时间分辨荧光微球在免疫层析领域的介绍和应用
时间分辨荧光免疫层析 技术原理
时间分辨荧光免疫层析技术原理
时间分辨荧光免疫层析技术（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，利用
镧系元素标记抗原或抗体，通过时间分辨技术测量荧光。
具体来说，当含有待测抗原（抗体）的样品滴在加样区时，待测样品中的抗原（抗体）与结合垫中的荧光纳米微球标记的抗体（抗原）结合并通过毛细作用向前层析。
当达到检测区后，与检测线上固定的抗体（抗原）结合，形成微粒-抗体-抗原-抗体夹心复合物并被固定在检测线上，而多余的荧光微
球标记物继续向前层析，与固定在质控线上的二抗结合。
反应结束后，用紫外光源（340nm）对检测区扫描检测，检测线和质控线
上荧光纳米微球发出高强度的荧光（615nm），且衰变时间也较长。
通过
测量延缓时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光（1-10ns）全部衰变后，再测量稀土元素的特异性荧光，这样就可以排除非特异本底荧光的干扰。
通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样品中待测物的浓度。
这种技术具有高灵敏度、高特异性和可定量分析等特点。
以上内容仅供参考，如需更多信息，建议查阅时间分辨荧光免疫层析相关文献或咨询该领域专家。
时间分辨荧光技术原理及应用
免疫细胞
免疫器官
按其功能不同分为： 中枢免疫器官：
免疫细胞发生、分化和 成熟的场所。
包括：胸腺和骨髓(人和 哺乳动物)；法式囊(禽类)。
外周免疫器官及组织 ： 1.B细胞成熟的场所； 2.免疫应答的发生部位。 包括：淋巴结 脾脏 粘膜
电化学发光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA） 是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体，在电 场中因电子转移而发生特异性化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。
电化学发光免疫测定示意图
标记磁颗粒在电场中发光工作示意图
钐(Sm)，铕(Eu)，镝(Dy)，锝(Te) 可实现多项目同时检测，
减少操作偶然误差。
原子标记技术
多个标记位点（多达20个）灵敏度更高。 原子标记，对抗体结构影响小，保证检测的高灵敏
性，高精确度。 惰性元素，无衰变保质期1年。 物理发光影响小，受环境影响小，可以多次检测。 解离增强技术可使其荧光性提高100万倍，线性范围
钩状效应在凝集曲线上表现为类似抛物线的形状。
医学免疫学化诊断技术
医学免疫学化诊断技术分为： 同位素放射免疫 非放射免疫分析
吸收光谱法
酶联ELSIA
发射光谱法
酶联化学发光 直接化学发光 电化学发光 荧光偏振 时间分辨
主流化学发光介绍
发光免疫分析：是将发光分析和免疫反应相结合而建立 起来的一种新的检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技 术。
1876年 多种病原菌被发现——疫苗广泛应用
抗原抗体的基本概念
抗原（antigen,Ag)
是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答 产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效 应的物质。
时间分辨免疫荧光微球
时间分辨免疫荧光微球1. 引言1.1 背景介绍时间分辨免疫荧光微球是一种新型的生物标记技术，可以对免疫学实验数据进行高效、准确的检测分析。
随着生物技术的发展和应用，对于细胞分析和药物筛选等领域的需求日益增加，传统的免疫荧光检测方法已经不能满足科研和临床的需求。
研究人员开始探索新的技术手段来提高实验的灵敏度和准确度。
时间分辨免疫荧光微球具有高灵敏度、高通量和高分辨率的特点，可以同时检测多种生物标记物，实现快速、准确地定量分析。
