IGY鸡卵黄免疫球蛋白
畜禽免疫球蛋白的功能及应用
畜禽免疫球蛋 白的功能及应用
高进东 华中农业大学动物医学院 、北京博爱动物医院 丁明星 华中农 业大 学动物医学院 ４０７ ３０ ０
个全同单体构成 的五聚体 。 因为Ｉ 熟 Ｂ细胞 上这两 类免疫球蛋 白结合抗原 ｇ Ｍ 免疫球蛋白具有抗体的特性 这是 是 由５
定的方式排列 ，起抗原受体的作用。
人， ， 猪 鸡和一些 实验 动物 已证 实有分泌
又是其进行 自我调节的重要因素。
ｇ Ｄ存在 。 （ ）Ｉ 三 ｇ Ａ单体具有 Ｉ 的相似 结构 。 性 Ｉ ｇ Ｇ
含丰富的碳水化合物
、
Ｉ 有形成多聚体 ｇ Ａ
各类免疫球蛋白的
的倾 向 如二聚体 、 三聚体和 较高的多聚
似 物 。它们的主要特 性如表 １ 所示 。
和病 毒。
学检测技术 的迅 速发展 ，对于鸡 免疫球
（ 一）Ｉ 是血液中含量最高的免疫 ｇ Ｇ
（ 四）Ｉ 在重链的铰链 区附近 比 ＩＧ 蛋 白的特点 、发生和应 用有了更深 的认 ｇ Ｅ ｇ
鸡 ｇ Ｇ具有取材 球 蛋 白 它在抗体介导 的防卫机理 中占 多了一个功能区 。因此分子 量较大 家 识 。与哺乳 动物相 比， 的 Ｉ 主要的地位 。因为Ｉ ｇ Ｇ相对较小 ，比其 它 畜血 清Ｉ 的浓度很低 ， ｇ Ｅ 但是 它介导 Ｉ 型过 方便 产量高 可 消除用哺乳动物 Ｉ ｇ Ｇ进 免疫球蛋 白更 易逸 出血管 ，所 以易于参 敏反应 ，具有重要 意义 。Ｉ 还对蠕 虫侵 行血清 学反 应产 生 的非特 异性 反应等特 ｇ Ｅ
素等多种活性 ，调理 ， 凝集和沉淀抗原 ， 起介导这些细胞释放血 管活性物质 。Ｉ ｇ Ｅ
鸡 的免疫球蛋 白主要有 Ｉ Ｉ Ｉ ｇ ｇ ｇ Ｇ、 Ｍ、 Ａ ｇ Ｄ的类似物 。其中应 用最多也较为成 但只在有足够分 子存在并 以正确构型积 加热到 ５ 。３ ６ ｃ ０分钟即被破坏 ， 这在免疫 和 Ｉ
提纯鸡卵黄免疫球蛋白IgY方法的研究
１ ２ ．．
取消毒完毕 的鸡蛋
疾病 的报 道 。鸡 卵黄 抗 体 （ｍ ｕｏｌ ｕ ｎ ｏ Ｊ Ｉｍ ｎｇ ｂｌ ｆ ｏ ｉ ｅｇｙｌ， Ｙ 是 由母鸡血 液 中 Ｉ ｇ ｏ Ｉ ） ｋｇ ｇ Ｇ转移 至其 卵黄 中对子代产生保护性 作用的免疫球蛋 白 。免疫 Ｊ 鸡蛋黄 中含 有 大 量来 源 于血 清 的 Ｉ ｇ Ｇ抗 体 （ 即
第３ ７卷 第 ２期 ２１ ０ ２年 ４月
贵 阳 医 学 院 学 报
Ｊ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＧＵＩ ＹＡＮＧ ＥＤＩ Ｍ ＣＡＬ ＣＯＬ ＬＥＧＥ
Ｖｏ ． ７ Ｎｏ ２ １３ ． ２ ２． ０１ ４
・
技术 与 方法 ・
提 纯 鸡 卵 黄 免疫 球 蛋 白 ＩＹ方 法 的研 究 水 ｇ
４℃ 离 心 １ ｉ， 其 白 色 沉 淀 ， 于 ００ ｏ Ｌ ５ｍｎ 取 溶 ．１ｍ ｌ ／
纯度与得率均较高的提取鸡 卵黄免疫球蛋 白 Ｉ ｇ Ｙ 方法 ， 为大规模制备 口服抗幽门螺旋杆菌 Ｉ ｇ Ｙ抗体 治疗 胃肠道疾病实验提供资料 。
ｐ ７４的 Ｐ Ｓ２ｍ 中。置于双蒸水中搅拌透析 ， Ｈ． Ｂ ｌ １
ｈ后更 换 透 析 液一 次 ， ４～ 共 ５次 ， 析 过 夜 后 ， 透 析
１ 材 料 与 方 法
１ １ 动物 与试 剂 ．
出透析 后 的样 品 ， 以 ０２ ｍ 滤器 过滤灭 菌。 再 ．２ 获得 ＩＹ后用无菌 Ｅ 管盛装 ， 一 ０℃保存 。 ｇ Ｐ 置 ２ Ｊ
１２ ２ 透 析袋 处理 ．． 在 ３０ｍ 透 析 处 理 液 （ ％ ０ ｌ ２
