C2C12细胞的生长特性
lncRNAGPRC5D-AS1对地塞米松诱导的小鼠C2C12细胞肌萎缩及铁死亡相关蛋白的影响演示稿
地塞米松诱导的小鼠C2C12细胞肌萎缩模型
地塞米松能够抑制小鼠C2C12细胞的增殖，导致细胞数量减少。
抑制细胞增殖
诱导细胞凋亡
改变细胞形态
地塞米松可以诱导C2C12细胞发生凋亡，导致细胞死亡。
地塞米松处理后的C2C12细胞形态变小，呈现出肌萎缩的特征。
03
02
01
肌萎缩时，肌肉组织中的蛋白质合成减少，导致肌肉质量下降。
lncRNA GPRC5D-AS1对铁死亡相关蛋白的影响：研究进一步发现，lncRNA GPRC5D-AS1能够调控铁死亡相关蛋白的表达。在地塞米松诱导的肌萎缩过程中，lncRNA GPRC5D-AS1可能通过调节铁死亡相关蛋白的表达，影响细胞的生存状态。
lncRNA GPRC5D-AS1的作用机制：研究揭示了lncRNA GPRC5D-AS1可能通过与某些关键基因的相互作用，影响其表达，进而影响肌萎缩和铁死亡相关蛋白的表达。这为理解肌萎缩和铁死亡的分子机制提供了新的视角。
详细描述
VS
lncRNAGPRC5D-AS1可能通过改变细胞形态，影响地塞米松诱导的小鼠C2C12细胞肌萎缩过程。
详细描述
在肌萎缩过程中，lncRNAGPRC5D-AS1可能通过调控细胞骨架蛋白、细胞膜蛋白等，改变细胞形态，使其呈现肌萎缩的特征性变化，如细胞体积减小、细胞核变小等。
总结词
05
lncRNAGPRC5D-AS1对地塞米松诱导的小鼠C2C12细胞铁死亡相关蛋白的影响
铁死亡相关蛋白是一类在细胞铁死亡过程中发挥重要作用的蛋白质，它们参与了细胞内氧化应激反应、脂质代谢和细胞凋亡等过程。
这些蛋白通过调节细胞内铁离子的平衡、活性氧簇的产生以及脂质过氧化的程度等，影响细胞的生存和死亡。
C2C12成肌细胞体外诱导分化为肌管的实验
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ ： 【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｃ２Ｃ１２ ｍｙｏｂｌａｓｔｓ ｉｎｔｏ ｍａｔｕｒｅ ｍｙｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｏｔｕｂｅｓ， ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｍｙｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．【Ｍｅｔｈｏｄｓ】Ｔｈｅ Ｃ２Ｃ１２ ｍｙｏｂｌａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＭＥＭ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ｖａｒｉｏｕｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ， ｔｈｅｎ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ａｎｄ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｅａｒａｎｃｅ， ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｍｕｓｃｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ＲＴ－ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．【Ｒｅｓｕｌｔｓ】（ １） Ｂｏｔｈ ２０ ｍＬ ／Ｌ ａｎｄ ５０ ｍＬ ／Ｌ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｍｙｏｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ２Ｃ１２ ｍｙｏｂｌａｓｔｓ， ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ２０ ｍＬ ／Ｌ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｈａｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ （ ｏｎ ｄａｙ ７， ｔｈｅ ｒａｔｉｏｓ ｏｆ ｍｙｏｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｂｏｔｈ ｇｒｏｕｐｓ ａｒｅ ３１．４％ ±２．１％ ａｎｄ １９．０％ ±１．６％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， Ｐ ＜ ０．０００１） ． （ ２） Ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ２０ ｍＬ ／Ｌ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｆｏｒ ３－ ４ ｄａｙｓ， ｍｙｏｔｕｂｅｓ ｓｔａｒｔｅｄ ｔｏ ｆｏｒｍ． Ｌａｔｅｒ ｏｎ， ｍｏｒｅ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｍｙｏｔｕｂｅｓ ａｐｐｅａｒ， ａｎｄ ａｔ ｔｈｅ ｐｅａｋ ｏｎ ８－ ９ ｄａｙｓ （ ｄａｙ９， ｔｈｅ ｍｙｏｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｗａｓ ４０．２％ ±１．３％ ） ． Ａｆｔｅｒ ｔｈａｔ， ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ｇｏｔ ｓｅｎｉｌｅ ａｎｄ ｅｎｄ ｉｎ
KLF4过表达对RAW264.7巨噬细胞和C2C12肌原细胞增殖的影响
Ｃ２ ２ ｌ Ｃ１Ｃｅｌ ｓ
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维普资讯
第 １ １卷 第 ３期
２０ ０ ７年 ９月
生命 科 学 研 究
Ｌ ｆ ｉｎｃ ｓ ａ ｃ ｉｅ Ｓｃｅ ｅ Ｒｅ ｅ ｒ ｈ
Ｖ １ ｌ Ｎｏ３ ｏ． １ ．
Ｓ ｐ．２ ｅ ００７
ＫＬ ４过 表 达 对 Ｒ Ｆ ＡＷ ２ ４７巨噬 细 胞 和 Ｃ Ｃｌ肌 原 ６． ２２ 细胞增殖 的影 响
Ａｂｔａｔ ：ｏｉｖ ｓ ｇｔ ｔｅｅ ｅ ｔ ｆ ｖｒ ｘ ｒｓｉｎｏ ｒｐ ｅ ｌ ｅｆｃｏ （ Ｌ ４ ｏ ｅｐｏ ｆｒｔ ｎ ｓｒ ｃ Ｔ ｅｔ ａｅ ｈ ｆ ｃ ｏ ｅ— ｐｅｓ ｆ ｔ ｐ ｌ ｉ ｔ ４ Ｋ Ｆ ） ｎｔ ｒｌｅａｉ ｎ ｉ ｆ ｏ ｅ ｏ Ｋ ｉ —ｋ ａ ｒ ｈ ｉ ｏ
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壳聚糖水凝胶的研制及其与C2C12细胞粘附、支持作用的实验研究
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结构 ， 通过 Ｃ Ｃ２ ２ １ 细胞在其表面上的粘附与生长情况 ， 判定该材料是否具有 良好的细胞相容性。结果表明：
该材料 具有 温度 敏 感性 ， 室温 下为液 态 ，７ 即 ３ ℃变为 固态。 当壳聚 糖溶 液 浓度 为 ２ ％时 ， 加入 ４ ％ｊ ５ ３ 一甘 油磷
酸钠 溶液后 的成 胶作 用 时 间最短 ， 约为 １ ｉ。Ｃ Ｃ ２细胞在 壳聚糖 水凝胶 材 料 上 的粘 附与 生长 情 况 良好 。 ５Байду номын сангаас ｎ ２ １
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cxcl12分子量
cxcl12分子量全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：CXCL12分子量是多少?CXCL12是指半胱氨酸-半胱氨酸间隙接头蛋白趋化因子12，也被称为糖皮质激素亲和素，其分子量约为8.3kDa。
