植物基因启动子的克隆方法及其应用
植物基因敲除技术步骤
植物基因敲除技术步骤植物基因敲除技术是一种重要的分子生物学工具，可以用来研究植物基因的功能、调控和相互作用。
随着生物技术的不断发展，植物基因敲除技术也得到了广泛的应用。
本文将详细介绍植物基因敲除技术的步骤，从克隆目标基因到诱导敲除突变，以及后续的分子分析和筛选鉴定。
希望通过本文的介绍，读者能够了解植物基因敲除技术的基本原理和操作流程。
一、获得目标基因序列在进行植物基因敲除之前，首先需要获取目标基因的序列信息。
这可以通过数据库查询、基因克隆或PCR扩增获得。
在获取基因序列的过程中，需要注意选择与植物物种相对应的启动子和终止子，确保敲除后的基因调控与表达情况与野生型相似。
二、选择合适的敲除载体获得目标基因序列后，需要选择合适的敲除载体。
敲除载体通常包括T-DNA插入的质粒，其中包含了目标基因的敲除片段、选择标记基因和辅助元件等。
通过选择适当的选择标记基因，可以实现对敲除突变体的诱导和筛选。
三、构建敲除质粒构建敲除质粒是植物基因敲除技术的关键步骤。
将目标基因的敲除片段与T-DNA插入质粒进行连接，然后将所构建的质粒导入大肠杆菌等细菌中进行扩增。
接着进行PCR鉴定和限制性内切酶酶切鉴定等实验，以确认质粒的构建是否成功。
四、植物转化将构建好的敲除质粒导入植物体细胞中进行转化。
目前，常用的转化方法包括农杆菌介导的转化和基因枪介导的转化。
通过这些方法，可以将质粒导入植物体细胞中，从而实现对目标基因的敲除。
五、筛选敲除突变体经过植物转化后，需要对转化植株进行选择和筛选，以获取目标基因的敲除突变体。
这通常通过对转化植株进行抗性筛选或对表型进行鉴定识别等方法。
通过严格的筛选，最终可以获得目标基因的敲除突变体。
六、分子鉴定对获得的敲除突变体进行分子鉴定，确认目标基因的敲除情况。
通过PCR鉴定、Southernblotting等方法，可以验证目标基因是否被成功敲除。
七、功能分析对获得的敲除突变体进行功能分析。
可以通过表型分析、生理生化指标测试等方法，研究敲除基因对植物生长发育、抗逆性等方面的影响，从而揭示基因在生物体中的功能和作用途径。
基因工程育种的原理及应用
基因工程育种的原理及应用1. 基因工程育种的原理基因工程育种是通过改变生物体的遗传信息来改良和改变其性状的一种育种方法。
其原理主要涉及以下几个方面：1.基因克隆：基因工程育种的核心技术之一是基因克隆。
基因克隆是指将目标基因从一个生物体中提取并复制到另一个生物体中。
这样做可以将某种有益基因导入到目标生物体中，使其表达具有该基因所编码的特定蛋白质或其他功能分子。
2.基因编辑：基因编辑是指通过针对目标基因进行精确的DNA序列修改来改变生物体的性状。
常用的基因编辑技术有CRISPR-Cas9和TALEN等。
这些技术可以在生物体的基因组中精确地切割和修改DNA序列，以实现对目标基因的特定改造。
3.遗传转化：遗传转化是将外源基因导入到目标生物体中，并使其在细胞内正常表达的过程。
常用的遗传转化技术包括农杆菌介导的基因转化和生物颗粒枪介导的基因转化等。
这些技术使得研究人员可以将具有特定功能的基因引入到目标生物体，从而改变其性状。
4.基因表达调控：基因表达调控是指通过对目标基因的转录和转译过程进行调控，以改变生物体的性状。
常用的基因表达调控技术包括启动子工程、转录因子介导的调控和RNA干扰等。
这些技术能够使研究人员能够精确地调控目标基因的表达水平，从而改变生物体的性状。
2. 基因工程育种的应用基因工程育种已经在许多领域得到了广泛的应用，其应用主要包括以下几个方面：1.农作物育种：基因工程育种已经成功地应用于农作物的改良。
通过导入与抗虫、抗病、耐逆等性状相关的基因，可以使农作物具有更好的抗病虫害能力和逆境适应性。
例如，将Bt基因导入到作物中，可使其对昆虫害虫具有抗性，从而降低对农药的依赖。
2.畜禽养殖：基因工程育种也广泛应用于畜禽养殖中。
通过引入与生长速度、肌肉质量、抗病能力等性状相关的基因，可以提高畜禽的生产性能和抗病能力。
例如，通过导入生长激素基因，可使畜禽生长速度加快，从而提高养殖效益。
3.医药研发：基因工程育种在医药研发领域也有重要应用。
拟南芥防御素基因PDF1.2启动子与GUS重组载体的构建与转化
