时间分辨荧光免疫层析技术简介共28页
荧光免疫层析法 定量
荧光免疫层析法定量摘要：一、荧光免疫层析法的概述二、荧光免疫层析法的原理三、荧光免疫层析法的定量方法四、荧光免疫层析法的应用领域五、荧光免疫层析法的优势与局限性正文：一、荧光免疫层析法的概述荧光免疫层析法是一种基于抗原抗体反应原理的免疫学检测方法，它利用荧光标记的抗体或抗原与待检测样本中的相应抗原或抗体结合，通过层析技术将结合物与游离物分离，最后通过荧光信号检测系统实现对目标分子的定量检测。
二、荧光免疫层析法的原理荧光免疫层析法主要利用抗原抗体特异性结合原理，将荧光标记的抗体或抗原与待检测样本中的相应抗原或抗体结合，形成荧光标记的抗原抗体复合物。
然后，通过层析介质将荧光标记的抗原抗体复合物与游离的荧光标记抗体或抗原分离。
最后，通过检测系统检测层析介质上的荧光信号强度，从而实现对目标分子的定量检测。
三、荧光免疫层析法的定量方法荧光免疫层析法的定量方法主要通过测量荧光信号的强度来实现。
一般采用相对荧光强度（RFI）或绝对荧光强度（AFU）作为定量指标。
相对荧光强度是通过比较样本荧光信号与对照荧光信号的强度比值来计算的，而绝对荧光强度则是通过测量样本荧光信号的强度值来计算的。
四、荧光免疫层析法的应用领域荧光免疫层析法广泛应用于生物医学、食品安全、环境监测等领域。
例如，在生物医学领域，荧光免疫层析法可用于疾病诊断、疾病标志物的检测等；在食品安全领域，荧光免疫层析法可用于检测食品中的有害物质，如重金属、农药残留等；在环境监测领域，荧光免疫层析法可用于检测水体、土壤中的污染物，如重金属、有机污染物等。
五、荧光免疫层析法的优势与局限性荧光免疫层析法的优势主要体现在以下几个方面：1.高灵敏度，可实现对低浓度目标分子的检测；2.高特异性，可避免非特异性荧光信号的干扰；3.快速简便，适合现场快速检测；4.定量准确，可实现对目标分子的准确定量。
时间分辨荧光免疫技术
利用不同的荧光标记物，可以特异地标记不同的抗原或抗体，从而实现多种蛋白质的同时 检测，提高检测的特异性。
检测范围广
时间分辨荧光免疫技术可以检测多种类型的生物分子，包括蛋白质、细胞因子、酶、激素 等，有助于全面了解生物系统的功能和调控机制。
时间分辨荧光免疫技术的局限性
01
成本较高
时间分辨荧光免疫技术需要使用特殊的仪器设备，如时间分辨荧光免
疫分析仪，同时需要使用特定的荧光标记物，因此成本较高，限制了
其在临床上的广泛应用。
02
操作繁琐
时间分辨荧光免疫技术的操作较为繁琐，需要经过多个步骤，包括抗
原-抗体反应、洗涤、加激发剂等，需要专业技术人员进行操作，不适
合在基层医疗单位推广应用。
03
有放射性污染
时间分辨荧光免疫技术需要使用放射性元素作为荧光标记物，存在一
定的放射性污染，对环境和操作人员有一定的危害。
未来研究和发展方向
简化操作流程
通过研究新的标记物和检测方法，简化时间分辨荧光免疫技术的操作流程，降低操作难度 ，提高其普及程度。
提高检测速度
通过改进仪器设备和检测方法，提高时间分辨荧光免疫技术的检测速度，缩短检测时间， 提高其应用价值。
发展个性化医疗
结合基因组学、代谢组学等多学科技术，发展针对不同疾病和人群的个性化诊断试剂盒和 治疗方案，提高医疗服务的效率和质量。
基因表达研究
利用时间分辨荧光免疫技术可以检测生物样本中特定基因的 表达水平，有助于研究基因与疾病之间的关系。
蛋白质分析
通过时间分辨荧光免疫技术可以对蛋白质进行定量和定性分 析，了解蛋白质的生物功能和相互作用。
医学领域
疾病诊断
时间分辨荧光免疫技术可用于疾病诊断，如检测肿瘤标志物、感染性疾病抗 体等，提高诊断准确性和灵敏度。
时间分辨荧光免疫层析 技术原理
时间分辨荧光免疫层析技术原理
时间分辨荧光免疫层析技术（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，利用
镧系元素标记抗原或抗体，通过时间分辨技术测量荧光。
具体来说，当含有待测抗原（抗体）的样品滴在加样区时，待测样品中的抗原（抗体）与结合垫中的荧光纳米微球标记的抗体（抗原）结合并通过毛细作用向前层析。
当达到检测区后，与检测线上固定的抗体（抗原）结合，形成微粒-抗体-抗原-抗体夹心复合物并被固定在检测线上，而多余的荧光微
球标记物继续向前层析，与固定在质控线上的二抗结合。
反应结束后，用紫外光源（340nm）对检测区扫描检测，检测线和质控线
上荧光纳米微球发出高强度的荧光（615nm），且衰变时间也较长。
通过
测量延缓时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光（1-10ns）全部衰变后，再测量稀土元素的特异性荧光，这样就可以排除非特异本底荧光的干扰。
通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样品中待测物的浓度。
这种技术具有高灵敏度、高特异性和可定量分析等特点。
