血清碱性磷酸酶ALP磷酸对硝基苯酚法测定
碱性磷酸酶(ALP)测定(速率法)标准化操作程序文件
碱性磷酸酶（ALP）测定（速率法）标准化操作程序文件1：概述碱性磷酸酶英文简称AKP或ALP，是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织,。
它不是单一的酶，而是一组同功酶。
目前已发现有AKP1 、AKP2 、AKP3 、AKP4 、AKP5 与AKP6 六种同功酶。
碱性磷酸酶（ALP）：是从牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。
从大肠杆菌提取的AP分子量为80kD，酶作用的最适pH为8.0；用小牛肠黏膜提取的AP分子量为l00kD，最适pH为9.6.一般采用对硝基苯磷酸酯（p-NPP）作为底物。
它可制成片状试剂，使用方便。
产物为黄色的对硝基酚，在405nm有吸收峰。
用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。
2标本的收集新鲜无溶血标本，血清或血浆样本均不溶血。
血浆样本只能采用肝素或EDTA抗凝。
样本在4摄氏度可稳定7天。
采血前病人应禁食12小时，采集静脉3ml,待凝固后（最好放在37摄氏度水浴箱内45分钟）通常为加抗凝剂的血液在30-60分钟凝血析出血清。
3000r/min离心5-10分钟，分离出血清备用。
不建议采用血浆标本。
3：方法原理样本中的碱性磷酸酶催化水解磷酸对硝基苯酚，生成游离的对硝基苯酚和磷酸，引起405nm处的光吸收值升高，，通过检测405nm处光吸收值上升的速率，可以测定碱性磷酸酶的活力。
4剂来源，配置及储存试剂来源：迪瑞试剂配置：试剂一和试剂二均为液体试剂，可直接使用。
启用后在2-8度可稳定30天。
若试剂混浊，或以蒸馏水为空白在405nm处的光吸收值低于0.8A,应予丢弃。
试剂储存：试剂避光储存2-8摄氏度可稳定至标签所示失效期。
5分析仪器CS-600B全自动生化分析仪分析参数：样品量4 u/l 试剂量：第一试剂200 u/l（R1）；第二试剂50 u/l测光点23—38 测定模式：速率法正反应分析波长：405nm/505nm(主波长/副波长)6计算方法ALP(U/L)=( A/min*Tv*1000)(18.8*Sv*P)式中Tv=总反应体积Sv=样本体积18.8=NADH在405nm处的毫摩尔消光系数P=比色杯光径（cm）7 线性范围：本实验的线性范围：0----850U/L8 参考范围：男性：1---12岁《500 U/L12—15岁《750 U/L》25岁40--150 U/L女性：1---12岁《500 U/L》15岁40--150 U/L9 失控控理1：立即重测同一质控品，如重测后结果仍不再允许范围，请进行下一步。
血清碱性磷酸酶磷酸对硝基苯酚法测定
血清碱性磷酸酶（ALP）磷酸对硝基苯酚法测定1.实验原理碱性磷酸酶的活性由在pH值为10.4，2-氨基-2甲基-1-丙醇（AMP）存在的情况下测量p-硝基-磷酸苯酯（pNPP）的转换速率决定。
ALPpNPP + AMP -----------﹥pNP+AMP-PO4在410/480nm测定pNP的生成速率，它与标本中ALP的活性成正比。
2. 标本采集与处理：2.1 病人准备：无特殊要求。
2.2 标本类型：标本最好是无溶血的血清或肝素化的血浆。
2.3 血清分离：应在收集后两小时内分离出来。
避免使用含EDTA或草酸盐的血浆。
3. 标本存放：2～3天内的活性损失：15～25℃保存：<10%；标本稳定性：4～8℃保存稳定7天；-20℃保存至少可稳定2个月标本。
如果分析延迟8小时以上，最好把血清冷藏。
冷冻的血清在融解后会表现出血清值的显著降低。
4. 标本运输：常温条件下运输5. 标本拒收标准：细菌污染的不能做测定。
6. 实验材料：6.1 上海申能ALP测定试剂盒（141 0417170 1 试剂1 6×64 ml ＋试剂2 6×16 ml）6.1.1 试剂组成试剂1：2-氨基-2甲基-1-丙醇（AMP）缓冲液0.90mol/L（pH:10.4）醋酸镁 1.6mmol/L硫酸锌0.4mmol/LHEDTA 2.0mmol/L试剂2：磷酸对硝基酚16.0mmol/L6.1.2 试剂准备：试剂为即用式。
