1 构建质粒
同源重组构建质粒原理和双酶切构建质粒的区别
同源重组构建质粒原理和双酶切构建质粒的区别同源重组构建质粒和双酶切构建质粒，这俩听起来是不是像是从基因工程实验室里蹦出来的高大上名词？其实也没那么复杂，咱们可以把这些概念捋一捋，像平常聊八卦一样，慢慢道来。
你要是细心一点，也许会发现这两种方法本质上都是想搞定一件事——把想要的基因片段“插”到质粒中，打造一个“超级质粒”，然后再把它们“送”到细胞里去干活。
好了，先别急着眨眼睛，我们一个一个搞清楚。
先说说同源重组。
这个方法听起来很有科技感，实际上就是靠一种叫做“同源性”的技巧，帮助你把目标基因片段给准确地放到质粒中去。
简单来说，它就像是让两个基因“谈恋爱”，通过它们之间的相似性，结合成一个新的组合。
打个比方，就像是你有两块拼图，尽管它们不完全相同，但是边缘部分很吻合，你就能把它们拼到一起。
要搞清楚同源重组，我们得知道，它不是随便拼拼的，它有很高的精准度！两块拼图对得准，拼起来才不会乱。
而这种方法特别适合用在一些比较大或者比较复杂的基因片段上。
它的一个特别之处在于，拼接的时候你能指定位置，像是给基因做了一次精准的“定位手术”，让你想要的基因不偏不倚地“定居”在质粒中。
嗯，是不是有点像婚姻介绍所，精准配对，拿到手的是你最中意的基因呢？不过，话说回来，同源重组也不是万能的。
你得有两者的DNA序列足够相似才能顺利接合。
就像你没法把完全不搭界的两个人拉在一起，你要是基因片段差得太远，可能就“黄了”。
操作起来的难度不小，得借助一些专业的酶和工具，甚至还要在一定条件下进行“强迫”，比如通过高温或者电场来促进DNA的交换。
哎呀，它是个技术活儿，得有点儿耐心。
咱们说说“双酶切构建质粒”这个方法。
顾名思义，这方法得用到“两把”酶！所以，它的原理其实比较直接，简单粗暴。
你要做的，就是用这两把酶分别把你手中的质粒和那个目标基因片段给剪成合适的形状。
就像你把一块木板和一块木条分别锯成合适的尺寸，然后把它们拼接到一起。
这个过程不需要什么神奇的“同源性”，只要你找到适合的切割位点就好。
高中生物选修三专题一 1.2 基因工程的基本操作程序
已知基因的核苷酸序列 ； ③前提条件：_______________________ 模板DNA 、___________ DNA引物 、 原料：___________ 热稳定DNA聚合酶 、 ________________ 四种脱氧核苷酸 。 __________________ 指数 方式扩增，即____ 2n （n为扩增 ④方式：以_____ 循环的次数） ⑤结果： 使目的基因的片段在短关信息。
如：根据基因的核苷酸序列
基因的功能
基因在染色体上的位置
基因的转录产物mRNA
基因翻译产物蛋白知道序列，NA B、线粒体DNA C、总mRNA D、tRNA
3、化学方法人工合成目的基因
（1）范围
在基因较小，核苷酸序列已知的 情况下，可以利用DNA合成仪人工合 成。
（2）方法 化学合成法 、 反转录法
（在DNA合成仪中合成）
人工合成 (基因比较小)
DNA合成仪
48
①反转录法：
以目的基因转录成的信使 RNA为模板，反转录成互补的 单链DNA，然后在酶的作用下 合成双链DNA，从而获得所需 的基因。
（二）、目的基因
主要指的是编码蛋白质的结构基因
也可以是一些具有调控作用的因子。
例如：与生物抗逆性相关的基因，与生物优良品质 相关的基因，药物和保健品相关的基因，与毒物降 解相关的基因，以及与工业所需要酶相关的基因。
目前被广泛提取使用的目的基因有： 苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因 （抗病毒、抗细菌)、人胰，导入的 一段碱基序列互补配对。
温度控制和缓冲液（Mg2+）
（5）、仪器： PCR扩增仪（自动调控温度的仪 器） （6）、方式： 以_____ 指数 方式扩增，即 ____ 2n （n为扩增循环的次数）
PIAS-1基因真核表达质粒的构建与鉴定