其原理基于微球上包裹有特定的免疫荧光标记物，当这些微球与待测样品中的靶分子结合时，通过流式细胞仪等仪器可以实时监测免疫反应的强度和时间，从而获得更精确的实验数据。
通过时间分辨免疫荧光微球技术，研究人员可以更加深入地了解细胞内的免疫反应过程，快速筛选药物的活性和副作用，为疾病诊断和治疗提供重要的参考依据。
随着该技术在生命科学领域的不断应用和发展，相信将会有更多的创新和突破出现，为人类健康和生命的发展带来积极的影响。
1.2 研究目的研究目的是通过研究时间分辨免疫荧光微球，深入探究其在生物医学领域中的应用潜力。
通过了解其原理和实验方法，我们的目的是揭示其在疾病诊断、药物递送和细胞标记等方面的优势和局限性，为其未来的应用前景做出预测。
通过这项研究，我们希望能够为生物医学领域的研究和临床实践提供新的技术手段和思路，为推动医疗健康行业的发展做出贡献。
2. 正文2.1 原理介绍时间分辨免疫荧光微球是一种新型的生物分析技术，利用微球作为载体，结合免疫荧光标记技术，实现对不同生物标记物的高灵敏、高特异性检测。
其原理基于时间分辨光谱技术，通过采集微球悬液中的荧光信号，在不同时间点进行检测和分析，从而实现对样品中不同荧光标记物的准确识别和定量测定。
在时间分辨光谱技术中，光谱仪器以一定的时间间隔对样品中的荧光信号进行连续检测，通过对这些时间点上的信号强度和波长进行分析，可以区分出不同的荧光标记物并消除背景信号的干扰。
美牛生物的微球使用说明书(300nm)
时间分辨荧光微球说明书一、产品简介本产品是针对免疫层析检测(lateral flow immunoassay)试剂设计，采用时间分辨荧光染料与苯乙烯共聚而成。
具有stokes位移大、聚集时不会发生内淬灭效应、检测信号强、荧光染料包在微球里面，不易受外界环境影响、荧光稳定等特点，是免疫荧光定量层析理想的标记物。
二、微球参数1、成分：稀土元素铕的荧光配合物修饰的改性聚苯乙烯微球2、固含：1%（1ml悬浮液中含有10mg微球）3、平均粒径：300nm4、粒径均一性：CV<5%5、官能团：羧基、硫酸基等6、羧基含量：300±20μmol/g7、荧光性能：激发波长365nm，发射波长：610nm8、荧光寿命：720μs9、密度：1.05g/cm310、折射率：1.59（589nm，25℃）11、外观：白色乳液三：微球保存保存条件：2-8℃避光、密封保存，不能反复冻融。
四、使用方法（一）活化步骤：1、超声分散微球，约2min，然后手工摇匀；2、在2mL的EP管中，加入100μL微球（固含1%），再加超纯水（或MES缓冲液）900μL，待用；3、配制：10mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)乙醇溶液A液10mg/ml 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)乙醇溶液B液注意：NHS、EDC均易吸潮，称量前这两种试剂需复温30min以上。
4、在微球悬液中加入5μl的A液、混匀，再加入5μl的B液、再次混匀，室温反应15～30min；5、12000r/min，离心15min，去上清，加入1ml超纯水（或抗体偶连缓冲液），然后超声分散均匀。
注意：一定要彻底分散，否则交联抗体后的微球极易团聚，跑条带很差。
（二）抗体交联特别注意交联所用的抗体是否产生沉淀，如果产生沉淀则需对抗体进行离心或者过滤处理，否则将导致交联后的微球发生团聚。
过滤处理或者离心处理的抗体需要重新测定抗体浓度。
微球表面交联抗体的量为：抗体/微球=10～50μg/mg，最佳标记量一般为20μg/mg。
免疫层析标记物及其标记技术
胶体金与蛋白质的结合
• 确定所用蛋白比例（一般15~20ug/mL胶体金），加入BSA，PEG等稳定剂。 免疫胶体金的纯化 • 超速离心，复溶液保存。
胶乳标记技术
采用羧基化（COOH）的荧光微球，微球大小在200~500nm（F4、
F1、F2)。
其标记的大致流程如下： • 将荧光微球进行清洗，并更换为标记所需缓冲液； • 加入EDC和Sulfo-NHS进行活化； • 加入待标记蛋白经行交联；
