碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的分离与纯化
酶工程实验碱性磷酸酶实验报告
猪肝中碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究实验报告摘要：碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，简称ALP)广泛存在于微生物和动物体内，是一种非特异性磷酸单酯酶。
本实验材料取自猪肝，采用有机溶剂沉淀分离纯化其中所含的碱性磷酸酶，运用终止法和考马斯亮蓝法测定其酶活力和蛋白质含量。
根据酶活力变化，进行不同温度，PH对该酶的影响的实验，得出最适温度和最适PH。
关键词：碱性磷酸酶；有机溶剂沉淀；酶活力；PH；温度1 前言碱性磷酸酶是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。
碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。
而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。
本实验中所用的猪肝中的碱性磷酸酶含量颇高，且其活性可在较长时间内得以保持。
1.1实验目的掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶的原理和方法；酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、得率及纯化倍数的概念及计算；了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方法。
1.2 实验试剂与仪器1.2.1 实验仪器电子天平；匀浆器；紫外可见分光光度计；高速冷冻离心机；PH计；磁力加热搅拌机1.2.2实验试剂及配制95%乙醇、丙酮、正丁醇、醋酸镁、醋酸钠、Tris、考马斯亮蓝G－250、硫酸镁、氢氧化钠（1）0.01mol/L醋酸镁－0.01mol/L醋酸钠混合溶液：取0.5mol/L醋酸镁20mL 及0.1mol/L醋酸钠100mL，混匀后加蒸馏水稀释至1000mL。
（2）0.01mol/L Tris-硫酸镁缓冲液（pH8.8）：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.1g，用蒸馏水溶解，并稀释至1000mL，配制0.1mol/L Tris溶液；取0.1mol/L Tris溶液100mL，加蒸馏水约700mL，再加0.5mol/L醋酸镁20mL，混匀后用1%醋酸溶液调节pH至8.8，用蒸馏水稀释至1000mL即可。
实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告
实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析实验日期2011年10月25号实验地点生化实验室合作者指导老师总分教师签名批改日期碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。
AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。
AKP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。
血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。
AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。
一实验原理1、碱性磷酸酶的分离纯化AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。
有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。
本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。
正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。
2、碱性磷酸酶的比活性测定根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg •pr）来表示。
因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。
酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。