CXCL12是一种重要的趋化因子，对造血干细胞、淋巴细胞、单核细胞等免疫细胞具有极强的趋化作用，能够引导这些细胞定向迁移。
CXCL12通过结合其受体CXCR4，在免疫细胞的趋化活动中发挥着重要作用。
CXCL12在机体中具有多种重要的生理功能。
他是造血干细胞开发及迁移的重要刺激因子，可以引导干细胞在骨髓中的定向迁移，维持机体的正常造血功能。
CXCL12在淋巴器官和外周淋巴细胞聚集中也发挥着重要作用，可以调节免疫细胞的迁移和聚集，促进机体对外界病原微生物的免疫应答。
CXCL12还在神经系统的发育和修复中发挥作用，能够引导神经前体细胞在中枢神经系统中的迁移和定位。
CXCL12通过结合其受体CXCR4在细胞膜表面发挥生物学功能。
当CXCL12与CXCR4结合时，可以激活细胞内信号转导通路，导致细胞的趋化、增殖、存活和分化等生物学活性。
CXCL12还通过结合另一种受体CCR7，在淋巴细胞的迁移和定位中发挥作用，参与机体的免疫应答。
CXCL12的生物学功能十分多样，对于维持机体的正常功能具有不可或缺的作用。
因其在疾病中的作用，CXCL12及其受体已成为药物研发的热点。
利用CXCL12/CXCR4信号通路的特异性干扰剂或激动剂，可以用于白血病、淋巴瘤、艾滋病、肿瘤等疾病的治疗。
CXCL12及其受体还被作为肿瘤的标志物，用于肿瘤的早期诊断和治疗监测。
虽然CXCL12的分子量较小，但其在机体中的生理功能十分重要，对于疾病的治疗和预防具有重要意义。
CXCL12是一种重要的趋化因子，在免疫细胞的趋化、白血细胞的迁移、神经细胞的发育等生理过程中发挥着重要作用。
通过结合其受体CXCR4及CCR7，能够调控细胞的生物学行为，对于机体的正常功能维持和疾病的治疗具有重要意义。
同源异型框蛋白Msx1的两个新的磷酸化位点的鉴定
同源异型框蛋白Msx1的两个新的磷酸化位点的鉴定程庆灵;王敬强【摘要】Some phosphorylated sites in the homolog Msx2 of the homeoprotein Msx1 has been identified,which plays a crucial biological role. However,the phosphorylated sites in Msx1 are not known yet,thus in order to examine the Msx1 phosphorylated status, we applied bioinformatics analysis to predict phosphorylation sites in Msx1,further used immunoprecipitation and mass spectrometry to experimentally verify the phosphorylation sites in Msx1. Tryptic digests of Msx1 protein complexes purified from C2C12 cells were separated and analyzed by nLC-MS-MS. Two novel phosphorylation sites(Ser152 and Ser160)were identified,moreover,these two sites were highly conserved in mouse and human. Furthermore,the specifically-phosphorylated antibody was prepared targeting these two phosphorylation sites.%同源异型框蛋白Msx1的同系物Msx2中已鉴定出磷酸化修饰位点，并且发挥着重要的生物学功能。
基于C2C12_细胞的2,7-二溴咔唑肌发育毒性效应
生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第18卷第4期2023年8月V ol.18,No.4Aug.2023㊀㊀基金项目:国家自然科学基金面上项目(21976201);国家自然科学基金重点项目(21836004);国家重点研发计划项目(2018YFA0901100)㊀㊀第一作者:郝迪(1998 ),女,硕士研究生,研究方向为分子环境毒理学,E -mail:********************㊀㊀*通信作者(Corresponding author ),E -mail:**************.cnDOI:10.7524/AJE.1673-5897.20230411001郝迪,谢群慧,杨广磊,等.基于C2C12细胞的2,7-二溴咔唑肌发育毒性效应[J].生态毒理学报,2023,18(4):293-303Hao D,Xie Q H,Yang G L,et al.Toxicity of 2,7-dibromo -9H -carbazole on myogenesis based on C2C12cells [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2023,18(4):293-303(in Chinese)基于C2C12细胞的2,7-二溴咔唑肌发育毒性效应郝迪1,2,3,谢群慧1,*,杨广磊1,陈旸升1,李云平4,夏英杰5,徐丽1,赵斌1,2,3,41.中国科学院生态环境研究中心,环境化学与生态毒理学国家重点实验室,北京1000852.中国科学院大学中丹学院,北京1001903.中国科学院大学,北京1000494.国科大杭州高等研究院环境学院,杭州3100245.香港科技大学生命科学学院,香港999077收稿日期:2023-04-11㊀㊀录用日期:2023-05-22摘要:肌肉有执行机体运动和能量代谢的重要作用㊂据报道二噁英暴露可严重影响肌肉发育㊂但目前与多氯代二苯并呋喃(polychlorinated dibenzofurans,PCDFs)结构相似的卤代咔唑(polyhalogenated carbazoles,PHCZs)的肌肉发育毒性尚不明确㊂本研究旨在探究2,7-二溴咔唑(2,7-dibromo -9H -carbazole,27-BCZ)的肌肉发育毒性效应㊂应用C2C12细胞成肌分化模型,在细胞水平上通过苏木素-伊红染色法检测融合指数和单条肌管内细胞核数2个指标评价细胞形态的变化,在分子水平上通过qRT -PCR 来测定肌细胞分化调节分子和分化标志物的基因表达,探究27-BCZ 对肌发育的影响及其分子机制㊂细胞水平实验结果显示,与对照组相比,27-BCZ 10-7mol ㊃L -1暴露3d 后,肌管数量减少㊁形态变细变短,且分布杂乱;单条肌管内细胞核数减少㊁参与肌管融合的细胞核比例(融合指数)降低;27-BCZ 10-9~10-7mol ㊃L -1暴露6d 后,虽然单条肌管内细胞核数没有显著变化,但融合指数显著降低㊂分子水平实验结果显示,27-BCZ 10-7mol ㊃L -1在分化末期对肌纤维结构蛋白肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)的2个编码基因Myh3和Myh4的表达具有显著抑制作用㊂另外,27-BCZ 还影响肌生成调节因子家族(myogenic regulatory factors,MRFs)基因的表达,包括显著抑制分化早期调节因子MyoD 和末期调节因子Mrf4的mRNA 表达,显著促进Myogenin mRNA 表达㊂此外,27-BCZ 暴露能显著促进芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)信号通路下游基因cyp1a1和cyp1b1的mRNA 表达,提示27-BCZ 在肌分化模型中具有类二噁英活性㊂总结上述结果,我们发现,在肌生成过程中,27-BCZ 表现出与二噁英类似的AhR 活性和肌发育干扰效应,为27-BCZ 肌肉发育相关健康效应和AhR 相关毒理机制研究提供了基础数据㊂关键词:2,7-二溴咔唑;C2C12小鼠成肌细胞;肌肉发育毒性;肌生成调节因子家族文章编号:1673-5897(2023)4-293-11㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:AToxicity of 2,7-dibromo-9H-carbazole on Myogenesis Based on C2C12CellsHao Di 1,2,3,Xie Qunhui 1,*,Yang Guanglei 1,Chen Yangsheng 1,Li Yunping 4,Xia Yingjie 5,Xu Li 1,Zhao Bin 1,2,3,41.State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology,Research Center for Eco -Environmental Sciences,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100085,China2.Sino -Danish College,University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,China3.