［ 中图分类号 ］Ｒ４． ３１１
［ 文献标识码 ］Ｂ ［ 文章编号］１ ０ ７ （ １） － １－ ０ ． ０ ２ ２０ ０ １ ２ ０２ ７ ０ ２２ ０
特异性卵黄抗体作为药效营养品在饲料中应用
２卵黄抗体作用机理
关于ＩｇＹ的抗病机理，目前尚未完全阐明，推测 主要有两种：①可直接黏附于病原菌的细胞壁上，改 变病原菌细胞的完整性，直接抑制病原菌生长（Ｚｈｅｎ 等，２００８；Ｌｅｅ等，２００２）；②可黏附于病原菌的菌毛 上，减少或阻断菌毛对肠黏膜上皮细胞的黏附，抑制 病原菌侵染（Ｙｏｋｏｙａｍａ等，１９９２；Ｊｉｎ等，１９９８），从而减少腹泻的发生，促进仔猪生长。
ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｌｙ－ｆｒｉｅｎｄｌｙ ａｎｄ ｅｌｉｃｉｔｓ ｎｏ ｕｎｄｅｓｉｒａｂｌｅ ｓｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔｓ，ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｏｒ ｔｏｘｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅｓ．Ｔｈｉｓ ｒｅｖｉｅｗ ｐｒｅｓｅｎｔｓ
ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＹ ｉｎ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌ ａｎｄ ａｑｕａｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ｅｇｇ ｙｏｌｋ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＩｇＹ）；ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ；ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ ａｎｉｍａｌ
犊牛在出生后最初两周最易发生腹泻，主要的 病原体有轮状病毒、冠状病毒、大肠杆菌Ｋ９９和 隐孢子等。Ｅｒｈａｒｄ等（１９９３）和Ｏｚｐｉｎａｒ等（１９９６） 给初生犊牛（０～１４日龄）补充抗大肠杆菌Ｋ９９和 ＨＲＶ的ＩｇＹ鸡蛋粉，从腹泻率、腹泻程度以及腹泻 的时间等几项指标来看，使用ＩｇＹ鸡蛋粉的效果显 著，特别是添加ＩｇＹ组的日增重显著高于对照组（彭 玉耩等，２００２）。
卵黄抗体的应用研究进展
卵黄抗体的应用研究进展【摘要】卵黄抗体又称“卵黄免疫球蛋白（IgY）”，具有强大的免疫功能，目前研究最多、应用最广的是鸡源IgY。
卵黄抗体以其化学性质稳定、制备简单、使用方便、成本低廉等优点，近年来逐渐引起学者的注意，在生物技术、医药卫生、食品科学等方面应用越来越广泛。
随着特异性IgY研究的日益深入，在各个领域显示出令人振奋的应用前景。
【关键词】卵黄抗体；诊断；治疗卵黄免疫球蛋白（egg yolk immunoglobulin）简称IgY，是从免疫后的禽蛋卵黄中提取出的针对某种特定抗原的抗体，多数为IgG，具有强大的免疫功能，因此又称之为“卵黄抗体”。
目前研究最多、应用最广的是鸡源性的卵黄免疫球蛋白。
鸡源性特异性IgY的制备先根据需要选定抗原对产蛋母鸡进行免疫，之后在蛋黄内就会产生抵抗该特定抗原的特异性抗体。
IgY抗体的获取无需采血，只需收集免疫蛋鸡产下的鸡蛋即可大量制备质量均一的特异性抗体[1]。
