生物化学(第一章)2

分析工具之一。
一、层析技术的原理
• 层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术 。所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者 是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动 相，如水和各种 溶 剂 。当待分离的混合物随流动相通过固 定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相 互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，与固定相相 互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小 ，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组 份，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中 所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。
生物化学(第一章)2
第一节 蛋白质（protein）及其生 物学功能
• 生物化学的基本内容包括： • 发现和阐明构成生命物体的分子基础－
生物分子的化学组成、结构和性质； • 生物分子的功能与生命现象的关系； • 生物分子在生物机体中的相互作用及其
变化规律。
生物信息大分子具有如下特征：
• 生物分子中最重要的是糖、酯、核酸和 蛋白质四类物质
环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。
• 肽链（N端氨基酸）与PITC偶联，生成PTC-肽
• 环化断裂：最靠近PTC基的肽键断裂，生成PTC-氨基酸和少
•
一残基的肽链，同时PTC-氨基酸环化生成PTH-氨基酸
• 分离PTH-氨基酸
• 层析法鉴定
• Edman降解法的改进方法--- DNS-Edman降解法
• 蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分 子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。
• 蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到 1000000道尔顿甚至更大
一、蛋白质分类
• 生物体内的作用不同
• 结构蛋白 • 功能蛋白：活性蛋白、信息蛋白
• 分子形状分
• 球状蛋白 • 纤维状蛋白
一、蛋白质分类
CHO
H C OH
CH2OH
D-(-)-甘油醛
OOC
H3C
C
NH3
H
L-丙氨酸
COOH
H C OH
CH3
D-(-)-乳酸
OOC R
C
NH3
H
L-氨基酸通式
Tyr
非蛋白质氨基酸
H2N CH2 CH2 COOH
H2N CH2 CH2 CH2 COOH
NH2 HS CH2 CH2 C COOH
H
NH2 HO CH2 CH2 C COOH
H
NH2
H2N CH2 CH2 CH2 C COOH
H
O
NH2
H2N C NH CH2 CH2 CH2 C COOH
H
NH2
C COOH
H CH3NH2 HOOC C C COOH
HH
小结
蛋白质基本结构单位：L－－氨基酸 －氨基酸：脯氨酸（亚氨基酸）除外 L－氨基酸：甘氨酸（无不对称C）除外 氨基酸结构通式：RCH(NH2)COOH 常见氨基酸种类：20种。
O
HN C R'
R C COOH H O CR N C COOH CH O
H
CH2 O C N CH COOH
O
R
氨基酸的化学反应
• 由α-氨基参与的反应 • 5.二硝基氟苯：黄色，肽链末端分析
NH2
O2N
R C COOH H
+
F
NO2
O2N
HH
HOOC C N
NO2
R
应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸 A.虽然多肽侧链上的ε- NH2、酚羟基也能与DNFB反应，但其生成 物，容易与α- DNP氨基酸区分和分离 ★首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构 A.肽分子与DNFB反应，得DNP-肽 B.水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸 C.分离DNP-氨基酸 D.层析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的种类、数目
显色反应： 茚三酮反应
例外：Pro黄色；Asn棕色 茚三酮反应:脯氨酸，羟脯氨酸，黄色物质
成肽反应：
HO
N H H2N C NH NH
N NH
HS HO
第三节 氨基酸的分离纯化
• (一)层析技术的原理