PIAS-1基因真核表达质粒的构建与鉴定秦会影;王海琳;刘钰;张培【摘要】Objective To construct interference vector of Plko.1 and PIAS-1.Methods Sequence of siRNA targeted by PIAS-1 was designed and was cloned into the expression vector pLKO. 1.The recombinants were identified by gene sequencing.Results PCR test and gene sequencing a-nalysis showed that the recombinant plasmid was constructed correctly.Conclusion Sequence of siR-NA targeted by PIAS-1 has been constructed successfully,and it provides stable transfection of RNA interference vector for the proliferation and apoptosis of PIAS-1 in cervical cancer.%目的：构建 PIAS-1 siRNA 干扰载体 Plko．1、PIAS-1。
方法设计以PIAS-1基因为靶标的 siRNA 序列，并克隆人载体 Plko．1，用基因测序进行重组克隆验证。
结果PCR 检测证实 siRNA 插入 Plko．1质粒，测序分析证实插入序列正确。
结论成功构建 PIAS-1基因的 siRNA 载体，为研究 PIAS-1基因对宫颈癌细胞增殖凋亡的影响提供了稳定转染的骨架载体。
【期刊名称】《实用临床医药杂志》【年(卷),期】2014(000)016【总页数】4页(P7-10)【关键词】宫颈癌;PIAS-1;质粒 pLKO.1;siRNA【作者】秦会影;王海琳;刘钰;张培【作者单位】兰州大学第一临床学院妇科，甘肃兰州，73000;甘肃省人民医院妇科，甘肃兰州，73000;;【正文语种】中文【中图分类】R73-3RNA干涉(RNAi)由美国科学家Andrew Fire和Craig Mello［1］于1998年正式提出，其原理为利用同源性的双链RNA(dsRNA)诱导序列特异性的目标基因的沉寂，迅速阻断基因活性。
北京市第二中学2023年生物高三第一学期期末质量检测试题含解析
北京市第二中学2023年生物高三第一学期期末质量检测试题注意事项1．考生要认真填写考场号和座位序号。
2．试题所有答案必须填涂或书写在答题卡上，在试卷上作答无效。
第一部分必须用2B 铅笔作答；第二部分必须用黑色字迹的签字笔作答。
3．考试结束后，考生须将试卷和答题卡放在桌面上，待监考员收回。
一、选择题：（共6小题，每小题6分，共36分。
每小题只有一个选项符合题目要求）1．生态位是指生物在生态系统中所占据的位置及与相关种群、栖息地等因素之间的关系与作用。
下列说法错误的是（）A．不同物种的生态位可能会出现重叠现象B．同一环境中的两个生态位相同的种群，常常会由于食物或生活资源而发生竞争C．处于同一生态位的种群之间不可能存在生殖隔离D．如果环境发生重大变化，某种生物的生态位可能会随之改变2．下列有关生物体内物质运输的叙述，正确的是A．一种tRNA只能转运一种氨基酸B．植物激素的转运都是极性运输C．胰岛素通过体液定向运输到靶细胞D．氧气在血液中运输不需要蛋白质3．下图为某核苷酸链的局部结构图，下列叙述中正确的是A．图中a或b能构成一个完整的核苷酸B．各核苷酸之间是通过化学键①连接起来的C．该链可能是组成T2噬菌体遗传物质的一部分D．该核苷酸链中五碳糖上连接的磷酸可以是1个或2个4．美国科考团在南极湖泊下方深水无光区发现了生活在此的不明类型细菌，并获得了该未知细菌的DNA，以下叙述正确的是（）A．该细菌没有高尔基体，无法形成细胞壁B．该细菌中没有染色体，只能进行无丝分裂C．该细菌细胞中的嘌呤数不一定等于嘧啶数D．该细菌的生命活动主要由其DNA分子执行5．下图为甲遗传病的某家系图，II-4不携带该病的致病基因。