自20世纪50年代，研究学者就发现鸡卵黄中存在大量抗体，含量与鸡血清中的相当甚至更高；之后随着诸如标准IgY商品试剂的生产、IgY特异性纯化试剂盒的面市，开创了卵黄抗体应用的新时代。
1996年，IgY抗体的生产和应用技术被统称为“IgY技术”[2]，现在它已被列为一个国际化的标准应用技术。
另外由于亲缘关系较远以及结构差异，禽类的IgY与哺乳动物免疫球蛋白之间血清学鉴定不会发生交叉反应[3]，这进一步扩展了IgY的应用范围。
近年来卵黄抗体以其化学性质稳定、制备简单、使用方便、成本低廉等优点，逐渐引起人们的注意，在医药卫生、食品科学、生物技术等方面的应用越来越广泛。
1 IgY在医学疾病诊断方面的应用1.1 细菌性疾病的诊断Kim等人用单核李斯特菌的鞭毛蛋白作为抗原免疫蛋鸡，制备抗鞭毛蛋白抗原的特异性IgY，并通过ELISA法以抗鞭毛蛋白的单抗为包被抗体、特异性IgY 为检测抗体进行该菌的检测，结果显示此特异性IgY的敏感度高，特异性强，并且不与其它菌种发生交叉反应[4]。
卵黄抗体饲料添加剂在家禽生产中的应用
卵黄抗体饲料添加剂在家禽生产中的应用作者：文英先来源：《中国动物保健》2015年第07期在饲料添加剂与疫病防治中长期、大量的滥用抗生素，会导致动物耐药及危害公共卫生，因此，开发无污染、无残留、无副作用的新型饲料添加剂与疫病防治药物逐步成为现代畜牧业研究的热点与重点。
卵黄抗体（ egg volk immunoglobulin，IgY）是禽类B淋巴细胞在抗原物质刺激下产生并沉积在卵黄中的能与抗原发生特异性反应的一种免疫球蛋白，将其作为饲料添加剂不仅可以针对哺乳动物疾病进行被动免疫保护，有效预防控制疾病，还具有营养补充作用，卵黄中除了含有特异性卵黄抗体外还含有蛋氨酸、甘氨酸、丙氨酸等多种氨基酸，以及卵黄高磷蛋白、低聚糖、唾液酸等多种具有免疫调节功能的生物活性物质，且卵黄抗体具有疗效确切、无毒副作用、无污染、制备工艺简单、价格低廉、使用安全等优点。
近年来随着对卵黄抗体生物学功能研究的不断深入，其在动物生产方面的研究日益增多，本文对卵黄抗体在家禽生产中的研究现状与应用前景进行简要综述，以期为卵黄抗体在家禽生产中的进一步合理开发和推广应用提供参考。
1 提高生长性能卵黄抗体本身是一种具有生物活性的免疫球蛋白，应用于动物饲料中能显著提高动物生长性能。
朱锦兰等l6研究表明肉鸭基础日粮中添加0.1%卵黄抗体可将8～14日龄小鸭的平均日增重提高2.89%，日采食量降低3.68%，料重比降低5.88%，可将I5～49日龄大鸭的平均日增重提高2.66%，日采食量降低1.85%，料重比降低1.75%，卵黄抗体可增加肉鸭的生长性能，尤其能够降低小鸭阶段的料重比，提高饲料利用效率。
杨海明等研究表明雏鸡日粮中添加卵黄抗体均可显著促进l～6日龄雏鸡的生长发育，提高雏鸡的体重，提高饲料转化率，提高雏鸡生长性能。
可见，卵黄抗体作为动物饲料添加剂按不同水平添加至动物饲料中，可以促进动物的生长，提高动物生长性能，增加养殖经济效益。
2 改善肠道功能将卵黄抗体添加于动物饲料中能显著提高肠道功能，进而提高营养物质利用率。
鸡卵黄免疫球蛋白IgY酶联免疫分析
鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。
检测范围：96T30 ng/L - 900ng/L使用目的：本试剂盒用于测定鸡血清、血浆及相关液体样本中卵黄免疫球蛋白（IgY）含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）水平。