量子点
QDs的发射光谱可以通过改变QDs的尺寸大小来控制，用单一波长
的光即可激发产生多种不同颜色的荧光，被认为是最适合作为多标
记检测的标记物； QDs激发谱宽而发射谱窄，并且具有较大的Stokes位移，都在很大
程度上提高检测的准确性；
QDs荧光寿命长，即不易衰变，稳定性高，可重复检测。 QDs在制备、修饰及抗原抗体标记等环节受到技术要求制约，结合 物稳定性也有待提高，并且检测时需紫外光作为激发光，仪器设备 要求和成本都较高。
高分子胶乳颗粒的表面修饰不够灵活，且由于多数具有输水性质，
而易发生非特异性吸附。
上转磷光颗粒
上转磷光材料( up-convertingphosphor，UCP) 是新近发展起来的
由 2 种稀土金属元素（分别作为光吸收子和发射子）掺杂于氧化硫 等惰性材料中构成的一类能上转发光产生磷光的纳米级示踪材料。
免疫磁珠
免疫磁珠（immunomagnetic beads，IMB） 是包被有单克隆抗体的 磁性微球，可与含有相应抗原的靶物质特异性结合形成复合物，是 近年来发展起来的一项新的免疫学技术。磁性免疫层析技术利用超
顺磁性纳米微粒作为标记物，由高灵敏度磁性检测仪测量包被了免
时间分辨荧光微球免疫层析法定量检测克伦特罗
时间分辨荧光微球免疫层析法定量检测克伦特罗赖科洋;陈媛【摘要】建立了一种定量检测克伦特罗的时间分辨荧光微球免疫层析法.对抗体标记量、微孔中克伦特罗抗体-时间分辨荧光微球探针的体积以及检测线上抗原浓度进行了优化.通过时间分辨荧光微球试纸条检测仪读取试纸条上检测线和质控线的信号强度,以克伦特罗标准品的浓度为横坐标,以检测线和质控线信号强度的比值为纵坐标建立标准曲线.结果表明:该方法定量检测范围为0.01～0.81μg/L,检测限为0.004μg/L,半抑制率为0.06μg/L.本检测方法具有简便、灵敏度高、快速和可定量等特点,适合于大批量样品的现场筛查.【期刊名称】《江西科学》【年(卷),期】2018(036)002【总页数】4页(P244-247)【关键词】时间分辨荧光微球;克伦特罗;检测;免疫层析【作者】赖科洋;陈媛【作者单位】南昌市第三中学,330029,南昌;南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,330047,南昌【正文语种】中文【中图分类】O657.30 引言克伦特罗(Clenbuterol,CLE)是一种β-肾上腺素受体激动剂，最初作为一种饲料添加剂用于畜牧业养殖，能够显著地提高动物瘦肉率，俗称“瘦肉精”[1]。
人食用残留有CLE的肉制品后会引起如心悸、头晕、心跳加快等中毒症状[2]，对人的身体健康造成危害。
因此，我国明文禁止CLE用于饲料添加剂，规定在动物性食品中不得检出CLE[3]。
目前，分析CLE残留常用的方法有气相色谱串联质谱法[4]、液相色谱串联质谱法[5-6]、高效液相色谱法[7]、酶联免疫吸附法[8-9]和胶体金免疫层析法(Colloidal gold lateral flow assay,CGLFA)[10-11]等。
前4种方法具有灵敏度高、准确性好、特异性强的优点，不过检测时间长、操作复杂、费用高，不适合大量样本的现场筛查。
CGLFA具有快速、简便和费用低等优点[12]，但该检测方法灵敏度较差，一般只用于定性分析。
时间分辨荧光免疫层析技术简介
• 测向流层析 • 垂直流层析（渗滤法）
免疫层析技术原理
侧向流层析
• 固定相：固定有检测线和控制线的纤维层析材料（NC膜） • 流动相：测试液 • 移动：毛细作用 • 结合：游离态待测物在固相捕获线处发生特异性免疫反应
图1 典型侧向流免疫层析试纸条构造（来源：Merck Estapor）
时间分辨荧光免疫层析技术简介
主要内容
1
免疫层析技术原理
2
免工疫作问标题记机材解决料方介案绍
3
时间分辨荧光分析法
4
应用实例
免疫层析技术原理
免疫层析技术是建立在层析技术和抗原-抗体特异性免疫反应基础上的一 项新兴免疫检测技术。
发展阶段：
• 初期：定性检测 • 新阶段：半定量、定量检测（信号放大、信号转换）
