急性脊髓损伤动物模型制备

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脊髓损伤动物模型的制备与评价

脊髓损伤动物模型的制备与评价【摘要】脊髓损伤(SCI)的修复是医学界面临的一大难题，虽然现在还没有理想的治疗方法，但是世界各地的许多学者已对脊髓损伤的病理机制和再生修复进行了深入的研究。

脊髓损伤动物模型的制备和评价方法对脊髓损伤相关研究具有很重要的意义,本文将回顾目前常用的脊髓损伤模型制备和评价的方法。

【关键词】脊髓损伤；动物模型；评价【Abstract】Objective restore the neural function after spinal cord injury is a hard work.Though there are no promising therapies,the scientists all over the world have made great effort in studying the pathological meschasim ofspinal cord injury and spinal cord regenerate.The establishment of animal model and evaluating methods are playing an important role in these researches.This article will review applications about how to make and evluate animal models of spinal cord injury.Key words:spinal cord injury,animal model,evaluation1 脊髓损伤动物模型的制备1.1 脊髓撞击损伤模型Allen［1］建立了重物坠落致脊髓损伤的方法。

即用一定重量的重锤沿一套管垂直落下、精确打击特定脊髓节段而致伤。

这种模型比较接近人类脊髓损伤的病理生理特点及变化规律，对研究脊髓损伤后神经元、神经胶质细胞的病理变化、再生规律和相互作用，探索神经保护策略有很大帮助。

新型小鼠急性脊髓损伤模型的建立与评价

学评分在脊髓损伤程度上有统计学差异（ｐ＜Ｏ．０５）。结论：成功建立稳定性好、重复性强且具有治疗意
义的小鼠脊髓钳夹损伤模型；（钳夹５秒组）具备较好的实验价Ｎ－。
２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＤａｖｉｄＧｅｆｆｅｎＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓ，ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ９００９５— —１７６３；
组，ｎ一９）和钳夹损伤５ｓ组（Ｂ组，ｎ一９），钳夹损伤
１Ｏｓ组（Ｃ组，ｎ一９）。术前每３只一笼饲养，环境温
度２Ｏ ℃ ～２３ ℃ ，湿度５Ｏ～６Ｏ，自由饮食、水。钳
术前先定位Ｔ１０水平，术区碘酒消毒３遍（Ｔ１０为中心，Ｃ７一Ｌ５范围），再酒精消毒３遍。调节气体麻醉机气体流量，使最小气体流量以保持小鼠麻醉状态。调整显微镜视野，自Ｔ２一Ｔ１２尖刀切开背部皮肤，避免损伤皮下脂肪垫，用５＃镊子小心分离皮下筋膜组织，显露肌肉组织，可见浅层椎旁腱膜终止
ＢＭＳ评３４法、Ｒｏｔｏｒｏｄ法和Ｇｒｉｄｗａｌｋ法于损（０）ｄ、损伤后３ｄ、７ｄ、１４ｄ、２８ｄ分别对各实验组进行后肢运动功能评估；同时用ＧＦＡＰ组织学法于７ｄ、１４ｄ、２８ｄ观察各组脊髓组织切片的组

急性脊髓损伤动物模型的建立与评估

ｆｔ制良Ａｌｌｅｎ ’ Ｓ髓损伤模型的参数及稳定性
髓损伤卡Ｉ！）上』［对比，
方法：雌ＳＤ人敝随饥分为５组，Ｈ口假手术组（Ａ组６只），『ｌ；ｔｉｌ：ｔＪ ‘ ｌ器５，１０ｃｍ组（Ｂ１，Ｂ２组），ＮＹＵ
福建省漳州市人，汉族，
（１）行为学评分（ＢＢＢ和
Ｒｅｕｔｅｒ评分１：
模型组２４只（分为自制打击器５，
１０ｃｒｎ组，ＮＹＵ打击器１．２５，２。５ｃｍ
组，每组６只），摘除椎扳，用两种打击器建立不同程度的脊髓损伤模型。
（２）观察神经元半定量计数分橱以及脊髓损伤面积比变化；（３）进行病理学检查。
通过与ＮＹＵ脊髓损伤模型比较，证明了实验自制打击器建立的脊髓损伤模型是一种稳定性较好的脊髓损伤模型，方法简单，重复性强，可为脊髓
损伤机制研究及药物治疗提供稳定的动物模型
福建中医药大学在读硕士、主要从事脊髓损伤方
面的研究
通讯作者：张俐，博士，
教授博士生导师，福建
中医药大学骨伤学院省
病理切片示：
部共建教育部重点实验室，福建省福州市
｝｜矬研宠．２０１６．２０（４９）：７３４１．７３４８
ＤＯＩ：１Ｏ．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９５ — ４３４４．２０１６．４９．００７