用纯化的鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入卵黄免疫球蛋白（IgY），再与HRP标记的卵黄免疫球蛋白（IgY）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的卵黄免疫球蛋白（IgY）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）浓度。
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
(IgY)的性质、提纯及应用于寄生虫学的研究
任平国等ｌｌ叩采用的有机物沉淀法。其原理为： 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多 的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液或碱中，可用乙 醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具有一定的亲水性 和较强的亲脂性，是理想的提脂蛋白的提取液。其 工艺流程为：卵黄一８倍水稀释并搅１０ｍｉｎ－－－用 ＨＣｌ调ｐＨ至５．２后在４＂Ｃ静置２ｈ去沉淀一在上 清液中加入９５％冰乙醇（一２０℃）使终浓度为６０％ （ｖ／ｖ）一４℃搅拌２０ｍｉｎ后离心（２２ ０００ｒ／ｒａｉｎ，４＂Ｃ， ２５ｒａｉｎ）一收集沉淀并加入０．０２８ｍｏｌ／Ｉ。ＮａＣｌ溶液 在４＂Ｃ下过滤除去脂蛋白沉淀一收集的滤液用 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法进行纯化得纯度为９８％的ＩｇＹ。用 大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）对其活性进行测定，效果良好， 此方法能保持免疫球蛋白的活性。
虫病防治中越来越受到重视。 １卵黄抗体（ＩｇＹ）的性质
源的试剂要好而且经济。 １．３获取抗体简单ＩｇＹ无需采血，只需收集免疫 母鸡产下的鸡蛋即可获得抗体。传统的哺乳动物来 源的抗体搜集需通过繁杂的注射及免疫表达过程， 且需要在常规间隔时间内收集血清。ＩｇＹ大大简化
了这一流程Ｈｊ。
１．４假阴性或假阳性率低
Ｉｓｍａｅｌ
Ｍａｒｃｅｔ［７３等提出了聚乙二醇法（ＰＥＧ），
其卵黄用２倍体积缓冲液稀释后，采用８．５％、１２％ ＰＥＧ两次沉淀，重新溶解后用Ｔｒｉｓ—ＨＣｌ沉淀，得
４．８±０．８ｍｇＩｇＹ／ｍＬ卵黄。
Ｃｌｄｕｄｉａ Ｍａｒｉａ Ｃｏｓｔａ ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ等【８０报道的水
Ｄｏｎｇ［１副等，为寻找最适配体，用按照最
中国人兽共患病学报
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ
４４ｌ
文章编号：１００２—２６９４（２０１１）０５—０４４１一０３
卵黄抗体及其在动物疾病中的应用
结语
ＩｇＹ是一种易于生产、安全、均一的特异性抗体，且性质稳 定，安全无毒副作用，无药物残留、耐药性等问题。可部分替代 抗生素，又能弥补传统疫苗的不足，提供及时有效的保护，在动 物疾病的预防、检测、治疗中有良好的前景 。 ［９］