拟南芥防御素基因PDF1.2启动子与GUS重组载体的构建与转化刘志霞;周舟;蔡薇;程姣;任春梅【摘要】PDF1.2基因在植物的防御系统中扮演着重要的角色,其编码产生的植物防御素参与了植物对真菌入侵、病毒感染、不良环境等逆境胁迫的防御反应.试验利用从拟南芥中通过PCR扩增和克隆的该基因启动子构建GUS报告基因的表达载体,通过根癌农杆菌浸渍转化法将表达报告基因转入拟南芥中,筛选获得了转化植株.获得以下主要结果:(1)成功克隆了拟南芥PDF1.2基因的启动子并将其与带GUS 标记基因的载体进行了融合,得到了重组的融合载体;(2)成功的将带GUS标记基因的拟南芥PDF1.2基因启动子融合载体转入到拟南芥植株中并利用其自带抗性标记筛选到了抗性植株;(3)利用GUS染色技术检测了转基因植株中PDF1.2基因启动子的表达情况.%PDF1.2 gene plays an important role in plant defense systems,the plant defensins encoded by PDF1.2 gene participates in plant defensive response against to adversity stress such as fungal invasion,viral infection and adverse environment conditions.The promoter of PDF1.2 gene that amplified and cloned by PCR from Arabidopsis was used to construct the expression vector of GUS reporter gene in this experiment,then the expression reporter gene was transformed into Arabidopsis through agrobacterium tumefaciens transformation method and the transformed plants was obtained by screening.The main results were showed as follows:1.The promoter of Arabidopsis PDF1.2 gene was successfully cloned and fused with the vector carrying GUS report gene to obtain a recombinant fusion vector;2.The reconstructive vector wastransferred into Arabidopsis thaliana and the transgenic plants were screened successfully;3.The expression of the promoter of PDF1.2 gene in transgenic plants was detected by GUS staining.【期刊名称】《作物研究》【年(卷),期】2018(032)002【总页数】4页(P131-134)【关键词】载体构建;PDF1.2基因;克隆;转化【作者】刘志霞;周舟;蔡薇;程姣;任春梅【作者单位】湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;作物基因工程湖南省重点实验室,长沙410128【正文语种】中文【中图分类】Q785PDF1.2基因是一个广泛存在于植物中与抗逆相关的基因［1～4］。
CaMV35S启动子及其在转基因作物中的应用和检测
植物基因功能研究的主要方法_3215
植物基因功能研究的主要方法随着植物基因组计划的实施和完成，大量的基因组数据库和EST数据库得以建立和完成，因此产生的问题是成千上万新基因的功能有待分子生物学家鉴定。
研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学和反向遗传学策略。
正向遗传学是传统的方法，策略是通过筛选天然或人工产生的突变体进而克隆相关目标基因，即从功能（表型）－突变体－基因，最后得到具有相关功能（如对干旱敏感或耐旱）的基因，常用手段是图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）。