本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。
酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。
于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。
生化实验碱性磷酸酶的提取与鉴定
实验中的问题与改进
通过总结实验中的问题 并寻找改进方法，我们 可以提高实验效率和准 确性，从而更好地完成 生化实验任务并为未来 的研究打下坚实基础
生化实验:碱性 磷酸酶的提取与
鉴定
1 实验目的 3 实验步骤 5 实验结论 7 实验思考与拓展 9 实验中的问题与改进
-
2 实验原理 4 结果分析 6 实验讨论与改进 8 实验总结
1
实验目的
实验目的
本实验旨在学习 掌握碱性磷酸酶 的提取与鉴定方 法，了解其理化 性质及生物学意 义
2
实验原理
实验原理
该酶的理化性质及生物学意义，还锻炼了我们的实验操作技巧和处理生化样品的能力
2
通过实验，我们认识到碱性磷酸酶作为一种重要的生物酶，在生物体内发挥着参与物质代谢、能量转 化等重要生物学功能。此外，该酶在临床诊断、生物工程和环境监测等领域也具有广泛的应用价值
在实验过程中，我们需要注意实验细节和试剂的正确使用，以保证实验结果的准确性和可靠性。例如，
4
结果分析
结果分析
通过本实验，我们成功地提取并鉴 定了碱性磷酸酶
实验结果显示，该酶具有较高的活 性，且蛋白质浓度符合预期
通过本实验，我们掌握了碱性磷酸 酶的提取与鉴定方法，了解了其理 化性质及生物学意义
同时，实验过程中需要注意操作细 节和试剂的正确使用，以保证实验
结果的准确性和可靠性
5
实验结论
实验中的问题与改进
在实验过程中，我们可能会遇到一
01
些问题，例如提取的酶活性不高、
碱性磷酸酶的分离纯化实验报告
碱性磷酸酶的分离纯化实验报告实验报告：碱性磷酸酶的分离纯化引言：碱性磷酸酶是一种常见的酶类，在生物化学和生物工程领域有着重要的应用价值。
分离纯化碱性磷酸酶可以有效地提高其催化活性，从而更好地满足利用需求。
本实验旨在通过分离纯化的方法获得高纯度的碱性磷酸酶。
材料与方法：材料：1. 含有碱性磷酸酶的混合酶液；2. DEAE-纤维素离子交换柱；3. 带有荧光物质的酶学百科试剂盒；4. 透析膜。
方法：1. 将50 mL含有碱性磷酸酶的混合酶液，通过DEAE-纤维素离子交换柱进行分离纯化；2. 用PBS缓冲液洗涤纤维素柱，收集洗脱液以及洗脱后的洗脱液，测定酶活力；3. 分别将洗脱后的洗脱液和洗脱液透析入PBS缓冲液中；4. 用带有荧光物质的酶学百科试剂盒测定样品的酶活力。
结果：样品中碱性磷酸酶的活性经过分离纯化后得到了提高，相对活性提高了3倍以上。
同时，样品纯度也有了显著的提高。
分析和讨论：本实验通过离子交换柱和透析膜的方法，成功地分离和纯化了碱性磷酸酶。
实验中使用的DEAE-纤维素离子交换柱是一种较为成熟且常见的方法，具有操作简单、精度高等特点。
透析膜则可以更为彻底地去除不需要的杂质，进一步提高受体的纯度。
在实验结果中，我们发现酶的相对活性得以提高，这说明经过纯化后酶的质量得到了提高，可以进行更好地应用。
但同时，这样的分离纯化也存在一定的局限性，如纯度并没有达到100%，仍存在需进一步提高的空间。
结论：本实验成功地纯化和分离了碱性磷酸酶，提高了其相对活性，获得了具有实际应用需求的高纯度酶样品。
同时，在实际应用过程中，需要根据需求进行更为严格的纯化和分离，以满足更加精细化的需求。
设计碱性磷酸酶的提取、分离纯化方案
AKP纯化程度鉴定
• 纯化程度用酶的比活性反应。
• 酶比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶活性。
碱性磷酸酶的活性测定 磷酸笨二钠法
• 在pH10环境中，AKP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸 氢二钠，苯酚与4-氨基安替比林反应生成色素原，该色素 原经铁氰化钾氧化生成红色醌亚衍生物。
• 测定红色衍生物的吸光度就可以计算酶活性的大小。
离子交换层析法的原理
• 阳离子交换膜可以看作是一种高分子电解质,他的 高分子母体是不溶解的,而连接在母体上的磺酸集 团带有负电荷和可解离离子相互吸引着,他们具有 亲水性。 • 由于阳膜带负电荷,虽然原来的解离正离子受水分 子作用解离到水中,但在膜外我们通电通过电场作 用,带有正电荷的阳离子就可以通过阳膜,而阴离子 因为同性排斥而不能通过,所以具有选择透过性。
实验原理
1. 动物肝脏中含有丰富的碱性磷酸酶（AKP）。 2. 在正丁醇中脂类不溶而蛋白质溶解，可以借此除 去与酶结合的脂类（酶也是蛋白质）。 3. 有机溶剂分步沉淀法纯化
有机沉淀法
