第8章 荧光免疫技术

中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。
标记方法:
搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间 短，荧光素用量少，但有非特异性染色。 透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。将装有待标记 蛋白的透析袋放入含荧光素的buffer中。标记比较匀， 非特异染色 较低。
荧光抗体的制备
称为荧光淬灭。
（如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等）
荧光淬灭是由于激发态电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。
荧光的基本知识
荧光偏振
FH－FL P＝────── FH＋FL
P：偏振度 FH：激发光起偏器和荧光检偏器的透射轴方向平行时测得的荧光强度 FL：上述两者方向互相垂直时测得的荧光强度
复合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检
测，或对自身抗体进行定性和滴度测定。
荧光抗体技术的内容
荧光抗体制备 标本制作 荧光抗体染色 荧光显微镜检查
一、荧光抗体的制备
抗体要求
高特异性 高亲和力 经纯化提取IgG (抗血清)
荧光抗体的制备
荧光素要求
有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解
第八章
荧光免疫技术
第一节 概述 一、荧光的基本知识 二、荧光物质
第二节 荧光抗体技术 一、荧光抗体的制备 二、标本的制作 三、荧光抗体染色与结果判断 四、荧光显微镜的基本结构 第三节 荧光免疫分析的类型 一、时间分辨荧光免疫测定 二、荧光偏振免疫测定 三、荧光酶免疫测定
第四节 荧光免疫技术在医学检验中的应用 一、荧光抗体技术的应用 二、荧光免疫测定的应用
双标记或多标记FAT 时间分辨荧光免疫测定
此外，还有荧光底物，如4-甲基伞酮磷酸盐、 4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷、对羟基苯乙酸。
第二节 荧光抗体技术
（Fluoresence Antibody Technique,FAT）
荧光抗体技术的基本原理
荧光素标记抗体与切片中组织/细胞抗原反应，
洗涤分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体
间接荧光抗体染色法示意图
荧光抗体染色及结果判断
双标记法
两种荧光素分别标记两种不同的特异性抗体，与 同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。反应 原理同直接法。 该法用于检测同一标本内的两种抗原。（流式）
荧光抗体染色及结果判断
荧光抗体染色结果判断
设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型， 阳性细胞的显色深浅可作为抗原定性、定位和定量的依据。
落射荧光显微镜光路(b)
光源、光路、激发滤光片、聚光镜等适宜组合，才能在黑色背景上获得满意的荧光。
第三节 荧光免疫分析的类型
荧光免疫分析的基本原理
将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合， 用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧
光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行
定量测定。
荧光免疫技术的类型
方法类型

双抗体夹心法 固相抗体竞争法 固相抗原竞争法
时间分辨荧光免疫测定
方法类型
双抗体夹心法
固相抗体和Eu3+标记抗体与 待检抗原结合，形成固相抗 体-待检抗原-Eu3+标记抗体 复合物，酸性增强液下， Eu3+解离，340nm激发光下发 射613nm荧光。 时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图
荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏 感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。 荧光抗体技术 荧光免疫技术 荧光免疫测定
均相荧光免疫测定
（homogeneous fluorescence immunoassay）
非均相荧光免疫测定
（heterogeneous fluorescence immunoassay）
时间分辨检测原理示意图
时间分辨荧光免疫测定
基本原 理
stokes位移
stokes位移:激发光谱和发光谱的波长差。
Stokes位移小，激发光谱和发射光谱常有重叠，相互干扰，影响检测结果的准确性。
镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱和发射光谱不重叠。
时间分辨荧光免疫测定
基本原理
发射光谱和激发光谱
荧光抗体的纯化
去除游离荧光素：透析或凝胶过滤（如G50，第1峰为结合峰，第2峰为荧
光素峰）
去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法
（未结合荧光素的抗体 荧光标记合适的抗体 过量结合的抗体（阴离子较多），收集中间段）
去除非特异反应抗体：动物肝粉吸收(最好是与试验标本同种的动物脏器)
荧光抗体的制备
样品发射荧光的强度，即荧光物质的发射光波长谱。
激发光谱：是指固定检测发射波长，用不同波长的激