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China294㊀生态毒理学报第18卷4.College of Environment,Hangzhou Institute for Advanced Study,Hangzhou310024,China5.Division of Life Science,The Hong Kong University of Science and Technology,Hong Kong999077,ChinaReceived11April2023㊀㊀accepted22May2023Abstract:Muscles play an important role in executing body movements and energy metabolism.It has been repor-ted that exposure to dioxins can affect muscle development seriously.However,the muscle developmental toxicity of polyhalogenated carbazoles(PHCZs),which are structurally similar to polychlorinated dibenzofurans,is currently unclear.This study aimed to investigate the muscular developmental toxicity of2,7-dibromo-9H-carbazole(27-BCZ).We applied the C2C12cell myogenic differentiation model and evaluated the changes in cell morphology by using hematoxylin eosin staining.Fusion index and the number of nuclei in a single muscle tube was used as main parameters for monitoring the myotube formation.At the molecular level,we used qRT-PCR to determine the gene expression of muscle cell differentiation regulatory molecules and differentiation markers,and explore the effects and molecular mechanisms of27-BCZ on muscle development.The results at cell level showed that after3days of exposure to27-BCZ at10-7mol㊃L-1,the myotubes formed were fewer,thinner,shorter and less organized than those of control group.The number of nuclei in the myotube and the fusion index were decreased.After6days of exposure to27-BCZ at10-9~10-7mol㊃L-1,although there was no significant change in the number of nuclei in the myotubes,the fusion index was significantly decreased.Moreover,27-BCZ at10-7mol㊃L-1significantly inhibi-ted the expression of Myh3and Myh4,two encoding genes of myosin heavy chain(MyHC),at the end stage of differentiation.Furthermore,27-BCZ disturbed the expression of myogenic regulatory factors(MRFs),which play important roles in regulating the process of muscle differentiation.We found significantly down-regulation of the mRNA expression of the early differentiation MRF MyoD and the late differentiation MRF Mrf4,while promoting the expression of Myogenin.In addition,we found that27-BCZ treatment can significantly induce the expression of cyp1a1and cyp1b1,two classical downstream genes of aryl hydrocarbon receptor(AhR).These results indicate that27-BCZ may have dioxin-like AhR activity during muscle differentiation.In summary,we found that27-BCZ exhibited AhR activity and myogenesis interference effects similar to dioxins in C2C12cells,providing fundamen-tal data for further studies of27-BCZ on muscle development-related health effects and AhR-related toxicological mechanisms.Keywords:2,7-dibromo-9H-carbazole;C2C12cells;muscular developmental toxicity;myogenic regulatory factors (MRFs)㊀㊀污染物的毒性表现在许多方面㊂近年来,越来越多的研究发现,肌肉是污染物运动神经系统毒性的重要靶点[1]㊂了解污染物影响肌发生过程的毒理机制在评估污染物的潜在毒理风险和人类避免污染物伤害方面有重要意义㊂由于二噁英暴露可造成唇腭裂畸形,其肌肉发育毒性逐渐受到关注[2-3]㊂细胞学实验发现,10-10mol㊃L-1的2,3,7,8-四氯二苯并-对-二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)处理可通过干扰融合过程和抑制肌管结构蛋白表达来抑制C2C12细胞的肌管形成[4]㊂但对具有一定类二噁英毒性的卤代咔唑(polyhalogenated