酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵3(DOC)
废糖液酒精发酵中酵母菌的分离、筛选和验证
废糖液酒精发酵中酵母菌的分离、筛选和验证成少宁;许先猛;马欣;张增帅;郭俊花【期刊名称】《食品与发酵科技》【年(卷),期】2016(052)001【摘要】本研究为了筛选适合废糖液进行酒精发酵的优良酵母菌种,对来自废糖液和苹果皮中天然存在的酵母茵进行富集培养和分离,通过TTC显色法、杜氏管发酵法、二氧化碳失重法三级筛选选出合适的菌株,通过镜检和生长曲线以及发酵七天的还原糖、总酸和酒精度的测定来进一步检验入选菌株的发酵性能.结果表明,富集和分离的185株菌经过三级筛选选出的D7酵母菌发酵性能优良,发酵7d的酒精度达到了11.6％vol,明显高于对照茵的10.4％vol,并且其对数期和稳定期都较长,是废糖液酒精发酵的优良茵株.【总页数】5页(P6-10)【作者】成少宁;许先猛;马欣;张增帅;郭俊花【作者单位】运城职业技术学院有机食品工程系,山西运城044000;运城职业技术学院有机食品工程系,山西运城044000;运城职业技术学院有机食品工程系,山西运城044000;运城职业技术学院有机食品工程系,山西运城044000;运城职业技术学院有机食品工程系,山西运城044000【正文语种】中文【中图分类】TS261.1+1【相关文献】1.HPLC法测定玉米浓醪发酵酒精醪液中的纤维二糖和蜜二糖 [J], 张梁;陈蕴;石贵阳;章克昌2.白云边大曲中酵母菌的分离、筛选及发酵条件研究 [J], 王彩丽;曾小涛;查凡;果然;杨亚珍3.一株优良果脯加工废糖液酒精发酵酵母菌生长条件的研究 [J], 成少宁;许先猛;马欣;张增帅;郭俊花4.内蒙古乌海地区沙漠葡萄发酵醪液中酿酒酵母菌的筛选与鉴定 [J], 赵雪平; 温雅娇; 李正英; 郑海武; 黄海英; 李晓娟5.产香酵母菌筛选、条件优化及发酵产物在电子烟烟液中的应用 [J], 巩效伟; 刀娅; 赵伟; 韩熠; 朱东来; 罗义勇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
酒曲中产酒酵母菌的筛选及发酵能力的测定
酒曲中产酒酵母菌的筛选及发酵能力的测定一、实验目的1.掌握酵母菌的筛选方法2.复习用显微镜观察菌形态的操作步骤3.掌握酵母生产性能的测定：酵母发酵力的测定、酵母产酒精能力的测定、及其乃酒精的能力、4.学习酒精出酒率的计算二、实验原理酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条件下，液体培养比霉菌快。
菌落于细菌相似，较大而厚，多数不透明，菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色，圆形、椭圆、卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。
酒曲中含有细菌，霉菌，酵母菌等多种菌体，在菌体的分离提取中，通过对原菌的稀释，涂布，多次划线而使各种菌体得以分开，形成单菌落。
通过观察菌落的形态以及在显微镜下对单菌体形态特征的观察确定酵母菌个体。
三、实验材料1．实验器材恒温培养箱，高压灭菌锅，三角瓶，电炉，石棉网，水浴锅，移液管，移液管架，容量瓶，冷凝管，蒸馏烧瓶，铁架台，软管，天平，酒精计，超净工作台，试管，培养皿，接种环，玻璃棒，涂布棒，漏斗，滤纸，玻璃珠，纱布，脱脂棉，酒精灯，白瓷缸，分析天平，量筒，牛皮纸，报纸2．试剂及药品无水乙醇，蒸馏水，葡萄糖，磷酸二氢钾，硫酸铵，豆芽，琼脂，蛋白胨，酵母浸膏，硫酸镁，氯化钙。
3．实验材料：酒曲4．种子培养基豆芽汁培养基：黄豆芽 100g；葡萄糖 50g；琼脂 20g；水 1000ml；PH 自然。
5．发酵培养基A 酵母抽提物0.75 g，B 蛋白胨0.75 g，C 硫酸铵0.25 g，D 磷酸二氢钾0.125 g，E 硫酸镁0.09 g，F 氯化钙0.07 g，G 葡萄糖25 g，H 蒸馏水250mL。
四、方法步骤1、产酒酵母菌株的初选（1）实验器材的准备与灭菌1）清洗培养皿、锥形瓶数个，在干燥箱中干燥2）检查并接通高压蒸汽灭菌锅，打开电源，在锅内加水，直至水位显示为高水位，设定温度为121℃，加热时间30min。
3）取出培养皿、锥形瓶，放置降温、用牛皮纸包裹放置在内锅层，加盖，并将盖上的螺栓以两两对称的方式同时旋转拧紧，防止漏气。
酵母菌的分离纯化酵母菌的分离纯化实验方案
酵母菌的分离纯化酵母菌的分离纯化实验方案导读:就爱阅读网友为您分享以下“酵母菌的分离纯化实验方案”资讯，希望对您有所帮助，感谢您对的支持!酵母菌的分离纯化实验目的1. 了解培养基的配置与灭菌技术;2. 无菌操作技术;3. 工业微生物的分离与纯化技术;4. 工业微生物的检测及保藏。