• 荧光寿命(Fluorescence lifetime)：荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度所用的 时间。
• 荧光猝灭(Fluorescence quenching)：荧光物质在某些理化因素（如紫外线照射、高温、 某些硝基化合物、重氮化合物、重金属、卤素阴离子等）的作用下，激发态分子的电子不能 回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射，从而导致荧光减弱甚至消退的现象。引 起荧光猝灭的物质称为猝灭剂，常用于消除不需要的荧光。
表1 几种常见的荧光物质
荧光物质
最大吸收光谱
异硫氰酸荧光素 (FITC)
490～495nm
四乙基罗丹明 (RB200) 四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC) 藻红蛋白（PE） 7-氨基-4-甲基香豆素
570～575nm 550nm 490-560nm 354nm
Alexa Fluor、CF Dye等新一代荧光染料系列 多种区段供选
时间分辨荧光免疫分析
时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析(time-reso1vedfIuoroimmunoassay,TRFIA)是80年代初问世的一种超灵敏度的标记免疫检测技术。
其主要特点是以锢系元素铺(Eu3υ等标记抗体或抗原为示踪剂，利用增强液的荧光放大作用和时间分辨荧光法排除样品或试剂中非特异性荧光物质的干扰，最大限度地提高了检测方法的灵敏度和特异性，还具有量程宽,操作简便,标记物容易制备，稳定性好，保存期长等诸多优点。
一、基本原理与放免分析相似，总体上分为竞争法和非竞争法两类，前者多用于小分子半抗原，后者用于大分子化合物。
铺系元素第(Eu).彭(Sn1)、轼(Tb)和钛(Nd)通过双功能螯合剂，在水溶液中很容易与抗原或抗体分子以共价双键结合。
经抗原、抗体间特异性的免疫结合反应，测定免疫复合物的荧光强度，就可推算待测物质的浓度。
辆系离子的荧光信号极弱，需要在酸性条件下，解离出铺系离子，然后与荧光增强液中的B-二酮体生成新的螯合物，经紫外光激发可产生强而持久的荧光信号，其增强效力可达100万倍，故又称解离增强铺系荧光免疫分析(dissociation-enhanced-1anthanidefIuoroimmunoassay,DE1FIA)o锢系元素的发光时间延长，如Eu*和Snr的荧光衰变时间分别达到 4.3×IOns和4.1×10,ns,而样品和试剂中的自然本底荧光的衰变时间仅为4-10ns,通过延迟测量时间，使信号不受本底荧光影响。
此外，锢系元素螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，StOkeS位移大，有利于排除非特异性散射光的干扰，进一步提高荧光信号的特异性。
二、试剂组成(一)EuS标记物：可分为标记抗体、标记抗原，要求有较高的纯度、比活性和免疫活性。
密封后4。
C或-20。
C保存，但应避免反复冻融。
若发现蛋白质聚合，非特异性结合升高，则应停止使用。
(二)固相抗体或抗原：固相载体多用聚苯乙烯微孔条，要求透明度高，吸附性能好，材质均匀，孔间差异小，不同品牌甚至不同批号的微孔条间都会有明显的性能差异，应引起注意。
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偶联微球的固化
喷膜：将偶联后微球稀释，用喷膜仪固化在样品垫上，烘干
适用于干式检测，样本质检检测或直接检测。 优点：操作简单，时间短，成本低，微球用量低。缺点：对配方要求高
冻干：微球用稀释液稀释后，冻干机冻干
微球用稀释液稀释后用冻干机冻干 优点：保存周期长，均一性好。缺点：成本高，生产周期长，冻干机需要专业人员操作，检测操作多一步。
缓冲液的离子浓度，缓冲液类型，PH值根据不同厂家的微 球，不同抗体来筛选。EDC和NHS的用量根据实验结果来 筛选。