carbazoles, PHCZs)的肌发育毒性研究还十分有限㊂2,7-二溴咔唑(2,7-dibromo-9H-carbazole,27-BCZ)是近年来检出频次较高一种卤代咔唑(polyhalogenated carbazoles, PHCZs)[5-6],其在土壤中的半衰期为120d,在环境中具有累积性[7]㊂目前,27-BCZ的部分毒理学效应已被阐明,包括胚胎发育毒性[8]㊁心脏毒性[9]㊁内分泌干扰毒性[10]等㊂有研究采用野生型斑马鱼胚胎探究了多种PHCZs的急性毒性,发现其中只有27-BCZ 表现出强毒性,可能会对胚胎早期发育构成重大风险[11],因此,27-BCZ的环境健康风险值得关注㊂另有研究发现,27-BCZ具有心脏致畸效应,转录组学分析发现暴露于27-BCZ的斑马鱼有90个基因表达改变,且许多通路与芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)的激活有关[11]㊂Fang等[9]发现在0.03 mmol㊃L-127-BCZ暴露后,斑马鱼胚胎开始显示严第4期郝迪等:基于C2C12细胞的2,7-二溴咔唑肌发育毒性效应295㊀重的心脏畸形,且微摩尔数量级的PHCZs浓度暴露即可诱导心脏细胞色素P450酶1A1(cytochrome P4501A1,cyp1a1)基因表达和蛋白合成,推测27-BCZ可能具有类二噁英的毒性效应㊂以上研究表明,27-BCZ暴露可能影响生物体正常发育,其毒性效应可能与其类似二噁英的化学结构以及AhR 信号通路有关,因此27-BCZ的健康风险值得我们关注㊂肌肉发育过程的调控机制严格而复杂,受到多种调控因素和多种信号的共同作用[12]㊂本文首先从细胞层面探究27-BCZ是否对肌源性分化有TCDD 样的干扰作用;并进一步从分子层面探究27-BCZ 在分化过程中对发育效应分子Myh3和Myh4表达及分化调控分子肌生成调节因子家族(myogenic regulatory factors,MRFs)的影响,旨在明确新型污染物27-BCZ的肌肉发育毒性效应,并为PHCZs类污染物的风险评估提供理论依据㊂1㊀材料与方法(Materials and methods)1.1㊀材料和仪器小鼠成肌细胞C2C12购于北京协和细胞资源中心㊂27-BCZ(CAS:136630-39-2)购自Wellington Laboratory公司(加拿大)㊂二甲基亚砜(dimethyl sul-foxide,DMSO)购自Sigma公司(美国)㊂磷酸缓冲液(PBS)㊁Cell Counting Kit-8(CCK-8)㊁H&E染色试剂盒购自Solarbio公司(中国)㊂青霉素/链霉素(P/S)㊁胰蛋白酶㊁Dulbecco s Modified Eagles(DMEM)培养基㊁马血清(HS)购自Gibco公司(美国)㊂胎牛血清(FBS)购自Biological Industries公司(美国)㊂Gene-JET®RNA Purification Kit㊁RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购自Thermo Fisher Scientific公司(美国);GoTaq®qPCR Master Mix Kit购自Pro-mega公司(美国)㊂以上试剂均为分析纯㊂细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific,Thermo 311,美国);光学显微镜(中国上海光学仪器厂,OLYMPUS CKX41,日本);显微镜照相机(Can-on,DS12631,日本);超净工作台(上海力康,HFsafe-1200,中国);超微量分光光度计(Thermo,Nanodrop 2000,美国);普通PCR仪(BIO-RAD,BIO-RAD T100TM Thermal Cycler,美国);滤光片型多功能酶标仪(Tecan,Infinite F200Pro,瑞士);实时荧光定量PCR仪(Thermo Fisher Scientific,Roche Light Cycle 480,美国)㊂1.2㊀方法1.2.1㊀细胞培养本实验基于小鼠成肌细胞C2C12,采用逐级血清饥饿法,诱导C2C12细胞融合分化成梭形肌管,构建肌肉分化发育模型[4]㊂C2C12细胞采用含20% FBS和1%P/S的DMEM培养基(Growth Medium, GM)进行培养㊂细胞正常传代3代以上,观察到梭形的细胞均匀贴壁生长,无大面积成团且生长速度稳定,此时将细胞接种到6孔板中准备诱导分化,细胞密度为105个㊃mL-1,每孔2mL培养基㊂当细胞在GM中生长到密度为80%左右时,更换为含10% FBS和1%P/S的DMEM培养基,以控制细胞的增殖速度,使细胞充分融合,防止因增长过快导致细胞成团贴壁生长从而影响分化㊂当细胞达到完全融合状态时,改用含2%HS和1%P/S的DMEM培养基(Differentiation Medium,DM)进行诱导分化[13]㊂培养条件为37ħ㊁5%CO2㊂之后每天换液,在DM 中生长到第2天时应观察到细胞更紧密整齐地规则排列,并且有已经融合的较短的梭形肌管出现;在第3天时应明显观察到大部分肌管发生融合,此时肌管生长旺盛;到第6天时大多数细胞分化为成熟的梭形肌管,肌管形成基本完毕㊂本研究选择分化过程3个有代表性的时间节点:第1天(day1),代表分化前期(尚未开始分化,绝大部分细胞为单核圆形);第3天(day3),代表分化中期(大部分单核细胞融合成多核的梭形肌管);第6天(day6),代表分化末期(肌管成熟)进行实验研究㊂1.2.2㊀化合物暴露本实验所用27-BCZ以DMSO为溶剂,母液浓度为10-4mol㊃L-1㊂CCK-8测增殖毒性实验中27-BCZ处理浓度为10-14~10-7mol㊃L-1,以DMSO (0.1%)为溶剂对照,从分化第0天(day0)开始连续27-BCZ处理,测定处理24㊁48㊁144h后的细胞活力㊂在形态学实验和基因表达测定中,采用4种27-BCZ处理浓度,分别为10-10㊁10-9㊁10-8㊁10-7mol㊃L-1,从分化day0开始持续处理细胞,收集分化day1㊁day3㊁day6的细胞进行后续实验㊂1.2.3㊀CCK-8法测定细胞毒性效应参考CCK-8试剂盒说明书测定27-BCZ对细胞增殖的影响㊂细胞按照每孔104个的密度接种在96孔板中,37ħ培养24h后去除原培养基进行化合物暴露㊂27-BCZ的浓度为10-14~10-7mol㊃L-1,每组6个平行复孔㊂分别暴露24h(day1)㊁48h(day2)㊁296㊀生态毒理学报第18卷144h(day6)后,每孔加入10μL CCK -8试剂,在培养箱中孵育1~4h ,使用酶标仪(Infinite F200Pro ,Te -can)测定在450nm 波长下的吸光度㊂细胞活力计算公式为:细胞存活率=(A 处理组-A 空白对照)/(A 阴性对照-A 空白对照)式中:处理组指溶剂对照组和27-BCZ 处理组;空白对照指培养基(DM)对照;阴性对照指不加任何化合物下正常生长的细胞㊂1.2.4㊀细胞苏木素-伊红染色(Hematoxylin -Eosin staining ,H&E 染色)㊀㊀本研究采用H&E 染色对分化的细胞进行形态学分析㊂C2C12细胞以每孔106个细胞的密度接种于6孔板后,取分化day1㊁day3和day6的细胞进行H&E 染色㊂具体步骤参考试剂盒说明㊂染色结束后显微镜下观察并拍照:6孔板中每个孔随机取3个视野进行拍照记录,结果使用ImageJ 1.51k 软件(Media Cybernetics,USA)进行分析,记录每条肌管内细胞核数㊁视野内细胞核总数㊂本研究使用2个评价指标来评估肌发育过程:细胞融合指数和单条肌管内细胞核数㊂细胞融合指数为融合进肌管内的细胞核总数比视野内总细胞核数的比值,反映了C2C12参与分化的效率㊂单条肌管内细胞核数为每个处理组中,每条肌管内的细胞核的数量,反映了肌管成熟的程度㊂单条肌管内细胞核数越多,代表该条肌管发育越成熟㊂使用小提琴图来呈现单条肌管内细胞核数的分布情况,以此评估分化效果㊂小提琴图中,对应Y 轴的范围表示肌管内细胞核数量的分布的范围,每个小提琴最宽处对应的Y 轴值代表该处理组中绝大多数肌管内细胞核数目㊂1.2.5㊀实时荧光定量PCR(qRT -PCR)法检测基因表达水平㊀㊀C2C12细胞接种于6孔板中,接种密度为每孔106个㊂收集诱导分化day1㊁day3和day6的细胞㊂吸去培养基,1ˑPBS 