基本原理1、培养基是人工配置的用于培养、分离、鉴定和保存各种微生物的营养基质。
也适合微生物在生命活动中积累各种代谢产物。
由于微生物种类不同，营养类型各异以及实验目的不同，因此培养基的种类也很多。
不同微生物对营养的要求不同，在配置时根据微生物对PH的要求选择合适的PH。
1由于本次实验主要是分离纯化酵母菌，所以配置的培养基是适合酵母菌生长麦芽汁平板培养基，同时添加抗生素抑制霉菌及其它菌的生长。
2、接种和培养过程中必须保证不被其它微生物所污染，关键在于严格进行正确的无菌操作，但是绝对无菌是不可能的，只能人工创造相对无菌的环境。
所以本次实验无菌操作是在超净工作台的酒精灯火焰旁进行。
3、把特定微生物从混杂的微生物群体中分离出来而获得某一种或某一株微生物的过程叫微生物的分离与纯化。
首先根据其生长特性设计只利于此菌生长的条件，再根据各种稀释法使他们在固体培养基上单独长成菌落。
分离纯化的方法通常有:稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法和平板划线。
此次实验采用梯度稀释涂布平板法。
4、微生物检测项目最常用的是细胞数的检测，方法比较多，主要有显微镜直接计数法、平板菌落计数法(CFU)、光电比浊计数法等。
本次实验设计酵母菌的数量检测，选用显微镜直接计数法和平板菌落计数法。
实验器材仪器设备恒温水浴锅、电热干燥箱、蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、恒温摇床、水浴锅、电炉、铜锅、酒精灯、接种环、电子天平、研钵、光学显微镜、血细胞计数器玻璃器2皿烧杯、锥形瓶、大小试管、培养皿、漏斗、三角涂棒、吸管、试管架、玻璃涂棒、盖玻片试剂与材料苹果、大麦芽、琼脂、蒸馏水、碘液、抗生素、染色液其它纱布、滤纸实验内容及操作步骤(一)、样品的选择酵母菌一般在果园的土壤中或者水果的表面含量较多，因此选择苹果为样品。
酵母细胞的固定化及其酒精发酵试验
酵母细胞的固定化及其酒精发酵试验一、实验目的1.掌握微生物细胞的固定化方法；2.学习用固定化酵母进行酒精发酵；3.进一步理解淀粉质原料酒精发酵的原理和一般工艺过程。
二、实验原理（一）酵母菌酒精发酵在无氧条件下，酵母菌利用葡萄糖或淀粉水解糖发酵产生乙醇和CO2的作用，称为酒精发酵，总反应式为：C6H12O6→2C2H5OH+2CO2酒精发酵是生产酒精及各种酒类的基础。
本实验采用固定化酵母发酵，通过测定发酵过程中的酵母细胞数、生成的CO2量以及最终产物酒精的量，可以判断固定化酵母的发酵能力。
（二）细胞固定化技术固定化细胞就是被限制自由的细胞。
即采用物理或化学的方法将细胞固定在载体上或限度在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并能反复或连续使用。
微生物细胞的固定化方法有：（1）吸附法，（2）包埋法，（3）不用载体法。
本实验采用凝胶包埋的固定化方法，把酵母细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，再滴加入CaCl2溶液，形成海藻酸钙凝胶小球，细胞包埋在凝胶的小孔中，制成固定化细胞。
三、实验器材（一）淀粉的液化与糖化（双酶法）1. 酵母菌细胞：酒精活性干酵母。
2. 2.5%海藻酸钠溶液40mL，2 % CaCl2溶液100mL。
3.培养基：①增殖培养基：浓度为130BX麦芽汁，以6N硫酸调节pH值至4.1~4.5。
（每组100mL 装于250mL三角瓶，1kg/cm2，灭菌30min后备用）②发酵培养基：淀粉水解液，具体制备见实验步骤。
4. 培养箱、显微镜、蒸馏装置及其他常规实验仪器四、实验方法①调浆:以1﹕3~3.5的比例，将玉米粉（或玉米淀粉）用60℃左右的温水调成粉浆500mL;②液化：加α-淀粉酶（用量约为10u/g淀粉）；加热至85~90℃，保持30~60 min，加热煮沸10 min，补充水分。
③糖化：将上述液化醪冷至60~62℃，加入糖化酶，用量为80~100u/g淀粉，维持30 min后分装于500mL三角瓶，每瓶装糖化醪250mL。
酵母菌的分离纯化
酵母菌的分离纯化-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN酵母菌的分离纯化、固定化和酒精发酵第一部分酵母菌的分离纯化一、实验目的应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。
二、实验原理酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。
多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为酵母菌生长迅速，容易分离培养。