脊髓损伤动物模型研究现状

研究ＳＩ基本的条件是建立标准、想的ＳＩ型。Ｃ最理Ｃ模客观化、想化的ＳＩ型应具备四方面的条件：床相似理Ｃ模临
性、调控性、可可操作性与可重复性。目前，验中最常用的实
击，而复制出不同程度、同类型的ＳＩ型。同时，法从不Ｃ模该
保持了硬脊膜完整，有效防止外源性成分侵入ＳＩ可Ｃ区域，并
防止脊髓外露与脑脊液外漏。这种模型较接近人类脊髓损伤的病理生理特点及变化规律，研究脊髓损伤后神经元、经对神
胶质细胞的病理变化、生规律和相互作用、索神经保护策再探略等有较大帮助。 ‘
件和受伤机制，型制作的关键是控制牵拉比率的精确性。模
２神经功能的评价标准及方法

动物脊髓损伤后的神经功能评定主要有神经电生理评
接。２００４年Ｓｅｇ等＿制备了微创的鼠ＳＩ型，过调节ｈｎ６ＪＣ模通
压迫时的压力大小及时间长短而得到不同程度的ＳＩ型，Ｃ模该法能保持硬脊膜的完整并具有很好的可重复性。１４光化学诱导型ＳＩ型静脉注射光增敏剂二碘曙红．Ｃ模（加拉玫红）四碘荧光素二钠（红Ｂ，后分别以氩离孟或藻）然子灯或氙弧灯产生的５４５ｎ激光或５０ｍ绿光照射拟损１．ｍ６ｎ伤的脊髓部位，即与光增敏剂发生反应使局部氧自由基大光量堆积，伤脊髓血管内皮细胞，而引发血栓，致缺血性损进导损伤和水肿，此而制得光化学诱导型脊髓损伤模型［］由。该法能保持硬脊膜的完整性，至不必切开皮肤，为激光足甚因

脊髓损伤模型制作及方法

脊髓损伤模型制作及方法1.化学损伤模型化学损伤模型是通过定位注射或者鞘内给药的方法损伤脊髓组织细胞。

其损伤的病理变化以神经元溃变为主，完整性不受破坏，类似于脊髓灰质炎的病变，适用于神经细胞移植的研究。

例如，通过微纤维植入谷氨酸、天冬氨酸、N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA)或红藻氨酸盐，可建立兴奋性毒性脊髓损伤模型，引起少突胶质细胞和神经细胞死亡及诱发电位传导阻滞。

而于鞘内注射红藻氨酸盐也可引起少突胶质细胞和神经细胞死亡。

在脊髓背侧局部使用红藻氨酸盐或NMDA导致兴奋性中毒，而显微注射到灰质，可以导致脊髓灰质变性。

注射磷脂酶A2到大鼠胸部脊髓腹外侧白质可产生出血，炎细胞浸润，脱髓鞘及灰质、白质的病变和运动神经传导障碍。

2.光化学损伤模型光化学损伤模型，一般采用光增敏剂二碘曙红(孟加拉玫红)或四碘荧光素二钠(藻红B)进行静脉注射，然后分别以氩离子灯或氙弧灯产生的514.5nm激光或560nm绿光照射拟损伤的脊髓部位，光与光增敏剂发生反应，使局部自由基大量堆积，损伤脊髓血管内皮细胞，进而引发血栓，导致缺血性的损伤和水肿。