冲洗2遍㊂使用GeneJET ®RNA 纯化试剂盒(Thermo)提取细胞总RNA ㊂利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo)将RNA 逆转录为cDNA ㊂然后,使用QuantStudi -on TM 6Flex 实时PCR 系统(Thermo)以及GoTaq ®qPCR Master Mix (Promega,Madison,WI,USA)进行实时荧光定量PCR 检测㊂所选基因包括MyoD ㊁Myogenin ㊁Mrf4㊁Myh3㊁Myh4㊁cyp1a1㊁cyp1b1㊁甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh )㊂引物由Primer Premier 6(Premier,Biosoft)设计(序列见表1),由生工生物技术(上海,中国)合成㊂所有样本均进行3次独立重复实验,并采用2-ΔΔC T 方法[14]分析mRNA 表达水平㊂表1 引物序列Table 1㊀Primer sequences used in qRT -PCR study基因Gene基因ID Gene ID 特异性引物序列(5 ~3 )Specific primer sequence (5 ~3 )目的片段长度/bp Destination fragment length/bpMyoD17927(F)AGCACTACAGTGGCGACTCA (R)GCTCCACTATGCTGGACAGG 201Myogenin 17928(F)AGGCTGGGTGTGCATGTGA (R)TTAAAAGCCCCCTGCTACAGAAG 70Mrf417878(F)GCTAAGGAAGGAGGAGCAAA (R)GAAGAAAGGCGCTGAAGACT 62Myh317883(F)AAGGCCAAAAAGGCCATC (R)TCTTCTGCTCCCCTTCCA 235Myh417884(F)TTGAAAAGACGAAGCAGCGAC (R)AGAGAGCGGGACTCCTCCTG 190cyp1a113076(F)GACCCTTACAAGTATTTGGTCGT (R)GGTATCCAGAGCCAGTAACCT 145cyp1b113078(F)TCCTCTTTACCAGATACCCGGAT (R)AAAAGCTGGAGAATCGCATT 153gapdh 14433(F)AGCTCACTGGCATGGCCTTC (R)ACGCCTGCTTCACCACCTTC117第4期郝迪等:基于C2C12细胞的2,7-二溴咔唑肌发育毒性效应297㊀1.2.6㊀数据统计分析数据统计和分析使用GraphPad Prism 软件(版本6,La Jolla,CA ,美国)进行统计分析和绘制图形㊂实验结果表示为均值ʃ标准差(n =3),进行3次独立重复实验㊂统计学检验采用单因素方差分析或双因素方差分析,采用Bonferroni 方法进行多重比较校正㊂P <0.05表示差异有统计学意义㊂2㊀结果(Results )2.1㊀27-BCZ 对细胞增殖的影响首先采用CCK -8实验明确27-BCZ 处理对细胞活力的影响㊂结果表明,经过24h(图1(a))或48h 27-BCZ(图1(b))处理后,细胞活力与对照组相比无明显变化,说明10-10~10-7mol ㊃L -1浓度范围内的27-BCZ 无增殖毒性㊂但10-8mol ㊃L -1和10-7mol ㊃L -1的27-BCZ 处理144h(图1(c))后,细胞活力与对照组相比增加,且差异有统计学意义(P <0.05),提示高浓度27-BCZ 可能对细胞增殖有促进作用㊂2.2㊀27-BCZ 抑制C2C12细胞分化过程中肌管的形成㊀㊀为探究27-BCZ 暴露对肌发育的影响,选择对细胞增殖无毒性的浓度范围(10-10~10-7mol ㊃L -1)的27-BCZ 连续处理C2C12细胞,并选择肌管形成的中期(day3)和肌管形成末期(day6)作为时间节点,通过H&E 染色,观察27-BCZ 对肌管形成产生的影响㊂10-7mol ㊃L -127-BCZ 处理对分化的抑制作用在day3较为明显(图2(a))㊂从肌管day3的H&E 染色图观察到,10-7mol ㊃L -127-BCZ 处理组中,分化的C2C12细胞的数量明显少于溶剂对照组,并且每个肌管中的细胞核数量较少(图2(a))㊂从小提琴图中观察到,10-7mol ㊃L -127-BCZ 处理组day3的细胞核数量大部分约为5个,处理组单条肌管内融合的细胞核平均数量比对照组少3个,小提琴形状扁平,表明数据集中分布在较低水平(图2(b))㊂在分化末期图1㊀27-BCZ 对细胞活力的影响注:27-BCZ 处理浓度为10-14~10-7mol ㊃L -1,DMSO(0.1%)用作溶剂对照;27-BCZ 从第0天开始持续处理;处理24h(a)㊁48h(b)和144h(c)的细胞通过CCK -8法测定细胞活力;具体实验步骤见 材料与方法 的相关内容;数据为对照组的倍数,用平均值ʃ标准差(n =3)表示,进行3次独立重复实验;统计分析方法为单因素方差分析和Bonferroni 多重比较(*表示27-BCZ 与对照组之间差异有统计学意义,显著性水平设为P <0.05,****代表P <0.0001)㊂Fig.1㊀Effect of 27-BCZ on C2C12cell viability during differentiationNote:The treatment concentration of 27-BCZ were 10-14~10-7mol ㊃L -1;DMSO (0.1%)served as the solvent control;27-BCZ wascontinuously treated from day0;cells treated for 24h (a),48h (b)and 144h (c)were subjected to determine cell viability by CCK -8method;see the relevant contents of Materials and Methods for specific experimental steps;the data are folds of control group and expressed as mean ʃSD (n =3);all samples were measured in three independent experiments;statistical analysis methods were one -way ANOV A and Bonferroni multiple comparison (*indicates a statistically significant difference between the 27-BCZ treatment and control;the level of significance was set at P <0.05;****represents P <0.0001).298㊀生态毒理学报第18卷图2㊀27-BCZ 处理后C2C12的形态学变化注:27-BCZ 的处理浓度为10-10~10-7mol ㊃L -1,DMSO 的处理浓度为0.1%,连续27-BCZ 处理从第0天开始;收集在分化day3和day6的细胞进行H&E 染色;每个处理浓度选取3个随机视野(n =3),统计肌管内细胞核数;(a)每个时间点的不同浓度处理组选取的代表性图片,比例尺=50μm ;(b)27-BCZ 处理后肌管中细胞数量的小提琴图;统计分析方法为单因素方差分析和Bonferroni 多重比较(*表示27-BCZ 处理组与对照组(day3和day6)的平均值的差异有统计学意义;显著性水平设定为P <0.05;*代表P <0.05,****代表P <0.0001)㊂Fig.2㊀Morphological changes after 27-BCZ treatmentNote:The treatment concentrations of 27-BCZ were 10-10~10-7mol ㊃L -1,and that of DMSO solvent was 0.1%;the continuous 