离心的离心力，离心时间根据微球的粒径来调整，离心力 太小，则离心不完全，损失微球，离心力太大，溶液导致 微球聚集
偶联
抗体，抗原标记浓度，偶联PH值，偶联时间，偶联 温度
封闭
封闭剂：BSA，酪蛋白，乙醇胺，Tris，脱 脂奶粉
时间分辨荧光微球在免疫层析领域的介绍和应用
20180227
时间分辨荧光微球的介绍
¡ 时间分辨荧光免疫分析法是目前与化学发光、电化学发光并驾齐驱的三种超敏免疫分析方法 之一。其原理是采用较长荧光半衰期的稀土离子作标记物，由于这种标记物Stokes位移大(＞ 150nm)且荧光寿命比本底物质荧光寿命高5～6个数量级，因此，测定时只要延缓测量时间， 待本底物质的荧光充分衰减后再测定标记物的信号就可有效地消除各种非特异性荧光的干扰， 获得很高的灵敏度。
的 保 存
记 环 境 是
价的 不影 同响
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检 测 过 程 中 的 问 题
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安捷伦
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南京微 测
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苏州为 度
光常 微用 球时
间 分 辨 荧
液体保存：微球直接稀释
微球直接稀释保存在离心管中 优点：直接稀释，操作简单。缺点：难以保存，稳定差。
抽干：抽干机抽干
将微球抽干在枪头，离心管，样品杯，或枪头中。 优点：操作简单。缺点：不适合大量批量操作，对配方要求高。检测操作多一步。
微球聚 集
• 偶联，活化PH值影响，会在活化之后表现出来 • 活化过度，影响微球电荷平衡，会在活化之后表现出来 • 离心过度，复溶后表现出来
微球不 能完全
释放
• 微球稀释液配方 • 样品垫的筛选和处理 • 样品稀释液的筛选
检测过 程中微 球聚集
• NC膜孔径的选择 • 样品稀释液的选择 • 样品垫的选择 • 样本中某些物质的影响
检 测 过 程 中 的 问 题
¡
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¡. ¡.
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因 3 均 2 均果 1 均 3 响 2 范 1 灵 的 3 2 1 测效
¡ 时间分辨荧光微球(Time Resolved Fluorescent Microsphere)作为一种特殊的功能微球， 每个微球中可包裹成千上万个荧光分子，大大提高了荧光的标记效率，有效提高了分析灵敏度； 同时荧光微球表面修饰有合适密度的羧基或其它功能基团，用于与蛋白或抗体的共价偶联，提 高了标记物的稳定性。更为重要的是由于微球包埋的稀土离子已经过了螯合，无需解离增强步 骤，因此从根本上解决了传统的DELFIA法只能在液相中而不能在固相界面反应的问题，从而解 决了将时间分辨荧光应用于免疫层析平台的技术瓶颈，在此基础上可开发出灵敏度高于普通胶 体金或有色乳胶免疫层析方法1-3个数量级的定量检测技术。同样时间分辨荧光微球也可以用 于微孔板超敏定量检测技术平台，只需洗涤几次后即可进行荧光测定，操作步骤比DELFIA简单 很多，更容易实现自动化操作。
时间分辨荧光微球
u 极宽的stoke位移：可消除基质的干扰，提升准确性； u 极长的荧光猝灭时间：可降低背景信号，提升灵敏度；
时间分辨荧光微球常用类型
¡ 粒径：50nm~400nm ¡ 基团类型：羧基，氨基，醛基 ¡ 微球修饰：原子手臂，亲和素
微球偶联抗体或抗原
活化 离心
MES，PBS，硼酸缓冲液稀释微球；EDC，NHS活化；
素样 一划 一微微 一
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品 性膜 性球球 性 膜
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