反向遗传学的策略是从已知的基因序列入手鉴定其功能，研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除、基因激活等。
采用反向遗传学鉴定基因功能是基因组计划由结构基因组学过渡到功能基因组学的必然要求。
目前，植物抗逆性功能基因的研究策略主要集中在利用差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析、cDNA微阵列（或基因芯片）等技术筛选与逆境胁迫相关的表达序列标签（EST）或转录因子，然后利用反向遗传学等技术对转录因子的功能进行研究。
正向遗传学手段主要集中在抗逆性状的遗传分析和QTL定位方面，然而目前尚无抗逆性状QTL基因克隆的报道；通过突变体抗逆筛选的途径主要是在模式植物拟南芥中，特别是克隆了一大批与ABA合成或ABA 敏感性有关的基因，例如ABA不敏感的abi8突变体(Brocard-Gifford et al., 2004)。
近年来许多国家（特别是我国）的水稻突变体数量剧增，为通过抗逆筛选克隆基因奠定了基础。
综合利用这些研究手段可以全面地了解植物对胁迫响应的复杂机制和相互作用以及相应的信号传导途径，从而为更加高效地利用基因工程技术来提高植物的抗逆性奠定基础。
下面就几种常见的研究抗逆基因功能的策略作简要介绍。
1. 超量表达（Over-expression）超量表达是指将目的基因全长序列与高活性的组成型或组织特异型启动子融合，通过转化获得该基因产物大量积累的植株，从而扩大该基因在生理生化过程中的效应，这部分扩大的效应带来的与正常植株在各种表型上的差异有助于帮助理解基因功能。
研究植物基因功能的策略和方法_3110
研究植物基因功能的策略和方法研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学（forward genetics）和反向遗传学（reverse genetics）策略。
正向遗传学即通过生物个体或细胞基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关表型或性状改变，然后通过图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能，例如遗传病基因的克隆。
反向遗传学的原理正好相反，人们首先是改变某个特定的基因或蛋白质，然后再去寻找与之有关的表型变化，例如基因剔除技术或转基因研究。
简单地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，而反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。
研究植物体内基因功能的方法主要有以下几种：（1）基因功能丧失或减少，即筛选目的基因功能部分丧失或全部丧失的突变体，比较其与野生型的表型差异来确定该基因功能；（2）基因功能增加或获得，即筛选目的基因高水平表达的植株，比较其与相应对照植株（野生型植株，功能丧失突变体或模式植物植株）差异，观察其表型性状变化来鉴定基因功能；（3）基因异位表达（Ectopic expression），通过定向调控靶基因的时空表达模式来研究基因功能；（4）微阵列（Microarray）是一种在全基因组水平对基因表达进行高通量检测的技术；（5）酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid system）用于分析基因产物即蛋白质之间的互作。
1 基因功能丧失或减少以前，通常通过筛选自然突变体来获得基因功能部分或全部丧失的突变体，但概率较低；现在一般通过各种人工方法来获得合适突变体。
人工产生基因功能丧失的方法有插入突变、反义抑制（antisense suppression）、共抑制（cosuppression）、双链RNA干扰（double-stranded RNA interference, dsRNAi）。
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分子植物育种，２００６年，第４卷，第３（Ｓ）期，第８５－９１页ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００６，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．３（Ｓ），８５－９１专题报告Ｒｅｖｉｅｗ植物基因启动子的克隆方法及其应用尹辉李丹张毅李秋莉﹡辽宁师范大学生命科学学院，大连，１１６０２９﹡通讯作者，ｌｉｑｉｕｌｉ＠ｄｌ．ｃｎ摘要植物基因的表达调控已成为分子生物学研究热点，启动子是基因表达调控的重要顺式元件，启动子的克隆对于研究基因表达调控、构建基因工程载体、表达目的蛋白有着重要的意义。