男性人群中的色盲的发病率为7%。
下列分析正确的是（）A．甲遗传病可能为伴X显性病B．仅考虑甲病，图中的患者有两种基因型C．甲病的发病率等于该致病基因的基因频率D．III2与人群中正常女性结婚，后代同时患两种病的概率为7/4286．下表为人睾丸中甲、乙、丙、丁四个细胞内的染色体组和同源染色体的数量，据表推测下列说法正确的是（）细胞甲乙丙丁类别同源染色体对数23 0 0 46染色体组数 2 2 1 4A．甲、丁分别表示减数分裂和有丝分裂过程中的细胞B．甲细胞内可能发生非同源染色体的自由组合C．丁细胞内的染色单体数是乙细胞的两倍D．乙细胞内含有一条X或Y染色体二、综合题：本大题共4小题7．（9分）某科研人员从野生型红眼果蝇（2N=8）中分离出紫眼突变体，并进行了以下实验：实验一：紫眼雌果蝇x野生型红眼雄果蝇→F1均为红眼→F2中红眼：紫眼=3:1实验二：紫眼雄果蝇x野生型红眼雌果蝇→F1均为红眼→F2中红眼：紫眼=3:1（1）根据上述实验结果，下列关于眼色基因存在部位的假设，不成立的是_________。
bmi-1质粒载体的构建
Bmi-1基因过表达载体的构建【摘要】目的：在真核细胞中构建Bmi-1基因的过表达载体。
方法：从GenBank 中获取Bmi-1基因序列，设计针对Bmi-1的特异性引物，利用PCR方法获得全长目的基因，将目的载体和PCR产物进行双酶切，在T4DNA连接酶下形成重组质粒。
对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定，再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的即为构建成功的目的质粒。
结果：经阳性克隆测序结果及结果分析，测序正确。
结论：人源Bmi-1真核过表达载体构建成功。
【关键词】 Bmi-1；过表达载体；转化前言：多梳基因( polycomb group genes,PcG)家族是果蝇发育时维持同源异形基因稳定表现的重要因子。
在胚胎发育、肿瘤发生和干细胞的维持中有着重要的作用。
由荷兰癌症中心于1991年在鼠淋巴瘤中发现的Bmi-1基因( B cell-specific MLV inte-gration site-1 )是多梳基因家族中重要成员之一,参与干细胞的增殖、分化与衰老,在多种肿瘤形成过程中起重要作用[1]。
人类Bmi-1基因克隆和定位在10号染色体短臂13区(该区域被认为与各种白血病染色体易位有关), DNA大小为4. 9 kb, mRNA为3 199 bp,含10个外显子,编码含326个氨基酸的蛋白质,分子质量为36. 9 kD[2]。
其蛋白表达在细胞质、染色质或染色体。
Alkema等用鼠Bmi-1 cDNA片断作为探针从人白血病细胞中分离出Bmi-1并进行分析,发现其核苷酸序列与鼠的一致性达86 %,所编码的蛋白质的氨基酸系列与鼠的一致性达98 %。
Bmi-1基因含有一个环指模序,位于N-末端的环指结构域( ring fin-ger domain, RF),与抑癌基因c-Myc协同在细胞增殖和肿瘤形成中发挥作用。
Bmi-1通过环指结构与其他环指蛋白,如dinG等形成异源二聚体,再与其他成分相互结合,抑制其靶基因的转录[3]。
载体构建质粒构建步骤有哪些？
载体构建质粒构建步骤有哪些？载体构建过程：1、引物设计2、⽬的⽚段选取：RNA提取、RNA反转录、PCR扩增、PCR产物纯化3、双酶切4、连接:T4 DNA ligase连接或者同源重组连接（新贝⽣物：#B101、#B102）5、转化6、菌落PCR7、测序：1)摇菌；2)送样; 3)⽐对；8、菌种保存：菌种⽐对成功，则可保存菌种备⽤。
9、质粒提取：菌种⽐对成功，冻存菌种后，菌液⽤于提取质粒。
⼀、载体构建基本原理分、切、连、转、筛1、分：分离出要克隆的⽬的基因及载体。