该法能保持硬脊膜的完整性，甚至不必切开皮肤。

激光足以穿透脊背表面，但应注意防止光的热效能对脊髓的直接灼伤。

3.脊髓震荡型损伤模型脊髓震荡型损伤模型采用闭合性液压装置损伤脊髓，其原理是通过向密闭的腔隙内快速注入定量的生理盐水，造成组织变形和移位，使组织损伤。

该装置在致伤的关键步骤上均定量化、客观化，操作简单、方便，不受人为因素干扰。

液体冲击硬膜后，在密闭的椎管内产生压力传导，接近人体闭合性脊髓损伤。

该模型具有稳定性和重复性好，致伤能量可以客观、定量测定，损伤情况可以分级等优点，目前广泛应用于颅脑损伤的研究。

但是，由于液体流变学特点不仅取决于液体本身，同时还受接触物体的影响，因此很难对该装置进行生物力学分析。

制造动物模型的目的是模拟人类脊髓损伤并将动物模型上的重大发现用于临床。

上述的动物模型都有其优缺点，完全理想化的模型是不存在的，各种损伤模型仅能反映临床上该类型脊髓损伤。

自制脊髓损伤动物模型实验台的结构与使用

ｍｄｌｆｓｉｌｏｄｉｊｒ．ｅｄｎｅｕｔＴｅｅｐｒｎａｄｖｅｉｃｄｎｅｃ。ｏｒｒ，ｎｅｔａｏｅｏｐｎｒ．ｕｙＭ￣ｏｓａｄＲｓｌｈｘｅｍｅｔｌｅｉｎｌｉｇａｂｎｈｆｄｏｅｖｒｃｌａｃｓｉｃｕｎｏｉ
该实验装置，包括１
个实验台，若干个固定在实验台上由垂直滑杆和水平滑杆构成的支撑杆。在其中２个支撑杆上设置挂钩，个支撑杆１
上安装有由中空的垂直冲击通道和冲击杆组成的垂直冲击装置，１另个支撑杆上安装有由水平冲击板、前摆杆、分度
板和水平冲击杆共同构成并依靠冲击开关控制的侧击打装置，在侧击打装置上还附属有一个由升降提钩和砝码盘组
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
ｌｔｇｄｖｃｒｘｄｏｈｏｅｐｃｉｅｙＣｏｃｕｉｎＴｅｄｖｃａｋｉｇｅｓｅｉｉｒｎｆｏｔｏｅｓｉａｉｉｅｉｅｗｅｅｆｅｎｔｅｒｄｒｓｅｔｌ．ｎｌｓｏｈｅｉｅｃｎｍａｅｓｎｌｉｎｕｙｉｒｎｆｈｐｎｌｆｎｉｖｔｔ
其中，而保证了工作台平面的相对清洁。从１垂直冲击装置：．２垂直冲击装置固定在实验台后侧支撑杆上，包括一根中空的垂直冲击通道和一个冲击杆。垂直冲击通道通过冲击通道导向座竖直固定在支撑杆水平滑杆的前端，
一
个直径略小于垂直冲击通道内径的冲击杆可以放置于垂直
ｃｒｖｎｒ）ｐｓｅｏｄｒａ）ａｄａｖｒｔｆｉｅｅｔｎｌｓｏｏｈｓｅｆｔｅａｉｌｐｎｌＯ．ａｌａｋｏｄ（ｅｔａ，ｏｔｒｒ（ｏｓ１ｎａｉｙｏ＇ｆｒｎｇｅｎｂｔｉｓｏｎｍａｓｉａｒｓｗｅｌｓｍａｅ１ｉ，ｅｄｉａｄｈＣｄ

脊髓损伤动物模型的制备及神经功能评价

略等有较大帮助。
Байду номын сангаас
液化，此模型一致性较差。Ｂｎｅ等利用孟加拉玫瑰红但ｕｇ激光束直接照射脊髓，造成脊髓缺血损伤，镜和电镜观察光
综述・
型脊髓损伤动物模的制备及神经功能评价
徐帆陈建敏张，，
（．都医学院０级药学本科班，川成都１成３四
晓
６０８）１０１
６０８；２成都医学院实验技术教研室，川成都１０１．四
ｌｈｎｆｎｍｏｅｆｐｎｏｄｉｕｎｈｅｈｄｆｖｕｔｏｆｅｖｕｕｃｉｆｒｓｉｏｄｉｍｅｔｉａｍｄｌｏｓｉａｃｒｊｒａｄｔｅｍｔｏｓｏａａｉｎｏｒｏｓｆｎｔｎａｅｐｎｃｒｓｏａｌｓｌｎｙｅｌｉｎｏｔｌａｉｕｏｔｏｎｂｏｄｎｒｂｔａｍｅａｄａｒａ．ｊｙｈｈ
ＸＵａＣＮｉｎｍｔＺＨＮＧＸｉｏＦｎ，ＨＥＪａ — ｎ，Ａａ
（ｈｎｄｄｃｏｅｅＣｅｇｕ６０８，ｈｎ）ＣｅｇｕＭｅｉＣＨｇ，ｈｎｄ０Ｃｉａｌａ１１Ａｓｒｃ：ＳｉａｃｒｎｒＩＣ）ｉｏｅｏｅｍｓｄｆｃｌｐｏｌｍｓｗｌａｅｈｔｏｉｓｉｍｄｃｂｔａｔｐｎｏｄｉｕＩｓｎｆｈｏｔｉｉｔｒｂｅｓｅｓｔｏｔｃｅｉｌｊｙＳｔｆｕａｌｈｐｎｌａｒｓａｃｅｔｈｒｓｎ．Ｔｅｅｔｂｉｍｎｏｉａｍｄｌｏｉｏｊｒｆｒａｉｐｒｎｅｔｆｄ— ｅｅｒｈｓａｔｅｐｅｅｔｈｓｌｈｅｔｆｎｍｏｅｓｆｐｎｃｒｉｕｉｏｅｔｍｏｔｃｎａａｓａｌｓａｌｄｎｙｓｇａｏｕ