6.1.3 试剂稳定性与贮存：原试剂避光保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。
试剂不可冰冻。
6.1.4 变质指示：当试剂有浊度时，表明有细菌污染，不能继续使用。
6.1.5 注意事项：碱性磷酸酶试剂中含叠氮钠，避免接触皮肤及粘膜。
反应过程中产生的对硝基苯酚有毒性，切勿吸入、吞食、接触皮肤或粘膜。
若反应液与皮肤或粘膜接触，请速用水冲洗。
6.2 校准品：使用DiaSys公司提供的TruCal U校准品对自动分析仪进行校准，具体参见生化检验校准品和质控品.SOP文件。
ALP测定
三、实验用品
半自动生化分析仪
ALP测定试剂盒；
刻度吸管
微量加样器
人血清
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四、实验过程 按 表 加 量
试剂 工作液 蒸馏水 样品 空白管 样品管 1.00mL 1.00 mL 0.02 mL — — 0.02 mL
混匀，在反应温度37°C保温60秒，入=405nm处使用半自动生 化分析仪测定和读取ALP值（U/L） 。 正常参考值 37℃下，20-50岁男性：53-128；60岁以上男性：56-119 20-50岁女性：42-98； 60岁以上女性：53-141
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六、实验注意事项
1.血清标本新鲜，避免溶血；
2.正确操作半自动生化分析仪；
3.注意试剂安全，避免直接接触皮肤和 眼睛，切勿吞咽。
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半自动生化分析仪的使用
目录
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半自动生化分析仪的使用
吸液键 吸液管
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ห้องสมุดไป่ตู้录
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ALP
对硝基苯酚(4-NP)
＋磷酸盐
4-NPP在碱性溶液中为无色，在ALP催化下， 4-NPP水解产生游离的4-NP。 4-NP在碱性溶液中 转变为黄色，在405nm下有最大吸收峰。 4-NP 形成的速率与血清中ALP的活性成正比，测定 405nm处吸光度增加速率（△A/min），即可计 算ALP的活性。
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五、实验结果与分析
1、实验结果 2、实验分析 3、临床意义 正常人血清中ALP主要来自肝脏和骨骼，所 以ALP常作为作为肝胆疾病和骨骼疾病的辅助 诊断指标。 血清ALP活性病理性增高可见于： （1）肝胆疾病 阻塞性黄疸、胆道梗阻等； （2）骨骼疾病 佝偻病、骨质软化病等。 血清ALP活性生理性增高见于妊娠期与儿童 生长发育期。
血清碱性磷酸酶ALP测定
血清碱性磷酸酶ALP测定1 检验目的指导本室工作人员规范操作本检测项目，确保检测结果的准确。
2 实验原理本试剂以国际临床化学会（IFCC）推荐方法为基础，所采用的反应原理与反应式如下。
ALP对-硝基苯磷酸盐 + H2O ----------- 对硝基酚 + 磷酸在上述反应中，对-硝基苯酚的生成速率与样本中碱性磷酸酶的活力成正比。
通过在405 nm处监测吸光度的上升速率，即可测得样本中碱性磷酸酶的活性。
3 标本采集与处理：3.1 病人准备：无特殊要求。
3.2 标本类型：标本最好是无溶血的血清。
3.3 血清分离：应在收集后两小时内分离出来。
避免使用含EDTA或草酸盐的血浆。