刘文鑫等用重组大肠杆菌 Ｋ８８ａｂ和 Ｋ９９原核表达蛋白制 备的鸡 ＩｇＹ对仔猪黄痢和仔猪白痢的预防有效率为 １００％，保 护率为 ９１％；治疗有效率为 １００％，治愈率为 ８７％，表明对仔猪 腹泻有很好的疗效 ［６］。王 林 会 等 联 合 使 用 金 黄 色 葡 萄 球 菌 外 毒素及荚膜特异 性 卵 黄 抗 体，可 有 效 中 和 外 毒 素，有 效 保 护 ＭＡＣ－Ｔ细胞，阻断金黄色葡萄球菌 ＲＮ６３９０对 ＭＡＣ－Ｔ细胞 的侵袭，显著改善细胞的生长形态［７］。
疫病防治
ＬＩＶＥＳＴＯＣＫ ＡＮＤＰＯＵＬＴＲＹＩＮＤＵＳＴＲＹ
Ｎｏ．７，２０１８
卵黄抗体及其在动物疾病中的应用
王 刚，杨旭东，杨淑萍
（黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江 齐齐哈尔 １６１００５）
摘 要：卵黄抗体（Ｅｇｇｙｏｌｋａｎｔｉｂｏｄｙ）又称卵黄免疫球蛋白（Ｅｇｇｙｏｌｋｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，ＩｇＹ）指用特定抗原对产蛋禽进行免 疫，机体刺激法氏囊 Ｂ细胞分化成浆细胞，分泌特异性的抗体进入血液，血液流经卵巢时特异性抗体主要是 ＩｇＹ在卵细 胞中逐渐累积，为胚胎和幼雏提供被动免疫保护。卵黄抗体效价稳定、提取工艺简单方便、成本低、安全高效，在动物疾 病防治中有广阔的应用前景。 关键词：卵黄抗体；动物疾病；应用 中图分类号：Ｓ８５２．４ 文献标识码：Ｂ ＤＯＩ：１０．１９５６７／ｊ．ｃｎｋｉ．１００８－０４１４．２０１８．０７．１００
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1概述
卵黄抗体（yolk antibody, IgY）：通过免疫注射产蛋鸡，即可由其生产的蛋黄中提取相应的抗体，并可用于相应疾病的预防和治疗，这类制剂称为卵黄抗体。
2IgY的形成、作用机理与制备
卵黄抗体的形成
禽类的免疫系统包括细胞免疫和体液免疫，分别受胸腺和法氏囊的控制。
当机体受到外来抗原刺激后，法氏囊内的B细胞分化成为浆细胞，分泌特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体(主要是IgG)在卵细胞中逐渐蓄积，形成卵黄抗体；当卵细胞分泌进入输卵管时，流经输卵管的血液中含有的特异性抗体(主要是IgA和IgM)进入卵清中，形成卵清抗体。
IgG移行进入卵细胞是受体作用的结果，因而IgG可在卵细胞中大量蓄积，浓度高于血液中的IgG。
与卵黄抗体相比，卵细胞在输卵管中移行的时间较短，因而卵清抗体含量极微。
卵黄抗体在禽胚孵化过程中逐渐进入禽胚血液，为刚出壳雏鸡提供被动免疫保护，在雏鸡疾病预防中具有重要作用，但同时也会干扰鸡疫苗的免疫效果。
IgY的性质
IgY的性质与哺乳动物的IgG相似。
正常鸡IgY的分子量约为180KDa，由两条轻链(2L)和两条重链(2H)组成，分子量分别为60-70KDa和22-30KDa。
其等电点约为5.2。
IgY与一般哺乳动物IgG相比，IgY具有较强的耐热、耐酸、抗离子强度和一定的抗酶降解能力。
在低于75℃条件下，IgY具有良好的热稳定性。
IgY制剂在4℃贮存5年或在室温贮存6个月其活性仍无明显变化或下降，65℃时可保持24h以上，70℃时加热90min后其活性才明显下降60℃，30min条件下巴氏消毒不影响IgY；高于80℃，大部分IgY失去活性。
IgY在pH4.0-11.0时比较稳定，pH3.0-3.5时活性迅速下降，pH12时活性亦有所下降。
IgY对胃蛋白酶有较高的抵抗力，但对胰蛋白酶十分敏感。
将胃蛋白酶和IgY在pH2.0温育1h后，几乎所有活性丧失，但在pH4.0时1h后可保持91%的活性，甚至温育10h后仍有63%活性。