• 俄国植物学家M.Tswett发现 并使用这一技术证明了植物 的叶子中不仅有叶绿素还含 有其它色素。现在层析法已 成为生物化学、分子生物学 及其它学科领域有效的分离
Nitidine
Chelerythrine
O
N
O O
Liriodenine
H3CO
N OCH3 OCH3
TMB
O OO
O
N CH3
O
Oxyavicine
O
O
O
O
H3CO
OCH3
N CH3
Dihydrochelerythrine
CHO
HO C H
CH2OH
L-(+)-甘油醛
COO
H3N
C
H
CH3
L-丙氨酸
甘氨酸的酸碱滴定曲线
(zwitterion)
带电状态判定 pI-pH<0 …………….带负电 pI-pH>0 …………….带正电 pI-pH＝0 …………….不带电
等电点计算 ①侧链为非极性基团或虽为极性基团但不解离的氨 基酸：pI=½ (pK1+pK2) ②酸性氨基酸(Glu、Asp)及Cys：pI=½ (pK1+pKR) ③碱性氨基酸(赖、精、组)：pI=½ (pK2+pKR)
③酸性氨基酸（含有两个羧基）： Glu（含γ羧基）、Asp（含β羧基）
④碱性氨基酸（含有两个以上氨基）： Arg（胍基）、His（咪唑基）、Lys（ε氨基）
含硫氨基酸：Met、Cys 芳香族氨基酸：Phe、Tyr、Trp
三、氨基酸的理化性质
1、物理性质 2、两性解离 等电点（isoelectric point, pI）：在某一pH环 境中，氨基酸解离成阳性离子及阴性离子的趋势 相等，所带净电荷为零，在电场中不泳动。此时， 氨基酸所处环境的pH值称为该种氨基酸的等电点 (pI)。
2、氨基酸分类：按其侧链R的结构和理化性质分类
①非极性、疏水氨基酸(非极性R基氨基酸)： Val, Leu, Ile（支链）；Gly（无旋光异构）；Met
（含硫）；Phe（芳香族）；Pro（亚氨基） ②极性、中性氨基酸(不带电荷的极性R基氨基酸) ：
Ser, Thr（含羟基）；Tyr, Trp（芳香族）；Cys （含硫）；Gln, Asn（含酰氨）
分配层析（萃取的原理）
• 利用化合物在两种互不 相溶（或微溶）的溶剂 中溶解度或分配系数的 不同，使化合物从一种 溶剂内转移到另外一种 溶剂中。经过反复多次 萃取，将绝大部分的化 合物提取出来。
• A、B两个溶液系统、 • I（A:B=2:1） 1g II（A:B=1:3） 1g
• 第一次萃取后 • A中I有2/3g, II有1/4g I:II=8:3 （2.6倍） • B中I有1/3g, II有3/4g I:II=4:9 （2.15倍）
H
H
H
H
3、紫外吸收：
T r p 、 T y r 和 P h e 在 280nm波长附近具有最大 吸收峰，其中Trp的最大吸 收最接近280nm
氨基酸的化学反应
• 由α-氨基参与的反应 • 1.与亚硝酸的反应：
NH2
R C COOH H
+
HNO2
OH
R
C H
COOH
+
N2
+ H2O
• Van Slyke定氮法,生产上常用于测定蛋白质 的水解程度。
• 第二次萃取后 • A中I有4/9g, II有1/16g 倍） • B中I有1/9g, II有9/16g 倍）
I:II=64:9 （7.1 I:II=16:81（5.1
• HPLC:根据出峰的位置及峰高或峰面积，可以定性及定 量。层析法与光学、电学或电化学仪器连用，可使操 作及数据处理自动化，大大缩短分析时间。由于层析 法具有分辨率高、灵敏度高、速度快等特点，因此适 用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生 物样品的分离分析。近年来，已成为生物化学及分子 生物学常用的分析方法。在医药卫生、环境化学、高 分子材料、石油化工等方面也得到了广泛的应用。
氨基酸的化学反应
• 由α-氨基参与的反应
• 2.与甲醛反应： 甲醛滴定法
NH2 R C COOH + HCHO
H
H R C COOH
HN CH2OH
H R C COOH
N CH2OH
• 应用：氨基酸定量分析－甲醛滴定法（间接滴定）
CH2OH
• A.直接滴定，终点pH过高（12），没有适当指示剂。
• B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。
• 分子组成成分 1.单纯蛋白 (1)清蛋白、球蛋白：水，甘氨酸 (2)谷蛋白、醇溶蛋白：不溶于水 (3)精蛋白、组蛋白：碱性氨基酸，细胞核 (4)硬蛋白：纤维状蛋白，不溶于水、稀酸
稀碱和有机溶剂，含大量胱氨酸
一、蛋白质分类
• 分子组成成分 1.结合蛋白 (1)核蛋白：核酸 (2)色蛋白：辅基是金属色素 (3)糖蛋白：辅基是糖或者糖的衍生物，所有组织，
• 分子量一般都很大 • 由结构小分子结构单元组成. • 顺序排列。 • 结构复杂：线性信息，三维信息
2、蛋白质的重要生物学功能
其他生物学功能：营养蛋白，结构，毒蛋白
3、氧化供能
第二节 蛋白质的分子组成
一、元素组成
1、主要元素：碳、氢、氧、氮和硫，有些蛋白 质还含有少量磷和金属元素。 2、特点：各种蛋白质的含氮量很接近，平均含 氮量为16%。 3、定氮法测定蛋白质含量：