3.4 标本存放：2～3天内的活性损失：15～25℃保存：<10%；标本稳定性：4～8℃保存稳定7天；-20℃保存至少可稳定2个月标本。
如果分析延迟8小时以上，最好把血清冷藏。
冷冻的血清在融解后会表现出血清值的显著降低。
3.5 标本运输：常温条件下运输3.6 标本拒收标准：细菌污染的不能做测定。
4 实验材料：4.1 试剂：上海复星长征医学科学有限公司ALP试剂盒（沪食药监械（准）字2014第2400166号 YZB/沪 1546-40-2014）4.1.1 试剂组成试剂1（R1）：乙酸镁3.0mmol/L硫酸锌 1.5mmol/LHEDTA 3.0mmol/LAMP缓冲液420mmol/L试剂2（R2）：对-硝基苯磷酸盐81.5mmol/LAMP缓冲液420mmol/LHEDTA5.0mmol/L4.1.2 试剂准备：试剂为即用式。
4.1.3 试剂稳定性与贮存：在2～8℃避光、密封的储存条件下，试剂（盒）自生产之日起有效期为12个月。
试剂启用后，在2～10℃避光的条件下可稳定14天。
4.1.4 变质指示：当试剂有浊度时，表明有细菌污染，不能继续使用。
4.1.5 注意事项：试剂中含有稳定剂，可能存在一定的刺激作用或毒性，请勿直接接触皮肤、眼睛。
血清中碱性磷酸酶的测定
混匀。37°C水浴保温5min，同时将底物液预热 底物液／ml 1.00 1.00 1.00 1.00
混匀。 37°C水浴保温15min 铁氰化钾溶液／ml 血清／ml 3.00 － 3.00 － 3.00 － 3.00 0.100
计算公式： 计算公式：
ALP的活力＝（ A测定－A 位）
对照）／（A标准－A空白）ห้องสมุดไป่ตู้0.15×100（Kings单
2生成的酚化合物本身在一定的条件下就可显色如磷酸对硝在在ph10ph10的环境中的环境中alpalp催化磷酸二苯钠的水解生成苯酚催化磷酸二苯钠的水解生成苯酚和磷酸氢二钠苯酚与和磷酸氢二钠苯酚与44氨基安替比林反应生成色素原该色氨基安替比林反应生成色素原该色素原经铁氰化钾氧化生成红色醌亚胺衍生物
血清中碱性磷酸 酶活性的测定 磷酸苯二钠法） （磷酸苯二钠法）
实验器材与试剂
• （一）器材 器材
5ml移液管、100ul或微量可调式移液器、721E型分光光度计、1cm比色 皿、37℃恒温水浴锅。
• （二）试剂 试剂
（1）0.1mol/L碳酸缓冲液（pH=10.0)：称取无水碳酸钠6.36g、碳酸氢钠 3.36g、4-氨基安替比林1.5g，溶于800ml蒸馏水中，定容至1L,置于棕色 瓶内储存。 （2）20mmol/L磷酸苯二钠溶液：先将500ml蒸馏水煮沸，迅速加入磷酸苯 二钠2.18g（磷酸苯二钠如含2分子结晶水，应称取2.54g)，冷却后加氯 仿2ml防腐，在4℃冰箱内保存。用剩的溶液不应再倒回瓶中。 （3）铁氰化钾的硼酸溶液：称取铁氰化钾2.5g、硼酸17g，各溶于400ml 蒸馏水中，两液混合后，加蒸馏水至1L，置于棕色瓶内避光保存。如出 现蓝绿色，说明试剂变质，应弃去。 （4）酚标准工作液（0.05mg/ml):购买合格的二级标准品。
碱性磷酸酶测定试剂（ALPAKP）
北京华宇亿康生物工程技术有限公司Co-Health (Beijing )Laboratories Co., Ltd. 液体生化试剂使用说明书_碱性磷酸酶测定试剂（ALP/AKP ） （IFCC ，AMP 缓冲液）【注册产品标准】YZB/国 1959-2003 ◇ 【医疗器械注册证号】京药监械（准）字2005第2400405号本试剂适用于人血清或血浆中碱性磷酸酶活性的体外定量分析。
临床意义碱性磷酸酶存在于体内多种组织和器官，其病理性变化表现在：增加：（1） 肝脏疾病如胆汁淤积和肝硬化；（2） 骨骼疾病如软骨病、佝偻病、成骨肉瘤； （3） 恶性肿瘤。
减少：（1） 停止生长（克汀氏病、软骨发育不全）； （2） 先天性低磷酸酶血症。
方法学原理磷酸对硝基苯酚（4-NPP ）在碱性磷酸酶的作用下，将其磷酸基转移到2-氨基-2-甲基-1-丙醇（AMP ）受体分子上，释放出的对硝基苯酚（4-NP ）在碱性溶液中分子重排形成黄色醌，可在405nm 下检测。