• 实验采用有机溶剂分步沉淀法,从兔肝中提取碱性 磷酸酶. AKP溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇 或50%丙酮中则形成沉淀。通过离心可以使AKP和 其他蛋白分离，从而得到纯化。 反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度的AKP。
滤液中加入等体积的冷丙酮，立即混匀后离心 2000r/min5min，弃去上清液。在沉淀中加入0.5mol/L 醋酸镁2mL用玻棒充分搅拌使其溶解，记录溶液体积。
立即混匀后使用台式低速离心机离心 5min(2000 r/min)，弃上清液。
向沉淀中加入4.0mL0．5mol/L 醋酸镁溶液， 充分搅拌使其溶解，同时记录悬液体积向上清 液中加入95％冷乙醇，使乙醇终浓度达60％， 混匀后立即离心5min(2500r/min)，弃上清。 向沉淀中加入4．0m1 0.0lmol/L 醋酸镁一 0.01mol/L 酸酸钠溶液，充分搅拌，使其溶解。 向上余悬液中逐滴加入冷丙酮，使丙酮终浓度 达33％，混匀后离心5min(2000r/min)，弃去 沉淀
碱性磷酸酶提取分离纯化
碱性磷酸酶提取分离纯化碱性磷酸酶、广泛存在于微生物界和动物界，碱性磷酸酶几乎能催化所有磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。
他也可以催化磷酸基团的转移反应。
磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。
碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单酯化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂，AKP具有磷酸基团转移活性能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有氢基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。
•KP最适合PH范围为8.6-10，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。
血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。
AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，从表达菌提取，并进行动力学分析。
分离纯化：1、取1g新鲜的兔肝至于70℃冰箱内进行预先冷冻处理后取出，至于玻璃匀浆器内。
加入0.01mo1/L醋酸镁、0.01mo1/L醋酸钠混合溶液3mL,充分研磨至糊状。
2、将匀浆液倒入刻度离心管中，使用4ml、0.01mo1/L醋酸镁、0.01mo1/L醋酸钠混合溶液冲洗研磨器具，将冲洗液一并转入离心管内，离心管一定要置于冰块保护下，以后各个步骤也要注意保持低温。
3、加1mL正丁醇与匀浆原液中，使用玻璃棒充分搅匀，放置冰浴中2min。
使用滤纸过滤，过滤置于另一支刻度离心管中，过滤液也需要冰块保护。
4、滤液中加入等体积的冷丙酮，立即混匀后离心、2000r/min5min，弃去上清液，在沉淀中加入0.5mol/L醋酸镁2mL用玻璃棒充分搅拌使其溶解。
5、向沉淀中加入4.0mL0.5mol/L醋酸镁溶液，充分搅拌使其溶解。
同时记录悬液体积向上清液中加入95%冷乙醇，使乙醇浓度到达60%，混匀后立刻离心5min（2500r/min），弃上清液。
6、向沉淀中加入4.0ml 0.01mol/L醋酸镁一0.01mol/L酸钠溶液，充分搅拌，使其溶解。
碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质
在生物工程中的应用
生产生物催化剂
碱性磷酸酶可以作为生物催化剂，在生物工程中用于 合成磷酸酯、脱氧核糖核酸等物质。
蛋白质剪切
碱性磷酸酶可以催化蛋白质剪切，对蛋白质的结构和 功能进行修饰。
生产药物
碱性磷酸酶可以用于制备药物，如抗癌药物、抗生素 等。
在医学诊断中的应用
肝功能检查
碱性磷酸酶是肝功能检查的重要指标之一，可 以反映肝细胞的损伤程度。
碱性磷酸酶可以作为营养补充剂，用于补充 人体所需的矿物质和维生素。
05
CATALOGUE
碱性磷酸酶的研究展望
研究现状与挑战
研究现状
目前对碱性磷酸酶的研究已经涉及多个领域 ，包括生物学、医学、化学等。在生物体内 ，碱性磷酸酶的作用是参与磷酸基转移反应 ，具有重要的作用。然而，对于碱性磷酸酶 的精确调控机制，仍需进一步研究。
琼脂糖凝胶电泳
利用琼脂糖凝胶作为支持物，根据蛋 白质分子大小和形状的不同进行分离 。
03
CATALOGUE
碱性磷酸酶的酶学性质
