有效分离（如图２Ａ中色谱峰１和２），可能是由于在此条件下，柠檬酸与酮戊二酸的解离常数相近，二者的分子量和离子状态相近，造成保留时间接近；当ｐＨ＞１．７５时，乳酸（色谱峰７）与甲酸（色谱峰９）不能有效分离，也是由于在此条件下，二者的解离常数非常接近造成的。而对于发酵液中葡萄糖等其它中性极性化合物，流动相的ｐＨ变化对其保留时间影响较小（如图２Ｂ所示）。鉴于流动相的ｐＨ考察结果，在ｐＨ１．４时所有１１种标准品均能够得到完全分离，因此最终定量分析时的流动相ｐＨ确定为１．４。

Ｏ５１０１５２０２５３０ｆ／ｍｉＩｌｐＨｌ．４０１．７５０５Ｏ５１０１５２０２５３０ｆ／ｍｉｎ

．图２流动相ｐＨ对发酵液中成分保留时间的影响Ｆｉｇ．２Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅｏｆｃｏｍｐｏｕｎｄｓｉｎｆｅ珊ｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈ嬲ｐＨｏｆｍｏｂｉｌｐｈ船ｅＡ：不同ｐＨ下有机酸的分离谱图（ｃｈ∞ｍａｔｏｇｍｍｓｏｆｏｒｇＢｎｉｃａｃｉｄｓｕｎｄｅｒｄｉ艉ｒｅｎｔｐＨｖａｌｕｅ）；Ｂ：不同ｐＨ下非有机酸类化合物的分离谱图（ｃｈｍｍａｔｏｇｍｍ８ｏｆｎｏｎ—ｏｒｇａｎｉｃａｃｉｄｓｕｎｄｅｒｄｉ艉ＭｎｔｐＨｖａｌｕｅ）。谱峰编号同图１

（ｔｌｌｅｎｕｍｂｅ增ｏｆｐｅａｋ８

ａ＂ｔ－Ｉｅｓａｍｅ舾ｔＩＩｅＦｉｇ．１）。

３．３柱温的选择文献［１２，１３］报道，使用ＡｍｉｎｅｘＨＰｘ一８７Ｈ分析柱进行有机酸分析时，选用的柱温各不相同。为确认柱温对分析效果的影响，本实验考察了柱温为３０℃一５０℃时的分离情况，结果如图３所示。结果表明：随温度的升高，在有机酸类化合物中，除丙酮酸外其它有机酸的保留时间均不同程度降低；而在非有机酸类化合物中，随着柱温升高，乙醇的保留时间逐渐延长，其它成分则基本保持不变。实验表明，部分成分的保留时间略有缩短，色谱峰形和分离效果随温度上升而好转。但在分离中，温度过高会使流动相中的溶解的气体挥发形成气泡影响色谱分离与检测。综合考虑，本实验选择的柱温最终设定为５０℃。

Ｏ５ｌＯ１５２０２５３０Ｒ鼬ｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ（ｍｉｎ）Ｏ５ｌＯ１５２０２５３０

Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ（ｍｉｎ）

５０℃℃

图３标准品中成分保留时间随流动相温度的变化Ｆｉｇ．３Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅｏｆｃｏｍｐｏｕｎｄ８ｉｎｆｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｌｉｑｕｉｄｗｃｏｌｕｍｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆｍｏｂｉｌｐｈａｓｅ

＾：不同柱温下有机酸的分离谱图（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｍｍｓｏｆｏｒｇａｎｉｃ∽ｉｄｓｕｎｄｅｒｄｉ如ⅢｎｃｏｌｕｍｎｔｅｍｐｅｍＩｕｍ）；Ｂ：不同柱温下非有机酸类化合物分离谱图（ｃｈｍｍａｌｏｇｍｍｓ“ｎｏｎ—ｏｑｇａｎｉｃａｃｊｄｓｕｎｄｅｒ

ｄｉ如＂ｎｔ∞Ｊｕｍｎ￡ｅ”Ｐｅｒ丑ｔｕｆｅ）。

谱峰编号同图ｌ（ｔｈｅｎｕｍｂｅｎｏｆＰ９ａｋｓａ＂ｌｈＰｓａｍｒ∞ｔｈｅＦｉｇ．１）。

３．４标准曲线的绘制

准确移取不同浓度的标准溶液２０斗Ｌ分别进样，测定各标准品的峰面积。以３倍信噪比（Ｓ／Ⅳ）计算检出限。各标准品的回归方程、线性范围、线性相关系数和检出限结果见表２。３．５方法的回收率和重复性实验利用上述方法对克鲁维酵母发酵菊粉的发酵液进行定性与定量分析，确定发酵液中主要的产物为

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