黄色醌形成速率与ALP 活力成正比。
ALP 4 -NPP + H 2O → 4 -NP + 磷酸 Mg 2+, 碱性 试剂组成试剂1（R 1） 试剂2（R 2）AMP 0.35mol/L 4 -NPP 80mmol/L MgCl 2 10.5mmol/L 稳定剂 适量 适用仪器ZYA-1003：适用于日立7060/7150、岛津7200/ 7300/8000全自动生化分析仪；ZYB-1003：适用于日立7170 A /7170、奥林巴斯AU400 /600/1000全自动生化分析；ZYC-1003：适用于日立7020全自动生化分析仪； ZYD-1003：适用于贝克曼CX 系列全自动生化分析仪；ZYE-1003：适用于东芝全自动生化分析仪；TYA-1003、TYB-1003、TYC-1003：适用于其它全自动生化分析仪及各类半自动生化分析仪。
试剂贮存及稳定性试剂自生产日期起2—8℃避光存放可稳定12个月；R 1、R 2按4:1比例混为工作液2—8℃避光可稳定4周。
血清碱性磷酸酶ALP磷酸对硝基苯酚法测定作业指导书
血清碱性磷酸酶ALP磷酸对硝基苯酚法测定作业指导书1.实验原理碱性磷酸酶的活性由在pH值为10.4，2-氨基-2甲基-1-丙醇（AMP）存在的情况下测量p-硝基-磷酸苯酯（pNPP）的转换速率决定。
ALPpNPP + AMP -----------﹥pNP+AMP-PO4在410/480nm测定pNP的生成速率，它与标本中ALP的活性成正比。
2. 标本采集与处理：2.1 病人准备：无特殊要求。
2.2 标本类型：标本最好是无溶血的血清或肝素化的血浆。
2.3 血清分离：应在收集后两小时内分离出来。
避免使用含EDTA或草酸盐的血浆。
3. 标本存放：2～3天内的活性损失：15～25℃保存：<10%；标本稳定性：4～8℃保存稳定7天；-20℃保存至少可稳定2个月标本。
如果分析延迟8小时以上，最好把血清冷藏。
冷冻的血清在融解后会表现出血清值的显著降低。
4. 标本运输：常温条件下运输5. 标本拒收标准：细菌污染的不能做测定。
6. 实验材料：6.1 上海奥林巴斯ALP测定试剂盒试剂1 ＋试剂26.1.1试剂准备：试剂为即用式。
6.1.2 试剂稳定性与贮存：原试剂避光保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。
试剂不可冰冻。
6.1.3 变质指示：当试剂有浊度时，表明有细菌污染，不能继续使用。
6.1.4 注意事项：碱性磷酸酶试剂中含叠氮钠，避免接触皮肤及粘膜。
反应过程中产生的对硝基苯酚有毒性，切勿吸入、吞食、接触皮肤或粘膜。
若反应液与皮肤或粘膜接触，请速用水冲洗。
6.2 校准品：使用奥林巴斯公司提供的校准品对自动分析仪进行校准，具体参见生化检验校准品和质控品.SOP文件。
6.3 质控品：参见生化检验校准品和质控品.SOP文件。
7. 仪器：奥林巴斯AU2700生化分析仪8. 操作步骤8.1 项目基本参数：参见生化检验奥林巴斯AU2700生化分析仪项目测定参数.SOP文件8.2 仪器操作步骤：参见生化检验奥林巴斯AU2700生化分析仪操作规程.SOP文件9. 检验结果的判断与分析10. 质量控制：在每一批标本中都应把非定值血清水平I与II质控做为未知标本进行分析，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控。
血清碱性磷酸酶(ALP)—生化检测项目
血清碱性磷酸酶（ALP）
一、检测原理
ALP水解磷酸对硝基苯酯（PNPP）形成硝基苯酚，硝基苯酚吸光度与ALP的活性成正比，加入2-氨基-2-甲基-1-丙醇（AMP）缓冲液维持反应的PH值10.3—10.4，AMP中镁离子及锌离子起激活、维持酶反应。
二、参考区间
血清：男性46—125U/L 女性35—135U/L
三、临床意义
1、各种肝内外胆管阻塞性疾病如胰头癌、胆道结石引起的胆管阻塞，原发性胆汁性肝硬化，肝内胆汁淤积等，碱性磷酸酶明显升高，并且与血清胆红素升高相平行。