酶的磷酸酶的米氏方程可以表示为V=Vmax\*[S]/（ Km+[S]），其中V是反应速率，Vmax是最大反应速率， [S]是底物浓度，Km是米氏常数。
挑战
尽管已经对碱性磷酸酶进行了广泛的研究， 但仍存在许多挑战。例如，如何提高碱性磷 酸酶的分离纯化效率，以及如何精确调控碱 性磷酸酶的酶学性质等。此外，对于碱性磷 酸酶在生物体内的具体作用机制，也需要进
一步深入研究。
未来研究方向
研究方向1
进一步探究碱性磷酸酶的调控机制。 通过对碱性磷酸酶的基因表达、后转 录修饰以及与其他分子的相互作用等 方面的研究，可以更深入地了解其调 控机制，为相关疾病的治疗提供理论 依据。
碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定
碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定一、实验原理(1).碱性磷酸酶的分离纯化1.机械破碎法制备肝匀浆低浓度乙酸钠：低渗破膜低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加入不同有机溶剂重复离心正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP(2).比活性测定1.比活性的定义*单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。
*通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。
*用以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之一。
2.测定样品的比活性必须测定：*每毫升样品中的酶活性单位数。
*每毫升样品中的蛋白质毫克数。
3.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理(3).米氏常数测定K m即为米氏常数，V max为最大反应速度＊如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此,米氏常数的单位为mol/L。
当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 V max, K m = [S]＊吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。
以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km值。
二. 器材721分光光度计台式离心机恒温水浴锅微量移液器托盘天平匀浆器试管三.试剂1. 0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁5.3625g溶于蒸馏水中,稀释至50ml.2. 0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml.4. 丙酮(分析纯).5. 95%乙醇(分析纯).6. Tris缓冲液(Ph8.8) 称取Tris 6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/L Tris 液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml.7. 0.01mol/L基质液称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2.2H2o)0.3g,4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可用一星期;临用时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可.8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液称取无水碳酸钠0.318g及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水,稀释至50ml.9. 碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml.10. 0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸馏水中,溶解后两液混合均匀,再加蒸馏水至50ml,置棕色瓶中暗处保存.11. 0.1mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.12. 酚标准液(0.1mg/ml).四.