启动子克隆的方法很多，从常用的启动子陷阱技术筛选启动子到ＰＣＲ方法的应用，此后相继问世的一些基于ＰＣＲ的克隆启动子技术，如载体锚定ＰＣＲ、反向ＰＣＲ、接头ＰＣＲ、交错热不对称ＰＣＲ等，为克隆启动子提供了更可靠，更合理的方法。
本文着重介绍了几种植物基因启动子的克隆方法，分析了它们的优缺点，并展望了今后的研究前景。
关键词启动子，启动子陷阱技术，反向ＰＣＲ，锚定ＰＣＲ，交错热不对称ＰＣＲＣｌｏｎｉｎｇＭｅｔｈｏｄｓｏｆＰｌａｎｔＧｅｎｅＰｒｏｍｏｔｅｒｓａｎｄＴｈｅｉｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓＹｉｎＨｕｉＬｉＤａｎＺｈａｎｇＹｉＬｉＱｉｕｌｉ＊ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＬｉａｏｎｉｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｌｉａｎ，１１６０２９﹡Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ｌｉｑｉｕｌｉ＠ｄｌ．ｃｎＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｇｅｎｅｈａｓｂｅｅｎｔｈｅｈｏｔｓｐｏｔｓｔｕｄｙｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ．Ｐｒｏｍｏｔｅｒｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｌｏｎｉｎｇｐｒｏｍｏｔｅｒｉｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｓｔｕｄｙｇｅｎｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｖｅｃｔｏｒｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｆｒｏｍｔｈｅｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙｕｓｅｄｗａｙｔｈａｔａｐｐｌｙｉｎｇｐｒｏｍｏｔｅｒｔｒａｐｐｉｎｇｆｏｒｃｈｏｏｓｉｎｇｐｒｏｍｏｔ－ｅｒｔｏｔｈｅｕｓｉｎｇｏｆＰＣＲ，ｔｈｅｒｅｗｅｒｅｌｏｔｓｏｆｗａｙｓｆｏｒｐｒｏｍｏｔｅｒｃｌｏｎｉｎｇ．Ａｆｔｅｒｗａｒｄｓ，ａｓｅｒｉｅｓｏｆｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｂａｓｅｄｏｎＰＣＲｆｏｒｐｒｏｍｏｔｅｒｃｌｏｎｉｎｇｓｕｃｈａｓＡ－ＰＣＲ，Ｉ－ＰＣＲ，ＬＡ－ＰＣＲ，ＴＡＩＬ－ＰＣＲｗｅｒｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄｉｎｓｕｃｃｅｓｓｉｏｎ．Ｔｈｅｙｏｆ－ｆｅｒｅｄｍｏｒｅｒｅｌｉａｂｌｅａｎｄｒｅａｓｏｎａｂｌｅｗａｙｓｏｆｃｌｏｎｉｎｇｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｓｏｍｅｗａｙｓｏｆｃｌｏｎｉｎｇｐｌａｎｔｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓｗｅｒｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ，ｍｅａｎｗｈｉｌｅｔｈｅｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｅｗａｙｓｗａｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄａｎｄｔｈｅｉｒｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｐｒｏｓｐｅｃｔｗａｓａｌｓｏｄｉｓ－ｃｕｓｓｅｄｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ．ＫｅｙｗｏｒｄｓＰｒｏｍｏｔｅｒ，Ｐｒｏｍｏｔｅｒｔｒａｐｐｉｎｇ，Ｉ－ＰＣＲ，ＡｎｃｈｏｒｅｄＰＣＲ，ＴＡＩＬ－ＰＣＲ启动子是ＲＮＡ聚合酶能够识别并与之结合、从而起始基因转录的一段ＤＮＡ序列，是基因表达调控的重要元件。