发光激发样品记录的相应的荧光发射强度，即能激发 荧光物质产生荧光的激发光波长谱。
荧光的基本知识
荧光效率
定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率
计算公式: 荧光效率=
发射荧光的光量子数（ 荧光强度） 吸收光的光量子数（激 发光强度）
时间分辨荧光免疫测定
基本原理
信号增强
Eu3+标记抗原 抗体复合物
酸性增强液
Eu3+解离
结合β-二酮体
荧光增强
时间分辨荧光免疫测定
常见荧光物质的荧光寿命
标记物
镧系元素
铕(Eu3+)（最常用） 钐(Sm3+) 铽(Tb3+)（te） 钕(Nd3+) 镝(Dy3+)
荧光物质 非特异荧光背景 人血清蛋白 球蛋白 细胞色素C FITC 丹黄酰氯
思考题 小结
第一节 概 述
一、荧光的基本知识
荧光（fluorescence）
荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃 迁到激发态，当其回复至基态时，以波长大于激发 光波长的发射光形式释放出能量，此发射光称为荧 光。
荧光的基本知识
发射光谱和激发光谱
发射光谱：是指固定激发波长，在不同波长下记录的
利用一定波长的激发光对 样品进行激发，产生一定波长 的荧光，对样品结构或其组分 进行定性、定位、定量观察检 测。
荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯
滤光片：隔热、激发和吸收滤光片
光路：透射光、落射光 聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器
镜头：消色差镜头 、复色差镜头、氟处理镜头
时间分辨荧光免疫测定
方法类型
固相抗体竞争法
荧光寿命(ns) 荧光物质 1～10 4.1 3.0 3.5 4.5 14 Sm3+ -β-NTA Sm3+-PTA Eu3+-β-NTA Eu3+-PTA Tb3+-PTA Dy3+-PTA
荧光寿命(ns) 65000 60000 714000 925000 96000 1000
罗丹明B
3.0
镧系元素离子在游离状态下，荧光信号很弱，只有与适当螯合剂形成螯合物 后，可使荧光得到增强，而螯合物的荧光寿命与形成螯合物的配位体有关。 NTA:萘甲酰三氟丙酮; PTA：三甲基乙酰三氟丙酮
印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织
涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液 培养细胞：单层培养细胞
标本的制作
组织切片的类型
冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清晰。 石蜡切片：组织细胞结构显现清楚，抗原损失多（抗原修
复）。
标本的制作
标本的固定和保存
固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等 保
当P=0时，说明完全不偏振；当P在-1至1之间，即为部分偏振
二、荧光物质
荧光物质：是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。
常用的荧光物质
荧光物质 最大吸收光谱 最大发射光谱 应用
异硫氰酸荧光素 (FITC)（应用最广泛）
490～495nm
520～530nm （黄绿 色）
595～600nm（橙红 色） 620nm（橙红色） 578nm（红色） 430nm（蓝色） 613nm
选择激发光波长在最接近于荧光物质的最大吸收峰处，而测定荧光 波长设在接近于最大发射光波峰时，可得到最高的荧光效率。
荧光的基本知识
荧光寿命
定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程
度时所用的时间。
激发光消失，荧光现象随之消失，但各种荧光物质
的荧光寿命不同。
荧光的基本知识
荧光淬灭
定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退
荧光免疫测定的方法类型
非均相荧光免疫测定： 时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定 均相荧光免疫测定：
荧光偏振免疫测定
一、时间分辨荧光免疫测定
基本原理
时间分辨
自发荧光寿命短:1ns～10ns 镧系元素寿命长:10μs～1000μs 短寿命荧光完全衰变后再测定镧系
元素特异荧光（可有效降低本底荧光的干扰）。
抗体效价：双向免疫扩散试验 抗体特异性：吸收试验（加入过量抗原后，应不与阳性标本反应）、抑制
试验（阳性标本与未标抗体预结合后，应不与荧光抗体结合） 荧光抗体抗体特异性染色滴度：倍比稀释
荧光抗体的制备
荧光抗体的保存
-20℃：保存1～2年
真空干燥：长期保存
二、标本的制作
标本的类型
组织切片：冷冻切片、石蜡切片
离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。
荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高的荧光效率。 荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。 与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。
标记方法简单、安全无毒。
与蛋白质的结合物稳定，易于保存。
荧光抗体的制备
抗体的荧光素标 记
标记原理:利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液