2、用于鉴别黄疸的鉴别诊断，碱性磷酸酶转氨酶血清胆红素同时测定有助于黄疸的鉴别诊断。
3、骨骼疾病，纤维性骨炎，佝偻病，骨软化症，成骨细胞瘤及骨折愈合期，碱性磷酸酶升高，主要用于变形性骨炎，
原发性甲旁亢，骨质软化和佝偻病的诊断。
4、生长中的儿童，妊娠中晚期碱性磷酸酶生理性增高。
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血清碱性磷酸酶ALP磷酸对硝基苯酚法测定
1.实验原理
碱性磷酸酶的活性由在pH值为10.4，2-氨基-2甲基-1-丙醇（AMP）存在的情况下测量p-硝基-磷酸苯酯（pNPP）的转换速率决定。
ALP
pNPP + AMP -----------﹥pNP+AMP-PO4在410/480nm测定pNP的生成速率，它与标本中ALP 的活性成正比。
2. 标本采集与处理：
2.1 病人准备：无特殊要求。
2.2 标本类型：标本最好是无溶血的血清或肝素化的血浆。
2.3 血清分离：应在收集后两小时内分离出来。
避免使用含EDTA或草酸盐的血浆。
3. 标本存放：2～3天内的活性损失：15～25℃保存：<10%；标本稳定性：4～8℃保存稳定7天；-20℃保存至
少可稳定2个月标本。
如果分析延迟8小时以上，最好把血清冷藏。
冷冻的血清在融解后会表现出血清值的显著降低。
4. 标本运输：常温条件下运输
5. 标本拒收标准：细菌污染的不能做测定。
6. 实验材料：
6.1 上海奥林巴斯ALP测定试剂盒试剂1 ＋试剂2
6.1.1试剂准备：试剂为即用式。
6.1.2 试剂稳定性与贮存：原试剂避光保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。
试剂不可冰冻。
6.1.3 变质指示：当试剂有浊度时，表明有细菌污染，不能继续使用。
6.1.4 注意事项：碱性磷酸酶试剂中含叠氮钠，避免接触皮肤及粘膜。
反应过程中产生的对硝基苯酚有毒性，切勿吸入、吞食、接触皮肤或粘膜。
若反应液与皮肤或粘膜接触，请速用水冲洗。
6.2 校准品：使用奥林巴斯公司提供的校准品对自动分
析仪进行校准，具体参见生化检验校准品和质控品.SOP 文件。
6.3 质控品：参见生化检验校准品和质控品.SOP文件。
7. 仪器：奥林巴斯AU2700生化分析仪
8. 操作步骤
8.1 项目基本参数：参见生化检验奥林巴斯AU2700生化分析仪项目测定参数.SOP文件
8.2 仪器操作步骤：参见生化检验奥林巴斯AU2700生化分析仪操作规程.SOP文件
9. 检验结果的判断与分析
10. 质量控制：在每一批标本中都应把非定值血清水平I 与II质控做为未知标本进行分析，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控。
质控规则参见生化室室内质控操作规程.SOP文件。
11. 计算方法：以TruCal U复合校准品ALP校准值校准仪器后，在病人结果可报告范围内，仪器直接报告可靠的检测结果。
不使用校准品进行ALP活力检测，可以直接使用
ΔA/min均值乘以计算因子得到结果，但是这样所得结果的可靠性不如使用校准品。
计算ALP活力的计算因子见下：
ΔA/min×因子= ALP活力[U/L]
底物起始的反应（37℃）样品起始的反应（37℃）
05 nm 3433 2757
12. 参考值范围
成年人[4]
男性20～50岁53～128U/L
男性60岁以上56～119U/L
女性20～50岁42～98U/L
女性60岁以上53～141U/L
儿童[5]
男性女性
1～30天75～319U/L 48～406U/L
1个月～1岁82～383U/L 124～341U/L
1岁～3岁104～345U/L 108～317U/L
4岁～6岁93～309U/L 96～297U/L
7岁～9岁86～315U/L 69～325U/L
10岁～12岁42～362U/L 51～332U/L
13岁～15岁74～390U/L 50～162U/L
16岁～18岁52～171U/L 47～119U/L
参考值因性别、年龄、饮食和地域的不同而有所差别。