2、切：⽤限制性内切酶切割⽬的基因和载体，使其产⽣便于连接的末端。
限制性内切酶：是⼀类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸⽔解酶。
限制性核酸内切酶根据识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性分为三⼤类。
其中Ⅱ型酶能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内切割，产⽣特异性DNA⽚段，是DNA 重组技术中常⽤的酶。
Ⅰ型酶：具有修饰和切割功能，⽆固定切割位点Ⅲ型酶与Ⅰ型类似，能识别特异位点，但切割位点在识别位点以外Ⅱ型酶特点：①识别顺序⼀般为4－6个碱基对②识别顺序具有180度的旋转对称性，呈完全的回⽂结构③Ⅱ型酶对双链DNA两条链同时切割，可产⽣两种不同末端：平末端，粘末端平末端：在识别顺序的对称轴上，对DNA同时切割形成平末端，如：SmaI5’－CCC GGG－3’ 5’－CCC GGG－3’3’－GGG CCC－5’ 3’－GGG CCC－5’5′突出粘末端：在识别序列的两侧末端切割DNA双链，于对称轴的5 ′末端切割产⽣5 ′端突出的粘性末端，如：Hind Ⅲ5’―AAGCTT―3’ 5’― A 5’－AGCTT―3’3’―TTCGAA―5’ 3’― TTCGA－5’ A―5’3′突出粘末端:与5′突出粘末端作⽤相反，产⽣3 ′端突出粘末端，如：PstI5’―CTGCAG―3’ 5’―CTGCA－3’ G―3’3’―GACGTC―5’ 3’―G 3’－ACGTC―5’3、连：将切割后的⽬的基因和载体⽤T4 DNA连接酶连接或者同源重组⽅法连接。
抗体质粒构建
抗体质粒构建【最新版】目录1.抗体质粒构建的定义和意义2.抗体质粒构建的基本原理3.抗体质粒构建的过程4.抗体质粒构建的应用5.抗体质粒构建的未来发展趋势正文抗体质粒构建是一种将特定抗体基因插入到质粒载体中，从而形成重组质粒的技术。
这种技术在生物制药领域具有重要的意义，因为它为研究者和生产商提供了一种生产单克隆抗体的有效方法。
抗体质粒构建的基本原理是通过基因重组技术，将抗体基因与质粒载体结合，形成一个新的重组质粒。
这个新质粒可以在宿主细胞中表达，生成具有特定功能的抗体。
在这个过程中，选择合适的抗体基因和质粒载体至关重要，因为它们会影响到最终产生的抗体的质量和产量。
抗体质粒构建的过程主要包括以下几个步骤：首先，获取目标抗体基因，这通常通过基因合成或从已知的抗体基因库中筛选得到。
其次，构建质粒载体，选择合适的表达载体并将其与抗体基因连接。
接下来，将重组质粒转化到宿主细胞中，通常是 E.coli 等大肠杆菌。
最后，通过诱导表达和纯化，获取目标抗体。
抗体质粒构建在生物制药领域有很多应用，其中最主要的是用于生产单克隆抗体。
这些抗体在疾病诊断、治疗和科学研究中具有广泛的应用。
此外，抗体质粒构建还可以用于研究抗体结构与功能之间的关系，以及抗体的表达和调控。
随着生物技术的发展，抗体质粒构建在未来将继续发挥重要作用。
例如，研究人员可以利用这一技术开发新型抗体，以应对不断出现的新型疾病。
此外，通过改进质粒载体和表达系统，可以提高抗体的产量和质量，从而降低生产成本，提高药物的可用性。
总之，抗体质粒构建是一种具有重要意义的生物技术，它为生产单克隆抗体提供了有效的手段。
DNAJA1过表达重组质粒构建及转染结肠癌细胞的鉴定
DNAJA1过表达重组质粒构建及转染结肠癌细胞的鉴定摘要】目的：构建DNAJA1(DnaJ heat shock protein family(Hsp40) member A1)基因过表达质粒，转染结肠癌细胞株，并对其是否转染成功进行鉴定。
方法：Real-time聚合酶链反应(PCR)及Western blot检测6株结肠癌细胞及瞬时转染DNAJA1质粒的细胞中DNAJA1 mRNA水平。