以上内容仅供参考，如需更多信息，建议查阅时间分辨荧光免疫层析相关文献或咨询该领域专家。
荧光免疫层析技术原理进展课件
控制和监测，包括自动加样、自动洗涤、 智能等技术手段对检测结果进行自动分
自动读数等环节。这不仅可以减少人为 析和解释。这有助于提高检测的准确性
误差和操作时间，还可以提高检测的准 和可靠性，并可应用于临床诊断和治疗
确性和可重复性。
方案的制定。
04
荧光免疫层析技术挑战 与前景
技术瓶颈与解决方案
技术瓶颈
荧光标记物是荧光免疫层析技术中的关键要素，其性能直接影响检测的灵敏度和特 异性。近年来，科研人员致力于研发新型荧光标记物，以提高检测性能。
新型荧光标记物包括量子点、上转换发光材料和多色荧光染料等。这些新型荧光标 记物具有更高的发光强度和稳定性，能够提高检测的灵敏度和准确性。
此外，新型荧光标记物还具有优异的光学性质，如长寿命、宽激发光谱和窄发射光 谱等，有助于实现多色标记和多重检测，提高检测的特异性。
技术在生物医学领域的前景
01
02
03
疾病诊断
荧光免疫层析技术具有高 灵敏度和特异性的特点， 可广泛应用于传染病、肿 瘤等疾病的早期诊断。
药物研发
荧光免疫层析技术可用于 药物筛选、药效评估和药 物代谢等方面的研究，加 速新药研发进程。
生物安全
荧光免疫层析技术可用于 检测生物武器和生物恐怖 袭击物质，保障国家安全 和公共卫生安全。
实例二：肿瘤标志物检测中的应用
总结词
荧光免疫层析技术用于肿瘤标志物检测，有助于早期发现肿瘤，提高患者生存率。
详细描述
通过检测患者血清或尿液中的肿瘤标志物，如癌胚抗原、甲胎蛋白等，利用荧光免疫层析技术可实现 肿瘤的早期诊断。该技术具有高灵敏度和特异性，能够提高肿瘤检出率，为患者早期治疗提供有力支 持。
分离机制
[课件]时间分辨荧光技术PPT
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加样本
10
振荡、洗板11加入E Nhomakorabea标12
Eu 标 记 物
轻链 螯合剂
Eu
V
重链
13
振荡、洗板
14
加入解离增强液
15
16
仪器检测
17
标记物为稀土金属---镧系元素
铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、锝(Tb) 镧系元素荧光特点： 1、荧光寿命极长 • 镧系元素螯合物（60~900 us) <铕：714us> • 普通荧光免疫中荧光团：1~100us • 样本中蛋白质荧光：1~10us，易猝灭 2、Stokes位移大（大约290nm）有利于排除非特异荧光的干扰，增强测 量的特异性。 • 铕：激发光340nm、发射光613nm
TRFIA的反应模式目前应用最广泛的是固相双位点夹心法和竞争法 。 竞争法又有两种：(1)标记抗原与未标记抗原竞争抗体；(2)固体抗原和游 离抗原竞争标记抗体。夹心法一般用于测定蛋白质类大分子化合物，竞 争法多用于检测小分子半抗原。 无论何种反应类型，最终都要形成结合有镧系离子的抗体 - 抗原免疫复 合物。因为稀土离子很难直接与抗原或抗体结合，这就需要在标记待测 物质时采用双功能基团结构螯合剂，此螫合剂必须一端与镧系稀土离子 结合，另一端则与抗体上的自由氨基连接，形成免疫复合物。 由于水的淬灭效应，该免疫复合物在弱碱性缓冲液中经紫外光激发产 生的荧光信号相当弱，可以通过加入增强液解决此问题。该增强液能使 镧系元素从免疫复合物中解离，并和增强液中非离子型的表面活性剂形 成大分子微囊，这种微囊可以最大限度地传递能量，阻断水的淬灭效应 。此时，再用紫外光激发就会产生很强的荧光，增强效果可达上百万倍 。
微生物诊断
由于TRFIA灵敏度高，目前TRFIA已广泛用于各种传染病的诊断及研 究，包括甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、脑炎病毒、A型流感、呼吸道 合胞病毒、轮状病毒、免疫缺陷病病毒及出血热病毒等。
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6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难得的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加 9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿
时间分辨荧光免疫层析技术简介
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6、黄金时代是在我们的前面，而不在 我们的 后面。
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7、心急吃不了热汤圆。