急性脊髓外伤动物模型具体方法及步骤

急性脊髓外伤动物模型具体方法及步骤原型物种人来源手术模式动物品系SPF级ICR小鼠，健康，雄性，8~12W实验分组实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组。

实验周期4-6 weeks建模方法取ICR 小鼠，戊巴比妥钠麻醉后，采用椎板切除术暴露T9-T10 处脊髓。

然后采用脊髓打击器，于暴露脊髓处施加90 kilodynes 的力造成挫伤型脊髓损伤，SCI 后连续10 天每天肌肉注射庆大霉素（8mg/kg）防止术后感染，并每天两次人工膀胱按压挤尿直至恢复自主膀胱活动为止（防止尿潴留）。

处理一周后进行BBB 评分评估小鼠后肢运动能力；BBB score=0 时，则模型构建成功。

将构模成功的小鼠分为两组，每组8只，于挫伤型SCI 处理1week 后，于大鼠尾静脉处进行注射处理（模型组只注射生理盐水，治疗组注射含有受试药物的生理盐水）。

SCI 后，16 只小鼠饲养3week 时，根据SCI后3 week 结果每组取3 只效果最显著的小鼠取脊髓进行病理学检测，剩余10 只小鼠继续饲养并与5week，7week，9week进行BBB 评分和机械触诱发痛检测。

SCI后9week 时所有受损脊髓中心进行冻存或OCT 包埋。

应用疾病模型1. BBB test 于药物注射后每隔一周进行BBB test，直至移植后8 周（即SCI 后3week、5week、7week、9week）。

药物注射后2 周（即SCI 后3week）共16 只小鼠进行行为学检测数据，选择变化显著的3 只小鼠（每组3 只，即6 只小鼠）的脊髓组织进行病理学检测。

剩余5 只小鼠（每组5 只，即10 只小鼠）依旧隔一周（即SCI 后5week、7week、9week）进行BBB test。

分值范围为0-21分，其中0分代表后肢完全失去运动功能，21分代表后肢运动功能基本正常。

2. Mechanical allodynia test （机械触诱发痛检测）使用Von Frey 测痛套件，记录缩足的压力（g），2 分钟时间间隔内测量4 次，剔除最大值和最小值后获取的中间值作为痛阈（g）。

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急性脊髓损伤动物模型制备
材料与方法
1.实验仪器及试剂
1.1实验仪器及耗材：
BL－420E+生物机能实验系统成都泰盟科技有限公司
生物信号导联电极（三向）成都泰盟科技有限公司
CZF/BZF SZC/SZB型非接触式电涡流传感器杭州华瑞仪器有限公司
信号采集针<银针>
ATZ-4,8型弹簧度盘秤永康市华鹰仪器有限公司
数字式脊髓损伤动物模型制备仪成都医学院基础医学实验技术中心
一次性注射器（1ml, 5ml, 10ml）上海双鸽实业有限公司
一次性使用无菌注射器（2ml）浙江欧健医用器材有限公司
金属骨针（克式针）上海浦东金环医疗用品有限公司
Argox Amigo 系列条形码打印机立象科技股份有限公司
常规手术器械上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂
缝合用针线上海医用缝合线厂、江苏省淮阴医疗器械厂
温度计江苏省无锡县标准计量管理所
棉签成都市华辉医疗器械有限公司
大鼠营养饲料华西医科大学动物供应中心
1.2 试剂
酒精 75%：自行配制
生理盐水：四川科伦药业股份有限公司产品批号：C070311 G1
碘伏：四川华天科技实业有限公司产品批号：20070202
阿司匹林肠溶片：南京白敬宇制药有限公司产品批号：061006
注射用青霉素钠80万单位：哈药集团制药总厂产品批号：A06086310 葡萄糖氯化钠：成都军区总医院产品批号：07020708
1.5%戊巴比妥钠：自行配制
1.3 主要试剂的配制
1.3.1 75% 酒精：
1.3.2 阿司匹林溶液：选取14片阿司匹林片剂，碾磨
1.3.3 青霉素溶液 8U/ml：用针筒量取10ml生理盐水，溶解80万单位1.3.4 1.5%戊巴比妥钠溶液的配制：
2. 实验方法
2.1 实验大鼠的选取及麻醉标准
该动物模型制备实验对大鼠有严格的限定，选取Spargue-Drawly 大鼠，年龄为77±1d，体重为260 ± g。