采用全基因合成法合成DNAJA1编码区序列并克隆入pEGFP-C1载体末端，构建重组质粒pEGFP-C-DNAJA1并进行测序及凝胶电泳鉴定。
结果：6株结直肠癌细胞中，DNAJA1在HT29和HCT116中的mRNA和蛋白水平最较低，在LOVO和SW620细胞中较高。
测序及凝胶电泳结果表明DNAJA1重组质粒构建成功。
瞬时转染HT29和HCT116细胞后，与对照组相比，DNAJA1 mRNA分别升高约50倍，蛋白表达也明显升高。
结论：成功构建DNAJA1基因过表达重组质粒，并有较高的转染水平，为进一步的研究提供了条件。
【关键词】DNAJA1；结肠癌；基因转染【中图分类号】R735.35 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）33-0184-02【Abstract】Objection To construct the recombinant DNAJA1 (DnaJ heat shock protein family (Hsp40) member A1) overexpressed plasmids and transfect them inHT29 and HCT116 colorectal cancer (CRC) cell lines.Methods The expression of DNAJA1 mRNA in six CRC cell lines and DNAJA1 transient transfected cells was detected by using real-time polymerase chain reaction (PCR) and Western blot. DNAJA1 coding region was synthesizedto splice whole gene and then cloned into C terminus of pEGFP ovector to construct recombinant plasmids, and finally verified by gel electrophoresis and DNA sequencing. Results Among the six CRC cell lines The lowest levels of DNAJA1 mRNA and protein were observed in HT29 and HCT116 cells, and its highest levels were detected in SW620 and LoVo cells. The DNA sequencing and gel electrophoresis results validated the well recombinant plasmids. DNAJA1 mRNA in transient expressed SW480 cells was significantly increased by 50 fold, and the protein level of DNAJA1 was also obviously increased. Conclusion The recombinant DNAJA1 overexpressed plasmids were successfully constructed, which offered a well condition for our further research.【Key words】DNAJA1; Colorectal cancer; Gene transfection近年来，随着医学技术的不断进步，结直肠癌的病死率有所下降，但它仍是人类最常见的恶性肿瘤之一，且它的发病率有逐年上升的趋势[1]。
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Dpn1消化0.5L/10L, 37℃/2-3h.