实验步骤(1). “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作(2).“碱性磷酸酶比活性测定”实验操作1.样品中碱性磷酸酶活性测定:(1).取5支试管,编号,按表1操作:表1A’B’C’D’标准空白各阶段稀释液(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 - -0.1mg/ml酚标准液(ml) - -- - 0.1 -pH8.8Tris缓冲液(ml) - - - - - 0.1置37℃水浴中保温5分钟复合基质液(ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0混匀,37℃水浴中准确保温15分钟.保温结束后,各管立即加入1.0ml碱性溶液终止反应,再加入0.5%铁氰化物钾2.0ml,立即混匀,静置10min,在510nm波长下比色测定.2.酶活性单位计算每毫升酶液中酶活性单位=测定OD/标准OD X标准管中酚含量X1/0.1X稀释倍数3.样品中蛋白质含量的测定(1)测定蛋白质时,保留的A’管还需稀释5倍为A’’管,否则蛋白质浓度太高,其余各管不需再稀释,各用1.0ml进行测定.表2A’’B’C’D’空白各阶段稀释液(ml) 1.01.01.01.0 -0.1mg/ml酚标准液(ml) - -- -1.0pH8.8Tris缓冲液(ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0混匀,置20~25℃水浴中保温10分钟复合基质液(ml) 0.50.50.50.50.5(2)立即振摇均匀,在20~25℃保温30min后,于650nm波长处比色.(3)蛋白质浓度计算:从Lowry法标准曲线查得的蛋白质毫克数,乘以稀释倍数,即为每毫升样品中蛋白质毫克数.4.比活性及得率计算碱性磷酸酶比活性=每毫升样品中碱性磷酸酶活性单位数/每毫升样品中蛋白质毫克数纯化倍数=各阶段比活性数/匀浆(A液)比活性数得率=各阶段酶的总活性单位/匀浆(A液)中的酶的总活性单位X100%5.实验结果将上述各实验计算结果填入表3内.表3分离总体积蛋白质总蛋白每毫升酶总活性比活性纯化得率阶段(ml) 浓度(mg) 活性单位单位(U/mg ) 倍数(%)(mg/ml) (U/ml) (U)匀浆(A液)第一次丙酮沉淀(B液)第二次丙酮沉淀(C液)第三次丙酮沉淀(D液)3．米氏常数测定1. 取15只试管，按照下表操作，1～7号重复两组，0 号为空白对照。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的分离与纯化
一、实验目的
1.掌握酶分离纯化的一般步骤及相关原理；
2.悉碱性磷酸酶的分离纯化的方法步骤。
二、实验原理
有机溶剂分级沉淀是分离蛋白质的常用方法之一。
有机溶剂能使许多
溶于水的酌生物大分子发生沉淀，其主要作用是降低水溶液的介电常数。
例如20℃时水的介电常数为80，82％的乙醇溶液的介电常数为40。
溶液的介电常数降低意味着溶质分子间异性电荷库仑引力增加，从而
使溶质的溶解度降低。
这一点可从静电学的库仑定律中得到阐明。
同时有机溶剂溶于水，对
大分子物质表面的水化膜具有破坏作用，最后使这些大分子脱水而互
相聚集析出。
沉淀不同物质所需有机溶剂的浓度不同，利用不同蛋白
质在不同浓度的有机溶剂中发生沉淀作用而达到分离。
用于生物大分子分级分离的溶剂主要是能与水互溶的有机溶剂，常用
的有乙醇、甲醇和丙酮等。
进行有机溶剂沉淀时，欲使原溶液中有机溶剂达到一定浓度，需加入
有机溶剂的浓度和体积可按下式
计算：
V－需加10 0％有机溶剂剂的体积；
V0－原溶液的体积；
S1－原溶液中有机溶剂的浓度；
S2－要求达到的有机溶剂浓度；
100－指加入的有机溶剂浓度为100％。
如所加入的有机溶剂的浓度为9 5％，上式(100一S2)项应改为(95一 S2)。
在大规模制备沉淀时，若溶剂浓度的要求不太严格时，可用简单的交
叉方法求出。
本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶(简称AKP)。
先用低浓度醋酸钠(低渗破模作用)制备肝匀浆。
醋酸镁则有保护和稳
定AKP 的作用。
匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。
含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复
分离纯化。
根据AKP 在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解，而在50％的
丙酮或60％的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取，可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。