27-BCZ treatment started from day0;cells were collected on differentiation day3and day6for H&E staining;select three random fields (n =3)for each treatment concentration and count the number of nuclei in the myotubes;(a)One of the representative pictures of each treatment group at each timepoint is shown;scale bar =50μm;(b)Violin plot of the number of nuclei in myotubes after treatment with 27-BCZ;statistical analysis methods were one -way ANOV A and Bonferroni multiple comparison (*indicates a statistically significant difference between the 27-BCZ treatment and control (day3and day6)in the mean value of nuclei inmyotubes;the level of significance was set at P <0.05;*represents P <0.05,****represents P <0.0001).day6,从染色结果可以观察到,随着处理浓度升高,形成的肌管形状更细,肌管内细胞核数略有降低(图2(a)),但单条肌管内融合的细胞核平均数量与对照组相比差异无统计学意义(图2(b))㊂为了进一步表征C2C12细胞肌管形成的效率,我们通过计算融合肌管中的细胞核总数(肌管内细胞核不少于2个)与在每个选定视野中观察到的细胞核总数的比率来量化融合指数㊂结果表明,27-BCZ 处理组的融合指数以浓度依赖的方式降低(图3)㊂结果表明,在分化中期day3,高浓度27-BCZ 不仅降低肌管的细胞核容量(图2(b)),肌管形成的效率下降,最高浓度处理组的细胞融合指数下降33.97%(图3),且与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)㊂在分化末期day6,27-BCZ 10-7mol ㊃L -1处理组细胞融合指数与对照组相比降低32.55%(图3)㊂结合肌管内细胞核数和融合指数,我们发现在分化末期,虽然27-BCZ 对肌管内细胞核容量与对照组相比差异无统计学意义(P >0.05),但是C2C12细胞参与融合形成多核肌管的效率变低(图2(b)和图3)㊂2.3㊀27-BCZ 降低肌管成熟标记基因Myh3和Myh4的表达㊀㊀肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)是肌管的重要结构蛋白,本研究使用其编码基因Myh3和Myh4作为分化成熟的标志分子㊂27-BCZ 处理抑制了肌管形成中期和末期C2C12细胞中Myh3和Myh4的表达,且大多数抑制作用呈浓度依赖性第4期郝迪等:基于C2C12细胞的2,7-二溴咔唑肌发育毒性效应299㊀(图4(a)和图4(b))㊂如图4所示,在对照组中,Myh3基因的表达在day3已经达到较高水平,day6基本没有明显的变化(图4(a))㊂27-BCZ对Myh3的抑制效果在分化中期day3开始体现,在day3时,10-9 mol㊃L-1和10-7mol㊃L-127-BCZ处理组的Myh3比对照组分别下降了34.16%和38.88%;在day6时10-7mol㊃L-127-BCZ处理组Myh3比对照组下降了37.97%(图4(a))㊂正常成肌分化(对照组)状态下,Myh4的表达量随时间持续增加,在day6时达到最高值(图4(b))㊂图3㊀27-BCZ暴露抑制分化到day3和day6的细胞融合指数注:将C2C12细胞接种到6个孔板中以诱导分化,收集分化到day3和day6的细胞进行H&E染色统计;27-BCZ的处理浓度为10-10~10-7mol㊃L-1,DMSO(0.1%)用作溶剂对照;融合指数,代表参与融合形成肌管的细胞核数与细胞核总数之比;具体实验步骤见 材料与方法 的相关内容;数据为平均值ʃ标准差(n=3),进行3次独立重复实验;统计分析方法为单因素方差分析和Bonferroni 多重比较(*表示27-BCZ处理组与对照组之间差异有统计学意义;显著性水平设置为P<0.05,*代表P<0.05,**代表P<0.01)㊂Fig.3㊀27-BCZ reduced the fusion index in day3and day6of C2C12differentiationNote:C2C12cells were seeded into six well plates to induce differentiation,and cells were collected at day3and day6of differentiation forH&E staining;the treatment concentration of27-BCZ were10-10~10-7mol㊃L-1;DMSO(0.1%)served as the solvent control;fusion index, representing the proportion of total nuclei found in myotubes;see the relevant contents of Materials and Methods for specific experimental steps;the data is meanʃSD(n=3);all samples were measured in three independent experiments;statistical analysis methods were two-way ANOV A and Bonferroni multiple comparison(*indicates a statistically significant difference between the27-BCZ treatment and control;the level of significance was set at P<0.05;*represents P<0.05,**represents P<0.01).图4㊀27-BCZ对Myh3和Myh4基因表达的影响注:从day0到day6,用10-10~10-7mol㊃L-1的27-BCZ或溶剂对照(DMSO,0.1%)连续处理C2C12细胞,并在day1㊁day3和day6收集;通过qRT-PCR测定Myh3(a)和Myh4(b)的mRNA表达水平,通过gapdh进行定量标准化;数值为相比于day0对照组表达量倍数,并表示为平均值ʃ标准差(n=3),进行3次独立重复实验;统计分析方法为双因素方差分析和Bonferroni多重比较(*表示在同一时间点与对照组相比差异有统计学意义;显著性水平设置为P<0.05;**代表P<0.01,***代表P<0.001,****代表P<0.0001)㊂Fig.4㊀Effect of27-BCZ on gene expression of Myh3and Myh4Note:C2C12cells were continuously treated with27-BCZ at10-10to10-7mol㊃L-1,or solvent control(DMSO,0.1%)from day0to day6,and collected on day1,day3and day6;the mRNA expression levels of Myh3(a)and Myh4(b)were determined by qRT-PCR,quantified by normalization to internal control gapdh;values are fold of basal level obtained on day0,and expressed as