启动子对外源基因的表达水平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件。
植物基因启动子的克隆，对研究植物基因表达调控和构建表达载体至关重要。
本文就近几年来克隆植物基因启动子的各种方法做一综述，以期促进对启动子分离技术的应用。
１植物基因启动子克隆的几种方法１．１利用常规ＰＣＲ技术克隆启动子对于序列已知的启动子，只需要根据已知的启动子序列设计引物，然后采用ＰＣＲ扩增的方法就可以获得该启动子。
该方法比较简便快捷，是近年来使用较为广泛的一种方法。
王利军等（２００４）根据ＧｅｎＢａｎｋ中拟南芥基因组序列中ａｔｓ１Ａ（核酮糖－１，５－二磷酸羧化酶小亚基）基因启动子的序列设计引物，以拟南芥总ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增出ａｔｓ１Ａ的基因启动子区片段，将其克隆到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，得到重组质粒并且进行测序，序列分析表明，所克隆的片段为１１１７ｂｐ，与Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ中的ａｔｓ１Ａ基因启动子序列比较，发现只在－７７６位缺失１个碱基。
该方法简便、快捷、操作简单，但不能克隆到全新的启动子。
分子植物育种ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ１．２通过构建及筛选基因组文库来克隆启动子该方法首先要提取基因组ＤＮＡ，用限制性内切酶消化，产生出适合于克隆的ＤＮＡ片段，然后在体外将这些ＤＮＡ片段同适当的λ噬菌体载体连接成重组体分子，并转化到大肠杆菌的受体细胞中，构建基因组文库。
将构建好的基因组文库铺板，转移到尼龙膜上，用部分已知序列的片段或特异的基因片段做探针进行杂交，筛选出具有目的启动子的克隆，测序分析即可获得该启动子。
Ｒｉｎｅｈａｒｔ等（１９９６）利用此方法，通过筛选海岛棉基因组文库，克隆了纤维发育中后期特异表达基因ＦｂＬ２Ａ的上游序列，它具有启动子的基本特征，包含了启动子所必须的ＴＡＴＡ框等结构。
Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ和Ｔｒｉｐｌｅｔｔ（１９９９）也用此方法获得了纤维发育次生壁增厚时期特异表达的长为２．６Ｋｂ的ＧｈＣｅｓＡ４启动子，通过与报告基因ＧＵＳ融合，转化棉花，结果发现在次生壁合成阶段，ＧＵＳ的表达显著增强，与纤维素的合成成正比关系。
此方法需要构建基因组文库，工作量大，但如果已知部分启动子序列，可以使用该方法。
１．３利用载体或染色体步行技术克隆基因启动子１．３．１启动子陷阱技术利用启动子陷阱技术筛选启动子是一种常用的方法。
它是利用启动子缺失的报告基因构建启动子探针质粒，通过报告基因的表达来克隆有启动功能的ＤＮＡ片段。
在该技术中关键是要构建一种启动子探针载体。
这种载体系统应该满足这样的要求：（１）报告基因经启动子启动后，基因产物应便于鉴定，方便筛选；（２）报告基因经启动子启动后，基因产物应易于量化，最好是某种酶；（３）除了带有通常的抗生素抗性基因以外，载体上还应有第二个选择标记；（４）紧靠着报告基因的上游应有数个克隆位点；（５）质粒稳定存在，拷贝数已知。
利用启动子陷阱技术筛选启动子的过程为：先选用一种适当的核酸内切限制酶消化切割染色体ＤＮＡ；接着将切割产生的ＤＮＡ限制片段群体与无启动子的质粒载体重组，并按照设计的要求使克隆的片段恰好插在紧邻报告基因的上游位置；然后再把重组混合物转化寄主细胞，构成质粒载体基因文库，检测报告基因的表达活性，报告基因若具有活性，则其上游的ＤＮＡ片段即具有启动子活性。
张晓宁（２００２）用启动子探针载体ｐＥＣＥ７克隆了盐藻耐盐基因的启动子。
ｐＥＣＥ７具有完整的新霉素抗性基因转录单元和氯霉素抗性（氯霉素乙酰转移酶）基因，可在大肠杆菌中正常复制，但缺少表达氯霉素乙酰转移酶基因所需的启动子序列。