转化：
0.5L质粒or 10L连接产物
加入刚化冻的BL21av（用于表达）orDH5（用于扩增）置于冰上30min
置于42℃金属浴上热激75s后置于冰上2min
加入预热至37℃的200LLB培养液，置于37℃培养箱30min
chimpanzee/Pan troglodytes
monkey/Macaca mulatta
dog/
horse/Equus caballus
cattle/Bos taurus
pig/ Sus scrofa
mouse/Mus musculus
Rat/Rattus norvegicus
chicken/ Gallus gallus
4. DH10Bac感受态细胞喜冷不喜热，严格执行冰上操作步骤，保证整个过程中感受态细胞的低温状态时获得高效感受态细胞的关键。
5. 用于转座的pFastBac1等载体自身含有庆大霉素的抗性，并且转座是否成功可以通过蓝白斑进行筛选，因此在使用pFastbac1载体质粒进行DH10Bac感受态细胞转化时平板应该使用含有卡那霉素，四环素抗性和庆大霉素的三抗平板。同时，在平板中加入IPTG和X-gal以进行蓝白斑筛选，鉴定转座是否成功。 本文转载自：/dh10bac
酶1/酶2各1.5L
gene30L
(100x BSA0.5L)
ddH2O补齐
置于37℃培养箱内酶切，2-12h，胶回收后连接。
（单酶切产物在胶回收1h前加入1.5LCIP）
Nede1 酶切30min， 胶回收后直接连接
连接：
Vector:
Gene:
10L体系：
10x T4 Buffer1L
Vector1-1.5L------2.5L
frog/ Xenopus (Silurana) tropicalis
zebrafish/ Danio rerio
_chimpanzee
_monkey
_dog
_horse
_cattle
_pig
_mouse
_Rat
_chicken
_frog
_zebrafish
b、将FASTA导入记事本后，用ClustalW2进行align，（option-Input），根据结果删除差别大的、重要性小的。
3）执行Screen程序：
95℃：5min
95℃：30s
56℃：30s
72℃：（1Kb/1min）
（循环25次）
72℃：10min
12℃：2h
接种：
菌落名
挑取单克隆，加入10mLLB培养基+10LAmp/5L Kan，置于37℃摇床培养16h
（Bacmid， 10L Kan. 10L T (10mg/mL), 1LG）
提质粒：
质粒名
1）菌液转入离心管中，离心4000rpm/10min，弃去上清
2）+250L P1 Buffer重悬菌块，转移至EP管中
3）+250L P2 Buffer，上下振荡10次
4）+350L P3 Buffer，上下振荡10次
5）离心14000rpm/10min，吸取上清加到预先用500LBLBuffer平衡过的CP3柱中，结合5min
2）设计引物：软件Primer Premier
（突变时不考虑酶切位点；
一段引物+（终止密码子）+酶切位点+保护碱基（注意读码框），长度为15-25bp左右；
上下游引物的Tm尽可能相近，不要多于4bp互补；
引物在未加酶切片段前，Tm=55左右；
3’端为C或G；）
记下引物序列（酶切位点用小写表示）以及Tm值，订购引物
实验步骤：
1. 在含有50 ug /ml Kan+和10 ug/ml Tet+抗性的LB平板或无抗平板上，使用DH10Bac菌液划线，37oC培养箱过夜，培养12~20小时。 2. 从平板上挑取一个单菌落，接种到一个含有50 ug /ml Kan+和10 ug/ml Tet+抗性的100 ml LB液体培养基中，于37℃，250rpm培养3-6小时，至OD600值为0.4左右。 或者从平板上挑取一个单菌落，接种到一个含有50 ug /ml Kan+和10 ug/ml Tet+抗性的5 ml LB液体培养基中，于37℃，250rpm培养12小时，然后再将菌液按照1:100的比列接种于含有50 ug /ml Kan+和10 ug/ml Tet+抗性的100 ml LB液体培养基中，于37oC，250rpm培养3小时，至OD600值为0.4左右。 3. 将DH10Bac细菌培养烧瓶在冰上孵育10 min，使培养物冷却至0℃，转入无菌的预先用冰预冷的50 ml离心管中，然后于4℃下5000 rpm离心8 分钟收集细胞。 4. 倒出培养液，尽量使上清弃尽。每50 ml初始培养物加入30 ml预先用冰预冷的0.1 M CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置30分钟。