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8、你可以很有个性，但某些时候请收 敛。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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9、只为成功找方法，不为失败找借口 (蹩脚 的工人 总是说 工具不 好)。
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10、只要下定决心克服恐惧，便几乎 能克服 任何恐 惧。因 为，请 记住， 除了在 脑海中 ，恐惧 无处藏 身。-- 戴尔． 卡耐基 。
时间分辨荧光免疫层析技术简介
• 测向流层析 • 垂直流层析（渗滤法）
免疫层析技术原理
侧向流层析
• 固定相：固定有检测线和控制线的纤维层析材料（NC膜） • 流动相：测试液 • 移动：毛细作用 • 结合：游离态待测物在固相捕获线处发生特异性免疫反应
图1 典型侧向流免疫层析试纸条构造（来源：Merck Estapor）
时间分辨荧光免疫层析技术简介
主要内容
1
免疫层析技术原理
2
免工疫作问标题记机材解决料方介案绍
3
时间分辨荧光分析法
4
应用实例
免疫层析技术原理
免疫层析技术是建立在层析技术和抗原-抗体特异性免疫反应基础上的一 项新兴免疫检测技术。
发展阶段：
• 初期：定性检测 • 新阶段：半定量、定量检测（信号放大、信号转换）
• 荧光寿命(Fluorescence lifetime)：荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度所用的 时间。
• 荧光猝灭(Fluorescence quenching)：荧光物质在某些理化因素（如紫外线照射、高温、 某些硝基化合物、重氮化合物、重金属、卤素阴离子等）的作用下，激发态分子的电子不能 回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射，从而导致荧光减弱甚至消退的现象。引 起荧光猝灭的物质称为猝灭剂，常用于消除不需要的荧光。
表1 几种常见的荧光物质
荧光物质
最大吸收光谱
异硫氰酸荧光素 (FITC)
490～495nm
四乙基罗丹明 (RB200) 四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC) 藻红蛋白（PE） 7-氨基-4-甲基香豆素
570～575nm 550nm 490-560nm 354nm
Alexa Fluor、CF Dye等新一代荧光染料系列 多种区段供选
时间分辨荧光免疫分析
时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析(time-reso1vedfIuoroimmunoassay,TRFIA)是80年代初问世的一种超灵敏度的标记免疫检测技术。
其主要特点是以锢系元素铺(Eu3υ等标记抗体或抗原为示踪剂，利用增强液的荧光放大作用和时间分辨荧光法排除样品或试剂中非特异性荧光物质的干扰，最大限度地提高了检测方法的灵敏度和特异性，还具有量程宽,操作简便,标记物容易制备，稳定性好，保存期长等诸多优点。
一、基本原理与放免分析相似，总体上分为竞争法和非竞争法两类，前者多用于小分子半抗原，后者用于大分子化合物。
铺系元素第(Eu).彭(Sn1)、轼(Tb)和钛(Nd)通过双功能螯合剂，在水溶液中很容易与抗原或抗体分子以共价双键结合。
经抗原、抗体间特异性的免疫结合反应，测定免疫复合物的荧光强度，就可推算待测物质的浓度。
辆系离子的荧光信号极弱，需要在酸性条件下，解离出铺系离子，然后与荧光增强液中的B-二酮体生成新的螯合物，经紫外光激发可产生强而持久的荧光信号，其增强效力可达100万倍，故又称解离增强铺系荧光免疫分析(dissociation-enhanced-1anthanidefIuoroimmunoassay,DE1FIA)o锢系元素的发光时间延长，如Eu*和Snr的荧光衰变时间分别达到 4.3×IOns和4.1×10,ns,而样品和试剂中的自然本底荧光的衰变时间仅为4-10ns,通过延迟测量时间，使信号不受本底荧光影响。
此外，锢系元素螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，StOkeS位移大，有利于排除非特异性散射光的干扰，进一步提高荧光信号的特异性。
二、试剂组成(一)EuS标记物：可分为标记抗体、标记抗原，要求有较高的纯度、比活性和免疫活性。
密封后4。
C或-20。
C保存，但应避免反复冻融。
若发现蛋白质聚合，非特异性结合升高，则应停止使用。
(二)固相抗体或抗原：固相载体多用聚苯乙烯微孔条，要求透明度高，吸附性能好，材质均匀，孔间差异小，不同品牌甚至不同批号的微孔条间都会有明显的性能差异，应引起注意。