IgY分别与胰蛋白酶和胰凝乳酶温育8h，活性分别保持39%和41%。
IgY的作用机理
特定病原菌的卵黄抗体能直接黏附于病原菌的细胞壁上，改变病原细胞的完整性，直接抑制病原菌的生长；卵黄抗体可黏附于细菌的菌毛上，使之不能黏附于肠道黏膜上皮细胞；一部分卵黄抗体在肠道消化酶作用下，降解为可结合片段，这些片段含有抗体的可变小肽(Fab)部分，这些小肽很容易被肠道吸收，进入血液后能与特定的病原菌黏附因子结合，使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性，而IgY的稳定区(Fe部分)留在肠内。
IgY分离、提纯方法
卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，其比例为1：2。
大部分蛋白质都是脂蛋白，存在于卵黄颗粒中，不溶于水，只有卵黄球蛋白(α、β、γ)是水溶性的，而IgY 是γ卵黄球蛋白。
因此IgY的分离纯化首先需要有效地去除卵黄中的脂类，从水溶性蛋白中分离IgY。
多年来，已建立了许多较为高效而经济的方法，这些方法大多以PEG、硫酸葡聚糖、天然胶，如藻酸钠、角叉聚糖或乙醇沉淀等方法初步纯化蛋白质。
1980年，Polson首先提出聚乙二醇(PEG)两步沉淀法，分别用终浓度为3.5%和12%的PEG分步沉淀，用硫酸铵盐析法去除PEG。
1985年，在此基础上提出了冷乙醇沉淀的改进方法，使产量提高，而且能有效地去除残留PEG。
1981年Jensensius等提出了硫酸葡聚糖沉淀法(DS法)，PEG法和DS法的产量相当，但提取的IgY制品含有一定量的杂蛋白。
Bade和Stegemann(1984)用预冷的丙烷和丙酮(-20℃)沉淀蛋白质并去除脂质，经DEAE柱层析进一步纯化，其IgY抗体活性与用Polson法提纯的IgY之间无明显差别，且稳定性好，经3次以上冻融，抗体活性未见改变。
1992年Akita等用水稀释法(WD)提纯IgY，每个卵黄可获得100mg
以上的IgY。
此后，Akita等比较了WD法、PEG法、DS法和黄原胶法(Xanthan法)的提纯效果，结果表明：WD法产量最高，其次为DS法，WD法更适合大规模生产。
1993年，Horikoshi提出了冷乙醇分级离心的方法，分别用60%、30%、25%的冷乙醇沉淀离心，得到纯度达99%以上的IgY。
此法适用于大规模制备IgY。
工业上大规模生产IgY的方法有：超临界二氧化碳气体抽提法、卡拉胶法、硫酸铵盐析法。
3IgY在动物疾病防治方面的应用
研究表明，IgY能抵抗幼龄动物肠道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化。
故常在幼畜饲料或添加剂中加入一定量的针对某些特定疾病的IgY，以使其获得有效的被动免疫。
何月英等利用小鹅瘟强毒制备的卵黄抗体，对2-3日龄雏鹅进行预防，其保护率高达100%。
杨晓梅等用鸭病毒性肝炎I型鸡胚毒免疫鸡，制备的鸡抗鸭病毒性肝炎高免卵黄抗体，经实际应用于预防时，雏鸭的平均成活率为96.9%。
IgY在动物疾病治疗方面的应用
目前，卵黄抗体己被广泛应用于许多疾病的防治。
汪铭书应用抗鸭病毒性肝炎(DHV)的卵黄抗体治疗人工感染的鸭时，当用1万倍LD50强毒时保护率可达到100%。
张英等用抗小鹅瘟的卵黄抗体治疗发病鹅群，治愈率为95.2%。
此外，应用多种病原菌免疫制备的卵黄抗体还可以防治多种病原菌的感染。
詹丽娥等用IBD、ND和EDS-76三联高免卵黄抗体治疗上述三种疾病，总有效率可达50%以上。