在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。
因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。
三、器材和用品1、甘蔗、苹果皮、葡萄皮、果园土、菜园土等。
2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g（煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。
分装三角瓶；试管斜面1支/组3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为左右，再分装试管9ml2支/组。
4、无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、美兰染液、显微镜、接种环等。
四、实验方法1、接种：取果皮（不需冲洗）或土壤5克，加入到100ml无菌水中，充分搅拌后，用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h，可见培养液变浑浊。
2、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1m l，注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h。
3、镜检：用无菌操作法用接种环取少量菌液置于载玻片上，中央滴一滴美兰染液，混合均匀后制成水浸片，在高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽方式，并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因活细胞使美兰染液还原，故菌体不着色。
4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养24h。
5、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分离得到单个菌落。
高中生物酵母细胞的固定化 (3)
↓ 冲洗：将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗 2～3 次
↓ 发酵：将 150 mL 质量分数为 10%的葡萄糖溶液转移至 200 mL 的锥形瓶中，加入固定好的酵母细胞，25 ℃下发酵 24 h
3．用包埋法固定化细胞是将微生物细胞均匀地包埋于 不溶于水的多孔性载体 中，常用的包埋载体有
明胶 、 琼脂糖 、 海藻酸钠 、 醋酸纤维素 和 聚丙烯酰胺 等。 4．固定化酶的应用实例——高果糖浆的生产 固定化酶技术已经应用于高果糖浆的生产中，生产 高果糖浆所需要的酶是 葡萄糖异构酶 ，所使用的反 应柱上的孔应满足 酶颗粒 不能通过筛板上的小孔， 而 反应溶液却可以自由出入。
(3)影响实验成败的关键步骤是________________。 (4)海藻酸钠溶化过程的注意事项是______________。 (5)如果海藻酸钠浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞 数目_____。如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形 ，说明 ______。 (6)该实验中CaCl2溶液的作用是__________。
解析 (1)酵母细胞在缺水的状态下休眠。活化是加入水使酵 母菌恢复到生活状态。酵母细胞活化后体积会增大。(2)固定 化酶常用化学结合法和物理吸附法固定化。(3)实验的关键是 配制海藻酸钠溶液，得到凝胶珠。(4)海藻酸钠溶化过程要小 火加热(小火间断加热)不断搅拌，使海藻酸钠完全溶化，又 不会焦糊。(5)海藻酸钠浓度过低，包埋的酵母菌就过少；海 藻酸钠浓度过高，不易与酵母菌混合均匀。(6)氯化钙能使海 藻酸钠形成聚沉。
反应物不易 与酶接近， 尤其是大分 子物质，反 应效率下降
酵母菌的分离纯化
酵母菌的分离纯化、固定化和酒精发酵第一部分酵母菌的分离纯化一、实验目的应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。
二、实验原理酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。
多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为4。
5—6.0。
酵母菌生长迅速，容易分离培养。
在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。