该基因含有自身的核糖体结合位点，其５’端有一个ＥｃｏＲⅠ克隆位点，供外源ＤＮＡ片段插入。
如果插入的外源ＤＮＡ片段具有启动子活性，该基因即可表达，含有此质粒的细菌就可以在含有氯霉素的抗性平板上正常生长。
他们用ＥｃｏＲⅠ酶切盐藻基因组的ＤＮＡ，再与用ＥｃｏＲⅠ酶切后的ｐＥＣＥ７相链，转化大肠杆菌，从新霉素和氯霉素抗性平板上筛选重组子，得到一个双抗重组子。
为了保证转化的抗性表现确实来自于盐藻启动子的作用，提取重组子的质粒，重新转化大肠杆菌，用氯霉素筛选，同样得到转化子。
经酶切和电泳分析，证明重组质粒与原来的ｐＥＣＥ７大小和结构均一致，从而证明大肠杆菌的氯霉素抗性确实来自外源质粒的氯霉素抗性基因的活性表达，也证明插入的片段在盐藻中具有启动基因表达的功能。
此方法的优点是不需要知道具体基因的序列，可随机筛选启动子，避免了设计引物，并可获得大量的未知序列启动子片段。
１．３．２锚定ＰＣＲ技术锚定ＰＣＲ（ａｎｃｈｏｒｅｄＰＣＲ）是由Ｈｕａｎｇ等（１９９３）提出的扩增已知序列侧翼未知片段的方法。
反应中需要２个根据已知序列设计的引物，２个根据载体序列设计的引物，然后分别利用一条已知序列特异性引物和载体上非特异性引物进行ＰＣＲ扩增。
其操作一般包括３轮ＰＣＲ扩增，第１轮采用不对称ＰＣＲ的方法，在扩增时使用两种引物浓度不同，一般高浓度引物与低浓度引物比为（５０￣１００）：１，在最初１０￣１５个循环的产物主要是双链ＤＮＡ，待低浓度引物耗尽后，继续由高浓度引物介导产生大量单链ＤＮＡ。
第２轮中，把第１轮ＰＣＲ产物稀释后做模板，引物为相同浓度的特异性引物和非特异性引物，这一轮可得到双链ＤＮＡ。
第３轮ＰＣＲ目的主要是检测所得ＰＣＲ产物是否为预期产物（流程如图１）。
王树启（２００３）用锚定ＰＣＲ克隆了胡萝卜ＡＦＰ（抗冻蛋白）基因上游序列。
首先用３种限制性内切酶构建了３个胡萝卜基因组质粒文库，作为ＰＣＲ反应的模板。
在一次ＰＣＲ中无特异带出现，在二次ＰＣＲ中以ＨｉｎｄⅢ构建的质粒文库出现了特异带，将二次ＰＣＲ的不同方向的两条特异引物克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ载体中，分别命名为ｐＢＴ７ｐ和ｐＢＴ３Ｐ，对这２个重组８６质粒进行测序分析，结果表明这两个克隆的核心序列完全一致，同ＧｅｎＢａｎｋ中的胡萝卜基因序列比较，证实这个克隆的确是ＡＦＰ基因上游的序列。
此方法需要知道启动子相邻序列，且要构建基因组文库。
１．３．３反向ＰＣＲ技术反向ＰＣＲ（Ｉｎｖｅｒｓｅ－ＰＣＲ，简称Ｉ－ＰＣＲ）是由Ｔｒｉｇｌｉａ等（１９８８）在常规ＰＣＲ基础上提出的扩增位于靶ＤＮＡ区段之外的两侧未知序列的方法。
其基本操作程序如图２：（１）提取ＤＮＡ，用适宜的限制性内切酶进行切割（黑框部分表示已知序列）；（２）用连接酶将酶切片段进行自身连接，形成一环状结构，从而使引物处于一个相对的位置；（３）先用嵌套引物的内引物ｂ和ｃ进行首轮ＰＣＲ，然后以其ＰＣＲ产物为模板利用外引物ａ和ｄ进行第２轮ＰＣＲ，增加ＰＣＲ产物的特异性和成功率；（４）第２轮ＰＣＲ产物纯化后可直接进行序列分析或克隆后再进行序列分析。
Ｆｏｒｅｓｔｅｒ等（１９９４）用该方法克隆了豌豆种子脂肪加氧酶基因启动子约８００ｂｐ片段。
韩志勇等（２００１）以Ｉ－ＰＣＲ技术为基础克隆了转基因水稻的外源基因旁侧序列。
首先用限制性内切酶切割转基因水稻的总ＤＮＡ，酶切片段进行自身连接，然后根据质粒的Ｔ－ＤＮＡ区设计２对反向引物，进行套式ＰＣＲ扩增旁侧序列。
在一周内克隆了３５个转基因水稻株系中外源基因的旁侧序列，长度在３００￣７５０ｂｐ之间。
Ｉ－ＰＣＲ法快速、高效、稳定，操作相对简单，花费少，ＰＣＲ引物设计比较方便。
植物基因启动子的克隆方法及其应用ＣｌｏｎｉｎｇＭｅｔｈｏｄｓｏｆＰｌａｎｔＧｅｎｅＰｒｏｍｏｔｅｒｓａｎｄＴｈｅｉｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ图１锚定ＰＣＲ的流程图Ｆｉｇｕｒｅ１ＳｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆａｎｃｈｏｒｅｄＰＣＲｍｅｔｈｏｄ图２Ｉ－ＰＣＲ的流程图Ｆｉｇｕｒｅ２ＳｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆＩ－ＰＣＲｍｅｔｈｏｄ１．３．４接头ＰＣＲ技术接头ＰＣＲ是继Ｉ－ＰＣＲ方法之后的又一用来扩增基因组中已知序列两侧未知序列的方法。