meanʃSD(n=3);each independent sample was tested in triplicate;statistical analysis methods were two-way ANOV A and Bonferroni multiple comparison (*indicates statistically significant difference compared with the control group in the same time point;the levelof significance was set at P<0.05;**represents P<0.01,***represents P<0.001,****represents P<0.0001).300㊀生态毒理学报第18卷在分化前期和中期,即day1和day3,27-BCZ暴露浓度增加对Myh4的表达量具有一定促进作用,但与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)(图4(b))㊂在day6,与对照组相比,10-10mol㊃L-127-BCZ处理组中Myh4的表达量提高17.75%,10-8mol㊃L-1和10-7mol㊃L-127-BCZ处理组中Myh4的表达量分别降低了16.12%和32.69%,表达量与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)(图4(b))㊂在day6,随27-BCZ暴露浓度增加,Myh4表达量呈现低浓度促进表达和高浓度抑制表达的结果(图4(b))㊂2.4㊀27-BCZ暴露干扰肌发育调节基因MRFs的表达MyoD和Myogenin被认为是肌生成的2个最终分化驱动因素[15]㊂在对照组中,MyoD的mRNA 表达在分化期间先增加,然后减少,在day3达到最高表达水平(图5(a))㊂27-BCZ处理存在时间和浓度依赖性抑制MyoD的mRNA表达(图5(a))㊂最高浓度的27-BCZ处理后,MyoD基因的表达从分化day1到day6与对照组相比降低,且差异有统计学意义(P<0.05),在day6达到最高抑制率(34.64%);而对于10-8mol㊃L-1处理组,在后期(day3和day6)观察到显著的影响;然而,在10-10mol㊃L-1和10-9mol㊃L-127-BCZ处理组中均未检测到显著影响(图5(a))㊂作为三者中低剂量即产生效应的最敏感的MRF,与对照组相比,MyoD基因表达随时间变化的曲线也发生了变化,即在10-8mol㊃L-1处理时,表达稍早达到峰值水平,在10-7mol㊃L-1处理6d后,与对照组相比表达急剧下降(降低34.64%)(图5(a))㊂关于另一种早中期的MRF,Myogenin仅在第3天以10-9 mol㊃L-1处理后与对照组相比差异才有统计学意义(P<0.05),整个分化期的表达谱没有变化(图5(c))㊂如图5(b)所示,分化前期和中期Mrf4表达水平较低,直到day6,所有处理组才观察到Mrf4的mRNA 表达,与day6的对照组相比,在10-9mol㊃L-1和10-7 mol㊃L-1的27-BCZ处理后,Mrf4表达受到抑制,分图5㊀27-BCZ对MRF基因表达的影响注:从day0到day6,用10-10~10-7mol㊃L-1的27-BCZ或溶剂对照(DMSO,0.1%)连续处理C2C12细胞,并在day1㊁day3和day6收集;通过qRT-PCR测定(a)MyoD㊁(b)Myogenin㊁(c)Mrf4的mRNA表达水平,通过管家基因gapdh进行定量;数值为第0天获得的基础水平的倍数,并表示为平均值ʃ标准差(n=3),进行3次独立重复实验;统计分析方法为双因素方差分析和Bonferroni多重比较(*表示在同一时间点与对照组相比差异有统计学意义;显著性水平设置为P<0.05,*代表P<0.05,***代表P<0.001,****代表P<0.0001)㊂Fig.5㊀Effects of27-BCZ on the gene expression of MRFsNote:C2C12cells were continuously treated with27-BCZ at10-10to10-7mol㊃L-1,or solvent control(DMSO,0.1%)from day0to day6,and collected on day1,day3and day6;the mRNA expression levels of(a)MyoD,(b)Myogenin,(c)Mrf4were determined by qRT-PCR, quantified by normalization to internal control gapdh;values are fold of basal level obtained on day0,and expressed as meanʃSD(n=3);each independent sample was tested in triplicate;statistical analysis methods were two-way ANOV A and Bonferroni multiple comparison (*indicates a statistically significant difference compared with the control group in the same time point;the level of significance was set at P<0.05;*represents P<0.05,***represents P<0.001,****represents P<0.0001).第4期郝迪等:基于C2C12细胞的2,7-二溴咔唑肌发育毒性效应301㊀别降低了12.40%和34.71%,且差异有统计学意义㊂2.5㊀27-BCZ 诱导cyp1a1和cyp1b1基因表达cyp1a1和cyp1b1是AhR 通路2个经典的下游靶基因㊂由于先前已经报道,27-BCZ 在小鼠肝癌细胞中激活AhR 效率相对较高[7],我们认为27-BCZ 在C2C12细胞中可能具有类似的AhR 激活能力㊂因此,我们研究了27-BCZ 对AhR 下游2个基因表达的影响,以明确其在我们的研究模型中对激活AhR 的作用㊂结果显示,27-BCZ 以时间和浓度依赖的方式诱导cyp1a1和cyp1b1的mRNA 表达(图6)㊂且cyp1a1基因表达诱导比cyp1b1更有效,cyp1a1和cyp1b1的最大诱导都出现在分化末期day6,与day0对照组相比最高激活倍数分别为9.4倍和6.2倍(图6)㊂图6㊀27-BCZ 对AhR 通路下游基因表达的影响注:从day0到day6,用10-10~10-7mol ㊃L -1的27-BCZ 或溶剂对照(DMSO ,0.1%)连续处理C2C12细胞,并在day1㊁day3和day6收集;通过qRT -PCR 测定cyp1a1(a)和cyp1b1(b)的mRNA 表达水平,通过管家基因gapdh 进行定量;数值为第0天获得的基础水平的倍数,并表示为平均值ʃ标准差(n =3),进行3次独立重复实验;统计分析方法为双因素方差分析和Bonferroni 多重比较(*表示在同一时间点与对照组相比差异有统计学意义;显著性水平设置为P <0.05,*代表P <0.05,**代表P <0.01,***代表P <0.001,****代表P <0.0001)Fig.6㊀Effect of 27-BCZ on the expression of downstream genes of AhR pathwayNote:C2C12cells were continuously treated with 27-BCZ at 10-10to 10-7mol ㊃L -1,or solvent control (DMSO,0.1%)from day0to day6,and collected on day1,day3and day6;the mRNA expression levels of cyp1a1(a)and cyp1b1(b)were determined by qRT -PCR,quantified by normalization to internal