用有机溶剂分离纯化酶(或蛋白质)必须注意以下几点：
(1)有机溶剂沉淀是个放热过程，所以要在低温下进行。
溶剂应预冷，
加入时要边搅拌边滴加，以避免局部浓度过高使酶蛋白变性。
(2)溶剂的pH 值最好控制在被分离物质的等电点附近，以提高被分离
物质的分离效果。
蛋白质浓度应控制在5-20 mg/m1，以防止高浓度样
品的共沉淀作用。
(3) 溶液的离子强度控制在0.05一0.1范围内。
(4)有机溶剂中有中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性，提
高分离效果。
中性盐浓度一般 0.05mo1/L 左右为好，过高影响沉淀。
三、仪器、原料与试剂
仪器
移液管、量筒、玻璃勺浆器(管)、剪刀、离心机、新华定性滤纸。
原料
新鲜兔肝
试剂
1. 0.5mol/L 醋酸镁溶液：107.25g 醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至100
0 m1。
2. 0.1mol/L 醋酸钠溶液：8.2g 醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至1000 m
1
3. 0.0lmol/L 醋酸镁一0.01mol/L 酸酸钠溶液：准确吸取20mL 0.5mo
l/L 醋酸镁溶液及100mL0.14mol/L 醋酸钠溶液，混匀后定容至1000 m 1。
4. Tris—HCl pH8.8缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷12.1g，用蒸馏水
溶解后定容至1000mL，即为0.1mol/LTrls 溶液。
取100m10.1mol/LTrl
s 溶液，加蒸馏水约780mL，再加0.1mol/L 醋酸镁溶液100m1，混匀后
用1％冰醋酸调pH 为8.8，用蒸馏水定容至l000m1。
5. 正丁醇、丙酮、95％乙醇均为分析纯试剂。
四、操作步骤
以下操作均在4~10℃进行。
1.称取新鲜兔肝2g，剪碎后，置于玻璃匀浆器中，加入
2.0mL0．01mol
/L 醋酸镁一0.01mol/L酸酸钠溶液，充分磨成匀浆后，将匀浆液转移
至离心管中，用4.0mL 上述溶液分两次冲洗匀浆管，并倒入离心管中，混匀，此为A 液。
另取1支试管，编号为A，取0.1mLA 液，加4.9mLTri
s缓冲液掖(pH 8.8)，混匀，供测酶活性用。
2.加2.0mL 正丁醇溶液于上述剩余的匀浆液中，用玻璃棒充分搅拌2mi
n 左右。
然后在室内放置20 min 后，滤纸过滤，滤液置离心管中。
3.于滤液中加人等体积冷丙酮，立即混匀后离心5min(2000 r/min)，
弃上清波，向沉淀中加入4.0mL0．5mol/L 醋酸镁溶液，用玻璃棒充分
搅拌使其溶解，同时记录悬液体积，此为B掖。
吸取0.1m1B 液，置于
编号为B 的试管中，加入4.9m1Tris 缓冲掖(PH 8.8)，供测酶活用。
4.取剩余悬液体积，并计算使乙醇终浓度为30％需要加人的95％冷乙
醇量。
按计算量加入乙醇，混匀，立即离心5min(2000r/min)，量取上
清液体积。
倒人另一离心管中，弃去沉淀。
向上清液中加入95％冷乙醇，使乙醇终浓度达60％(计算方法同前)，
混匀后立即离心5min(2500r/min)，弃上清。
向沉淀中加入4．0m1 0.0 lmol/L 醋酸镁一0.01mol/L 酸酸钠溶液，充分搅拌，使其溶解。
5.重复操作步骤4，向悬浮液中加入冷乙醇(95％)，使乙醇终浓度达3 0％，混匀后立即离心5min(20 00r/min)，计算上清液体积，倒人另
一离心管中，弃去沉淀，向上清液中加入95％
的冷乙醇，使乙醇终浓度达60％。
混匀后，立即离心 5min(2500 r/mL n)，弃上清夜，沉淀用3mL0.5mol/L 醋酸镁溶液充分溶解，记录体积，此为C 液。
吸取C 液0.2m1置于编号为c 的试管中，加入3.8m1Tris 缓
冲液(PH 8.8)，供测酶活性用。
6.向上述剩余悬液中逐滴加入冷丙酮，使丙酮终浓度达33％，混匀后
离心5min(2000r/min)，弃去沉淀。
量取上清液体积后转移至另一离心
管中，再缓缓加人冷丙酮，使丙酮终浓度达 50％，混匀后立即离心15 min(4000r/min)，弃上清液，沉淀为部分纯化的碱性磷酸酶。
向此沉
淀中加入4.0m1Tris pH8.8缓冲液，使沉淀溶解，再离心5min(2000r/m in)，将上清液倒入试管中，记录体积、弃去沉淀。
上清液即为部分纯
化的酚液，此为D 液。
吸取0．2m1D 液置于编号为D 的试管中，加入0．8m1Tris 缓冲液(pH8.8)，供测酶活性用。