因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化.三、器材和用品1、甘蔗、苹果皮、葡萄皮、果园土、菜园土等。
2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基:马铃薯200g（煮开10min后过滤取汁),葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。
分装三角瓶;试管斜面1支/组3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上,不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为5。
5左右，再分装试管9ml2支/组.4、无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、美兰染液、显微镜、接种环等.四、实验方法1、接种：取果皮（不需冲洗)或土壤5克，加入到100ml无菌水中,充分搅拌后，用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28—30℃培养箱中培养24h，可见培养液变浑浊.2、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1m l，注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中,在28-30℃培养箱中培养24h.3、镜检：用无菌操作法用接种环取少量菌液置于载玻片上，中央滴一滴美兰染液,混合均匀后制成水浸片，在高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽方式，并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因活细胞使美兰染液还原,故菌体不着色。
4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取0.1ml 加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养24h。
5、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分离得到单个菌落。
酿酒 分离
酿酒过程中的酵母分离是一个关键步骤，它确保了酿造过程中使用的是纯净且适合特定酒种的酵母菌株。
以下是一些酿酒酵母分离的基本步骤和注意事项：
1. 样品采集：酿酒酵母通常来源于发酵液、酒糟或酵母泥。
采集样品时，应确保工具的无菌操作，避免污染。
2. 分离纯化：将采集的样品进行适当的稀释，然后取一定量涂布于选择性培养基上，如YEPD培养基，这是一种常用的富集培养基。
在适当的温度（通常是28℃）下培养几天，以便酵母生长形成单菌落。
3. 单菌落挑选：在培养基上，挑选出不同的单菌落，这可以通过观察菌落的颜色、形状和质地来初步判断酵母的种类。
4. 形态鉴定：将挑选出的单菌落接种到WL鉴别培养基上，进一步观察和鉴定。
酿酒酵母在WL培养基上通常呈现为奶油色带有绿色、不透明，形状为球形、光滑、突起。
5. 生理生化测试：进行一系列的生理生化测试，以确定酵母的种属。
这些测试包括发酵能力、产生酒精的类型和数量、对不同碳源和氮源的利用等。
6. 分子生物学鉴定：为了更准确地鉴定酵母菌株，可以采用分子生物学方法，如PCR和DNA测序，分析其核糖体RNA（rRNA）或内部转录间隔区（ITS）等基因序列。
7. 保存与应用：经过鉴定和性能测试的酵母菌株可以保存于-4℃的冰箱中，用于未来的酿造。
在实际酿造过程中，根据酵母的特性选择合适的接种量和发酵条件。
在整个分离和纯化过程中，无菌操作是关键，避免任何外来的污染。
此外，记录所有的操作步骤和结果也是非常重要的，以便于后续的跟踪和分析。
在酵母的应用上，还需考虑其对酿造条件的适应性，以及是否能产生期望的风味特征。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵吴英玲 10197020 10生物创新班摘要：酵母菌喜欢酸性环境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培养基富集培养酵母菌，然后在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。
将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内4 ℃下保存。