control gapdh ;values are fold of basal level obtained on day0,and expressed as mean ʃSD (n =3);each independent sample was tested in triplicate;statistical analysis methods were two -way ANOV A and Bonferroni multiple comparison (*indicates statistically significant difference compared with the control group in the same time point;the level of significance was set at P <0.05;*represents P <0.05,**represents P <0.01,***represents P <0.001,****represents P <0.0001).3㊀讨论(Discussion )本研究检测27-BCZ 暴露后C2C12细胞肌发育形态学和肌生成标志分子和调节分子的变化,实验数据显示27-BCZ 具有与TCDD 类似的肌发育干扰效应㊂27-BCZ 可以在细胞和分子水平上引起肌源性分化的紊乱,影响肌管的形成和成熟,且抑制效应呈剂量㊁时间依赖性㊂在分子水平上,我们发现27-BCZ 暴露影响肌分化调节因子MRFs 的表达,并抑制分化成熟标志分子Myh3和Myh4的表达,与形态学上抑制肌分化表现出一致性㊂另外,27-BCZ 在影响肌发生的同时,还能够激活AhR 下游靶基因cyp1a1和cyp1b1,表现出与二噁英类似的AhR 活性,为进一步机制研究提供方向㊂我们统计细胞融合指数和单条肌管内细胞核数这2个评估分化效果的参数指标的变化,分析27-BCZ 暴露后对肌管形态学的影响㊂结果显示,27-BCZ 在分化中期(day3)可以抑制肌管的形成,表现为细胞融合效率的降低和肌管内细胞核容量的减少㊂而在分化末期day6,27-BCZ 对分化的影响主要表现在降低细胞融合效率㊂且27-BCZ 暴露时间越长,处理浓度越高,对细胞融合效率和肌管内细胞容量的抑制作用越显著㊂这与此前文献报道的TC -DD 抑制肌管生成而导致肌发育毒性结果类似[4]㊂说明27-BCZ 是一种具有类似二噁英肌发育毒性的污染物㊂在CCK -8实验中我们发现在诱导分化的条件下,分化末期高浓度27-BCZ 处理能使细胞活力上升,提示高浓度27-BCZ 可能促进细胞的增殖㊂这与此前报道的肌肉发育过程中,增殖和分化呈现负相关的结果相一致㊂有研究报道肌肉发育是一个高。
稳定表达人ASB12的C2C12细胞系的建立及鉴定
第16卷第4期生命科学研究V01．16 No．4 2012年8月“fe S c ie n c e Research Aug．2012稳定表达人ASBl2的C2C12细胞系的建立及鉴定文斗斗1，周军媚邵，赵明一2，胡维新1，吴秀山2，王跃群妒(1．中南大学生物科学与技术学院，中国湖南长沙410013；2．湖南师范大学心脏发育研究中心，发育生物学教育部重点实验室，中国湖南长沙410081；3．南华大学药学与生命科学学院，中国湖南衡阳421001)摘要：AS Bl2 ho mo s ap ie ns a n ky f i n repe at and SOCS b o x c on ta in in g 121蛋白含有5个ANK f an ky fin repe a t qu en ce)序列和一个保守的SO CS(s up pr es so r of cy tok in e si gnaling)盒结构域，是ASBs human anky ri n re pe ata n d SOCSb ox cont ain in g protei n f am i l y。
A S B family)家族的成员．人类A骝12基因在成体心肌和骨骼肌组织中特异表达，是成肌分化的候选基因．利用阳离子聚合物转染技术将重组表达质粒pCMV．ta92B-ASBl2转染小鼠骨骼肌细胞系C2C12细胞，通过G418筛选、免疫荧光检测、RT．PCR分析、Western blotting检测建立了稳定表达ASBl2的细胞系C2C12．ASBl2，为研究ASBl2在骨骼肌发育及其相关功能提供有用的细胞研究模型．关键词：ASBl2；ANK结构域：SOCS box结构域：C2C12稳定细胞系中图分类号：Q28文献标识码：A文章编号：1007—7847(2012)04．0283．04Establishment and Identification of a Stable HumanASB12-Expressed C2C12Cell LineWEN Dou—doul，ZHOU Jun—mei2'3，ZHAO Ming—yi2，HU Wei—xinl，WU Xiu-shan2，WANG Yue-qun24(1．C oll ege of L乒Sciences and Technology,Central S o ut h University,Changsha410013，Hunan，China；2．Th e C en t er fo rH ea r t Developrncnt，Key Lab ofMOE ofDevele pment al Bio log y,H una n N orma l U n i v e r s i t y,C h a n g s h a 410081，Hu na n，Ch in a,． 3．Coll ege ofPharmacy and L咖Science，University ofSouth Chin a,He ng ya ng 421001，Hunan,吼i嘲Abstract：The human ASB12(Homo sap ie ns ankyrin repeat and SOCS box con ta ini ng 12)protein contains five ANK(ankyfin repea t sequence)domains and a SOCS(suppressor of cytoki ne signaling)box domain，be- lon gin g to the ASBs family．It was repose d that ASBl2especially e xp re ss ed i n skeletal and card iac muscles of adult tissues，which su gg es te d that ASB12 closely associa ted wit h skel eto n muscle development．To c o n．stru ct a stable ASBl2一expressed C2C12cell line，the fusion expres sio n plasmid pCMV—ta92B—ASBl2，which w a s identified by enzyme digesti on and s eq u e n c in g a nal ysi s，wa s transfected in t o C2C12cell by cationicpo ly me r．A ft er s cr e en in g cult ure by G418，the ex pr es sio n of ASB12w a s detected by immunofluoresc；nce，RT-PCR and Western—blotti ng．The C2C12cell line that expr ess in g A SBl2stably w a s establi sh ed successfully，which p rov id e a cell model for studyin g the molecular function of ASB12 in skeleton muscle developm ent．Key words：ASB12；ANK domian；SOCS box domain；C2C12stable cell line(L／fe Science Research，2012，16(4)：283。