麻醉标准为雄性65mg/kg, 雌性40mg/kg。

2.2 实验大鼠手术
2.2.1 大鼠抓取、麻醉及固定：抓取手术大鼠，腹腔注射麻药。

大约三分钟左右，大鼠出现站立不稳，醉酒样步态。

四肢固定与手术台上，松紧适中，手术过程中注意观察四肢是否出现瘀血，注意按摩。

此时，可用大头针刺激大鼠尾巴，如果大鼠的反应不强烈，预示着可以开始手术。

2.2.2 大鼠打击区域的选定及手术：首先剪除大鼠胸椎区域毛，而后均匀喷洒碘伏溶液两倍备皮区域。

在大鼠背部脊柱有一个明显的凸起，经过大量的解剖实验证明该凸起为T11，从该凸起区域剖开皮肤2－3cm，逐步暴露筋膜、肌肉直到椎骨。

由该凸起出发向前数两个节段即T9，用手术刀小心刮去T9椎骨上的肌肉。

随后进行椎板切除术，移植暴露到硬脊膜。

2.2.3 打击装置的安装固定、调整及记录电极的挟持：该打击装置利用物体自由落体运动，打击金属杆从6.25mm,12.5mm,25mm,50mm四个不同的高度，以初速度为0，自由下落打击暴露的脊髓，压迫脊髓。

根据具体打击高度安装非接触式位移传感器，位于打击杆的圆盘上，距离小于30mm，并限定金属杆恰恰接触（未压缩）时为零高度。

电位变化记录夹，红色夹子挟持于T11棘突，黑色夹子挟持于T9同一水平面的肌肉和皮肤，在T13与T12椎骨之间的缝隙处，插入银针約1cm，白色夹子挟持银针顶端。

非接触式位移传感器信号输出线导入BZF-Ⅲ型电涡流式前置变换器并由此导入BL-420E+第二号通道。

电位变化记录夹采集信号导入BL－420E+第一号通道。

在BL-420实验系统软件选择实验通道输入信号，一号通道选择神经放电，二号通道选择
2.2.4 脊髓打击、金属杆和脊髓电位变化记录：从注射麻药60±1min后，释放选定高度的金属杆对脊髓进行打击。

电涡流传感器将会在空间上20微米，时间上20微秒采集金属杆在空间上物理位移所有点，并且输出一系列的电压信号，经过信号转换器输入电脑，程序将会自动生成一条能反应整个金属杆的速度－位移曲线。

电位记录将会从三个不同的地点采集脊髓受到打击时所释放的不规则的电位变化。

2.2.5 大鼠术后处理：打击完毕后，立即用消毒的手术缝合针线分别对肌肉、筋膜和皮肤进行缝合，每缝合完一层时用酒精对其消毒，缝合完皮肤
后在缝合区域均匀的喷洒碘伏。

由于大鼠在手术过程中会有一定量的血液丧失，术后会出现寒颤现象，因此需要对大鼠注射1ml（8U/ml）青霉素、5ml葡萄糖氯化钠溶液、1ml阿司匹林溶液，且在大鼠尾部固定条形码。

而后将大鼠平放于干燥的鼠笼重叠于装有45-50℃的温水中，保温7小时。

3.大鼠日常护理：大鼠急性脊髓损伤后，T9以下的神经对各个脏器及肌肉组织失去了制备，一般以瘫痪（后肢运动功能障碍）、尿潴留、大便异常和自噬症为主。

因此需要对大鼠进行细心护理，每天洗澡一次，注意对伤口的处理。

每天早晚两次对大鼠膀胱、后肢按摩，帮助排尿，记录尿量和PH 值；还需要用药，每天注射1ml（8U/ml）青霉素，前七天，1ml阿司匹林溶液，每天早晚两次5ml葡萄糖氯化钠溶液。

饲料和饮用水正常供应。