用TTC显色剂及杜氏小管观察法筛选出发酵能力高的酵母菌。
并通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行微生物鉴定。
采用PVA-海藻酸钠固定化技术固定酵母细胞进行酒精发酵。
关键词：酵母菌分离鉴定固定化酒精发酵Abstract: Yeast like acid environment, the use of lactic acid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and duchenne tubular observation screen high fermentationability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation。
前言酵母菌（yeast）是一类单细胞真菌。
一般呈圆形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。
酵母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。
酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸入细胞内，在无氧的条件下，经过体内酶的作用，把单糖分解为二氧化碳和酒精。
此作用即酒精发酵。
C6H12O6(葡萄糖)→2 C2H5OH(酒精)+2 CO2↑在酿酒酵母酒精发酵的生产和应用中，由于细胞破碎和酶纯化等操作往往导致酶活性和稳定性都受影响，从而降低产酒精效率。
而利用细胞固定化可以很好的解决这一问题。
微生物细胞固定化方法主要有三种：载体结合法，交联法和包埋法，其中固定包埋法是目前比较理想的方法。
包埋法就是将微生物细胞均匀地包埋在多孔的水不溶性的紧密结构中，细胞中的酶处于活化状态，因而活性高，活力耐久。
目前，利用聚乙烯醇（PVA）—海藻酸盐是包埋法中比较高效的一种，这种方法以PVA-海藻酸钠作为混合溶胶，将酵母细胞固定起来进行酒精发酵，不仅可以使细胞浓度增加，而且可以多次使用，减少了酵母培养增殖所消耗的糖分；操作简单、过程迅速、颗粒不粘连、颗粒强度大大提高，且增加了颗粒的生物活性和稳定性，因此可实现连续化生产，提高酒精生产效率。
1.材料与方法1.1 材料1.1.1材料与试剂成熟葡萄皮、酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂、豆芽、去离子水、PVA 、海藻酸钠、CaCl2、红糖、异丙醇、乙醇、液氮、Taq酶、dNTPs、引物、酵母膏，葡萄糖，(NH4)2SO4，K2HPO4•3H2O，MgSO4•7H2O、H2SO4 ，1% K2Cr2O7 ，10% NaOH等1.1.2培养基乳酸豆芽葡萄糖培养液：豆芽（60 g）、葡萄糖（6 g）, pH 值4.5 。
YPG培养基（500 ml）：酵母膏（5 g）、蛋白胨（10 g）、葡萄糖（10 g）、琼脂（10 g）、pH值6.5～6.8。
TTC上层培养基：TTC 0.05 g、葡萄糖0.5 g、琼脂1.5 g、水l00 ml。
酒精发酵培养液：红糖100 g， (NH4)2SO4 2.0 g，KH2PO4 1.0 g，pH自然，去离子水定容至1000 ml。
1.1.3 实验器材酒精计、试管、杜氏小管、移液枪、滴管、显微镜、三角瓶、烘箱、烧杯、PCR仪，电泳仪、、接种环、电磁炉、报纸、橡皮筋等、玻璃棒、三角瓶、培养皿、试管、吸管、移液枪、漏斗、纱布、瓷缸、刮铲、载玻片、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、载玻片、盖玻片1.2 实验方法1.2.1 酵母菌的分离与培养取葡萄皮于90 ml无菌水，放置于摇床150 rpm，摇晃5 min，取出后稍静置。
用无菌枪头吸取上清液1 ml接入9 ml的乳酸豆芽葡萄糖培养液中，置28～30℃烘箱中培养48小时。
富集后用碘液染色后镜检。
然后用接种环在事先灭菌的YPG固体划线并置于28～30 ℃再培养48 h，得到酵母初筛单菌落，观察菌落，用碘液简单染色镜检。
1.2.2 发酵菌株的筛选向划线分离的YPG培养基上倒入TTC上层培养基，30 ℃下保温(阴暗处)2～3 h。
比较各菌株间的颜色深浅，颜色深的菌株呼吸酶活力强，有较强的产酒精能力。
选取平板中对应的颜色较深的10株菌，作为二级筛的出发菌株。
选取上述显色较深的酵母菌落，挑取一接种环接入乳酸豆芽葡萄糖培养液中，同时试管内倒置一杜氏小管，培养24 h后，观察杜氏管中产气情况。
打开棉塞，嗅闻是否有酒精气味。
记录产气及酒精气味情况，并与显色情况进行比较。
1.2.3 发酵菌株的鉴定进行形态学鉴定：A．菌落形态观察，按普通微生物实验指导书观察所分离的真菌菌落特征。