Generate-symmetry mates看晶胞中堆积方式（+cap帮助堆积）
复合物与单体进行align，看结合面
查阅报道相似结构的文献
5）sequence pattern：
二级结构预测：Jpred、PSIPRED（截片段）
三级结构预测：Phyre2（fulllength）
引物设计：
1）分析自身酶切位点：软件DNAMAN（copy/paste/select/loadsequence/from selection/restriction analysis），选择要用的酶切位点（注意同尾酶， BgLⅡ和BamHⅠ）
ddH2O38L（加入GC enhancer 12L时，为26L）
3）分为6个10L，执行梯度PCR程序：
98℃：3min
98℃：8s
（多为52-64℃，记下6管对应值）：20s
72℃：（1min/2Kb）
(循环25-30次)
72℃：10min
12℃：2h
琼脂糖凝胶电泳：
1）配1%琼脂糖凝胶：
称1gAgarose Gel，加入100mLTAEBuffer，微波炉中高热2min溶解，冷却2min后加入2dEB，倒入模具冷却。
备注：
1. DH10Bac感受态细胞制备的整个过程中应当严格无菌操作。
2. 提前配制包含工作浓度为50 ug /ml的卡那霉素和10 ug/ml的四环素的LB培养基100 ml，其中添加100 mg /ml的卡那霉素50 ul，10 mg/ml的四环素100 ul。 3. 悬浮、分装细胞时，预先将枪头预冷，EP管事先标明清楚并置于4℃或-20℃冰箱预冷。
vector (0.02xbp)ng50-200ng (之前取10-20L vector酶切)
gene (0.04xbp)ng20-200ng
ExnaseII2LddHO37℃/30min0℃/5min
转化
磷酸化（平末端连接）：
10L体系：
10x T4 Buffer1L
T4 PNK0.5L
PCR产物8.5L
6）离心9000rpm/1min，弃去滤液
7）2X（+600L PW Buffer，离心12000rpm/1min，弃去滤液）
8）离心12000rpm/3min，金属浴62℃/10min，并预热ddH2O
9）+80L ddH2O，结合5min，离心12000rpm/1min，收集滤液
10）测DNA浓度
+300LPCBuffer，洗去多余的胶，离心12000rpm/1min，弃去滤液
2X (+600LPWBuffer，离心12000rpm/1min，弃去滤液)
离心12000rpm/3min，金属浴62℃/10min
+30L预热的ddH2O，结合6min后，离心12000rpm/1min
收集滤液，测DNA浓度（注意A260/280在1.65-1.85）
2）电泳：
上样：Sample（10L）+6xLoading Buffer（2L）
电泳：150-160V/10-15min（150V/7min）
在UV下观察条带
胶回收：
切下目的DNA条带，放入EP管中，+400LPCBuffer，金属浴60℃/10min
将该溶液移至预先用500LBLBuffer平衡的CB2柱中，结合5min，离心9000rpm/1min
突变引物：
1）环P，平末端连接
2）四引物
3）环p，Dnpi酶解甲基化质粒
PCR:
1）克隆基因名称
2）60L体系：
5xQ5 Buffer12L
dNTP(2.5mM)2.4L
P13L（10M）
P23L
Gene1L（Nanodrop测得>100，一般稀释1/10）
Q50.6L（与Easy Tag相比效率高，是高保真酶）
11）测序（美吉or桑尼）
小量表达：
1、接种
2、诱导表达（2L1MIPTG）
3、将菌液转入15mL离心管中，离心4000rpm/10min，弃去上清
4、+1mL Binding Buffer重悬菌块，转移至EP管中
5、超声破碎（柱ID：03，参数2min/1.5s/1.3s/12%），取样
6、离心14000rpm/10min/4℃，上清取样
5. 于4℃，5000 rpm离心8 分钟收集细胞，弃尽上清。加入4 ml预先用冰遇冷的0.1 M CaCl2。轻轻吹打悬浮细胞，加入1 ml灭菌的预先用冰遇冷的80%甘油，吹打混匀。 6. 将DH10Bac感受态细胞按照毎管100 ul分装。可以直接使用新鲜制备的DH10 BAc感受态细胞进行质粒转化，也可以放在-80 ℃冰箱保存备用。