日本成功地从鸡蛋中提取出能够杀死幽门螺旋杆菌的抗体，并以这种抗体为原料制成了能杀死人体内幽门螺旋杆菌的酸奶。
用CaCl2制备大肠杆菌感受态细胞
2. 试剂及配制
LB培养基（100ml）：胰化蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl 1g，定容至100ml，高压灭菌，备用。
0.1mol/L的CaCl2-MgCl2：80mmol/L MgCl
，20mmol CaCl2。
2
0.1mol/L 的CaCl2：取出1mol/L的CaCl
（11.1gCaCl2加入到100ml四蒸水中）灭菌贮存液10ml加90ml灭菌水稀释至100ml。
1mol/L的CaCl2贮存液事先0.22
2
微米滤膜过滤除菌，后保存于4℃。
3. 实验步骤
（1）从37℃培养16-20h 平板中挑取一个单菌落（直径2-3mm），转到一个含有4ml LB培养基的玻璃试管中，37℃，250rpm振摇过夜培养。
（2）将过夜培养物以1：100的比例转接到含有100ml LB培养基的锥形瓶(500ml)中，37℃，250rpm振摇培养至对数生长期，一般需1.5-3h。
（3）将培养物转移到无菌、冰预冷的2个50ml聚丙烯管中（不要装太满以防离心管破裂），冰上放置10min。
（4）4℃，4100rpm离心10min，以回收细胞。
（5）倒出培养液，将试管倒置1min，以使最后的痕量培养液流出。
（6）沉淀用冰预冷的0.1mol/L的CaCl2-MgCl2（每100ml培养基用30ml）溶液重悬。
（7）4℃，4100rpm离心10min，倒出培养液（方法同5），回收细胞。
（8）每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1mol/L 的CaCl2重悬沉淀。
（9）每2ml重悬细胞液加70μl DMSO（二甲基亚砜），轻轻旋转混匀之，将悬液置于冰上15min。
（10）每2ml细胞悬液再加70μl DMSO，轻旋混匀，至于冰上15min；
（11）迅速将悬液以50-100μl每份分装到冷却的无菌1.5ml离心管中，用封口膜封口，投入液氮中快速冷冻（约1min），贮存于-80℃冰柜。
表达载体的构建（双酶切、连接、转化）
3. 实验步骤
（1） 取一支干净、灭菌的Eppendof 管，按下表加入各种试剂将连接有目的片段的克隆质粒进行双酶切
（2） 37℃保温１－２小时（时间可适当延长）
（3） 取2μl 左右的反应液加入2μl 电泳加样缓冲液，电泳，根据条带的粗细和亮暗和估计目的片段和载体片段的比例。
（4） 取干净、灭菌Eppendof 管，按下表加入各试液进行连接
（5） 连接反应：16℃过夜（长于8小时） （6） 转化
1) 准备1.5ml 的离心管，冰浴预冷。
2) 取100ul 感受态细胞，加入10ul 连接液，冰浴30min ，期间切忌振动。
3) 42℃热激90sec ，不要振动(关键步骤，一定注意温度及时间)。
4) 冰浴2min 。
5) 加LB 培养基890ul ，37℃，225rpm 或者200rpm ，培养45-60min 。
6) 3000rpm×2min 离心。
7) 留100ul 上清，弃多余部分，混匀，涂布到含抗生素（根据不同的表达载体选择不同的抗生素）的LB 琼脂平板，若平板放置时间过长可在涂板时涂上适当量的相应的抗生素（10-30ul ）。
8) 37℃ 培养箱正置至平板上无明显液体流动，倒置培养过夜，约16-20小时，观察是否长出单菌落。