B. 细胞形态学观察，按普通微生物实验指导书简单制片法观察，先低倍镜，后高倍镜观察。
分子生物学鉴定：主要对核糖体小亚基16SrRNA进行PCR扩增鉴定，挑取形态学观察符合酵母特征的菌落作为扩增模版进行PCR，PCR体系(25ul)为：表一 PCR反应体系ddH2O10×PCR buffer（without MgCl2）MgCl2 (25 mM)dNTP(10 mM)5’primer(10 mM)3’primer(10 mM)Template（50 -500 ng/μl）Taq DNA polymerase(5U/μl)34.6 μl5 μl4 μl1 μl2 μl2 μl1 μl0.4 μlTotal 50 μl94℃预变性 5 min94℃变性 30 sec52℃退火 30 sec 40个循环72℃延伸 60 sec72℃延伸 5 min4℃保温（到达此温度时停止PCR扩增，将PCR管取出）将符合要求的样品，按公司测序订单要求填写。
测序结果登陆NCBI网站，进行在线比对分析。
1.2.4酿酒酵母细胞PVA-海藻酸钠固定化技术菌种活化：挑取酵母菌斜面菌种一环，接1环斜面菌苔于装有20mL培养基的150mL三角瓶中活化，置于恒温摇床内，150r/min培养24 h，25 ℃培养30 h。
再将其用0.85%生理盐水制成菌悬液，酵母数控制在108个/ml。
固定化：聚乙烯醇PVA-海藻酸钠混合胶于无菌烧杯中加热融化，冷却至45 ℃左右。
酵母菌液（预热至35 ℃左右）与聚乙烯醇PVA-海藻酸钠按1: 4比例（v/v）混合均匀后，制备固定化细胞。
用注射头直径为2 ml注射器以恒定速度滴到250 ml三角中，瓶中预先盛有50 ml的含2 % CaCl2溶液使形成凝胶珠。
然后取60粒凝胶珠加入150 ml无菌葡萄糖培养液中，置25 ℃下发酵4d，测定其酒精含量。
2.结果与分析2.1 发酵菌株初筛结果将葡萄皮中的酵母菌进行富集培养后酵母菌生长迅速，在液体培养基中比霉菌生长得快。
不同组材料来源不同，结果显示葡萄皮中的酵母菌数量较多。
故而在酒精发酵中，酵母菌选择的来源非常重要。
在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌，48h后观察菌落。
图一菌落呈乳白色，表面湿润、粘稠，易被挑起。
图二为高倍镜下观察到的酵母菌，箭头处明显观察到酵母菌的出芽生殖方式，几乎呈链状。
图三为平板划线后分离单菌落。
图发酵菌株初筛结果2.2 TTC法筛选酵母及酵母产气情况TTC(2，3，5一氯化苯基四氮哇)是一种显色剂，它对酵母的代谢产物发生呈色反应，通过它可以判断酵母中呼吸酶活力的大小，在YPG培养基上覆盖TTC上层培养基培养后出现深红色菌落，说明该菌株产酒精能力较强。
酵母进行酒精发酵过程会产生CO2，根据杜氏小管中产气多少可以间接判断酵母发酵能力的强弱。
再进一步挑取红色较深的菌落进行产气检验发现杜氏小关中气体较多，进一步说明所筛选的菌株具有较强的发酵能力，可以进行后续操作。
图四TTC法筛选正面图，图五为TTC法筛选反面，图六产气检验结果。
由第四管看出，CO2仍在不断产生气体，故而在后续操作中用此管中的酵母菌进行操作。
图 TTC法筛选酵母及酵母产气情况表二酵母菌落显色深浅与杜氏小管中产气多少之间的关系管号颜色产气量1号粉红++2号红+++3号粉红+4号深红++++2.3 分子生物学鉴定挑取发酵能力较强的菌落进行菌落PCR，电泳结果如图七，条带约为450bp，可以进行测序。
测序结果登陆NCBI网站，进行在线比对分析。
该序列与编码Irpex lacteus isolate T2b（Han,G., Feng,X. and Tian,X）的18S rRNA基因的部分序列有57%的相似度。
图八和图九为序列比对结果。
(此处仅展示分子生物学鉴定方法)图菌落PCR结果图序列比对结果2.4酿酒酵母细胞PVA-海藻酸钠固定化打开固定化细胞发酵的三角瓶，与未加凝胶珠的瓶子对比，嗅闻有酒香气，上层溶液有浑浊，凝胶珠形状是完好无损。
与其他组实验结果进行比较，从而选出酒精浓度最高一组，进行旋转蒸发获得高浓度酒精。
3.讨论与反思（1）本实验采用平板分离酵母菌时，培养时间不应该过长，因为长时间培养增加了染霉菌的可能性（图三），并且若需得到纯度较高的酵母菌则需进一步进行平板划线分离酵母菌菌株。
因此控制霉菌生长很重要，可采取多步平板划线的方式克服此难关。
（2）富集培养后需对溶液中酵母进行死活统计，从而初步判断此次富集的酵母菌的生存能力是否满足工业酵母生存能力。
死活统计的方法有0.l%美蓝染色液染色法，活酵母菌可使美蓝还原，从而使菌体不着色。
（3）表一中总结出TTC染色后，菌落颜色深浅和产气量的关系，颜色越深，产气量越多，故在后期酒精发酵时应挑取菌落颜色深的，提高酒精产量。