根据好的实验室经验，每个实验室应建立自己的参考值。
13. 临床意义[1,2]：碱性磷酸酶（ALP）是一种在碱性条件下具有较强活性的水解酶，并以多种形态存在于血液中，其大多来自骨骼的成骨细胞和肝脏，也来源于其他一些组织例如肾脏、胎盘、肠、睾丸、胸腺、肺及肿瘤。
在儿童生长期和妊娠期，血清中ALP生理性活性增高，骨疾病与肝胆疾病等引起ALP病理性活性增高。
在肝胆疾病中引起ALP活性增高的原因包括胆道梗阻，例如因胆结石、肿瘤或炎症造成的胆汁郁积。
在传染性肝炎中也可发现ALP活性增高。
在骨疾病中，Paget病、骨软化症（佝偻病）、骨转移瘤和甲状旁腺功能亢进等，使成骨
活性升高引起ALP活力增高。
14. 操作性能
14.1 线性范围2～850U/L
14.2 精密度：精密度的评估是根据NCCLS推荐的典型方法5，AU2700批内不精密度小于5%，总不精密度小于10%。
用于分析的质控血清和数据处理符合以上的NCCLS的规则7。
批内精密
度
n=20
x
(U/L)
s
(U/L)
CV
(%)
批间精密
度
n=20
x
(U/L)
s
(U/L)
CV
(%)
样品1 97.8 1.15 1.18 样品1 103 1.06 1.02 样品2189 1.82 0.96 样品2188 1.04 0.55 样品3235 1.68 0.72 样品3236 1.64 0.70
14.3 方法学比较：本公司试剂盒(y)与某商品化试剂盒
(x)，同时对78个样品进行ALP活力检测，将检测结果
作方法学比较，其统计结果如下：y=1.00x+0.00U/L；r
=0.999。
14.4 灵敏度：本试剂的检测限为2U/L。
14.5 病人结果可报告范围：2～850U/L
15. 超出范围结果处理：本法对ALP活力检测的最大ΔA/min在405nm为0.25。
当样品测定值超过上限时，应将样品用9 g/L氯化钠溶液作1+9稀释，重新测定，结果乘以10。
16. 病危报警值的处理
17. 方法局限性
17.1 本法对ALP活力检测的最大ΔA/min在405nm为0.25。
当样品测定值超过上限时，应将样品用9g/L氯化钠溶液作1+9稀释，重新测定，结果乘以10。
17.2 干扰物质：当样品中抗坏血酸浓度≤1704μmol/L，胆红素浓度≤684μmol/L，血红蛋白浓度≤2.00g/L，甘油三酯浓度≤22.6mmol/L时没有观察到干扰
18. 补救措施：当仪器发生故障时，迅速联系仪器厂家进行维修。
19. 参考文献
1.Thomas L. Clinical Laboratory Diagnostics. 1st ed. Frankfurt：TH-Books Verlagsgesellschaft; 1998. p. 36-46.
2.Moss DW, Henderson AR. Clinical enzymology. In：Burtis CA, Ashwood ER. editors. Tietz textbook of clinical chemistry. 3rd ed. Philadelphia：W. B. Saunders Company; 1999. p.617-721.
3.Tietz NW, Rinker D, Shaw LM. IFCC method for alkaline phosphatase. J Clin Chem Clin Biochem 1983; 21：731-48.
4.Burtis CA, Ashwood ER. editors. Tietz textbook of clinical chemistry. 3rd ed. Philadelphia：W. B. Saunders Company; 1999. p. 1829.
5. Soldin JS, Hicks JM. Pediatric reference ranges. Washington：AACC Press, 199
6. p. 5.
20. 其他：仪器测定后的废液及难降解的材料集中收集后按《检验科废物处置管理规定》执行。