质粒构建流程
质粒的构建
② -半乳糖苷酶Xgal显色反应： -半乳糖苷酶能把无色的化合物 Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的 物质5-溴-4-氯靛蓝。 -半乳糖苷酶 Xgal 半乳糖
5-溴-4-氯靛蓝
③ lacZ的肽互补 1）-肽（ lacZ’ ）： -半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断 （11-41氨基酸）。 N端的11-41aa N端的11-41aa N端的11-41aa N端的11-41aa C端大部分 C端大部分 C端大部分 C端大部分
（2）长度
4363bp
（3）选择标记 氨苄青霉素和四环素抗性。
（4）克隆位点
24个克隆位点。
其中9个会导致Tetr基因失活（如 BamH I、Hind Ⅲ、Sal I）； 3个会导致Ampr基因失活（Sca I、 PvuI、Pst I）。
（5）pBR322的筛选 ①双抗菌素抗性选择标记
在EcoRⅠ和HindⅠ酶剪切位点之间插入外源基因
（2）长度
（3）克隆位点
约2.7kb
10个连续的单一限制酶切位 点，位于lacZ’基因的5’端。
ห้องสมุดไป่ตู้
pUC18/19
选择标记 Ampicillin 抗性和 lacZ的肽互补（蓝白 斑）相结合。 筛选方法
选用带有含有ampicillin和X-gal的培养基 受体菌lacZ突变（lacZ∆M15）
受体菌lacZ突变（lacZ∆M15） 受体菌基因组的-半乳糖苷酶基因的 氨基端有缺失（缺失肽），不能形成 4聚体的活性酶，不能分解Xgal 受体菌株：JM系列、TG1、TG2、 XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、 MV1184、DH5a
质粒载体生物学特征
分类 按复制类型可分为：松弛型 严紧性 按转移性可分为转移型和非转移型
质粒构建流程范文
质粒构建流程范文质粒是在分子生物学研究中常用的载体，用于将外源基因导入到真核或原核细胞中。
质粒构建是将所需基因插入质粒中的过程，通常包括以下几个步骤：选择适当的质粒骨架、获得目标基因、PCR扩增目标基因、消除酶切位点、连接、转化宿主细胞和筛选等。
下面将详细介绍质粒构建的流程。
第一步：选择适当的质粒骨架质粒骨架是质粒的基本结构，包括起始子、终止子、选择性标志物和多个酶切位点，用于插入目标基因。
在选择质粒骨架时，需要考虑质粒复制起源、复制调节元件和基因表达调节元件等因素。
第二步：获得目标基因目标基因是要插入到质粒中的外源基因，可以是从生物体中提取的DNA或通过合成DNA获得的。
在获得目标基因时，需要考虑基因的大小、序列特征和功能等因素。
第三步：PCR扩增目标基因PCR（聚合酶链反应）是一种常用的DNA扩增技术，可以通过引物在DNA模板上进行反复扩增，得到大量的目标基因的DNA片段。
在PCR扩增目标基因时，需要选择适当的引物和反应条件，并进行反应优化和扩增验证。
第四步：消除酶切位点在插入目标基因之前，需要消除质粒骨架内的酶切位点，避免再次被酶切产生的片段。
可以通过点突变、限制性内切酶切除和引物设计等方法消除酶切位点。
第五步：连接将PCR扩增的目标基因与质粒骨架连接，通常可以通过限制性内切酶切除和连接、引物设计和T4DNA连接酶等方法实现。
在连接时，需要考虑连接位点的互补性和酶切位点的匹配等因素。
第六步：转化宿主细胞质粒构建完成后，需要将其转化到适当的宿主细胞中，使其在细胞内复制和表达。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞等。
第七步：筛选转化后的宿主细胞需要进行筛选，以获得携带目标基因的阳性克隆。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选和PCR鉴定等。
质粒构建是一项复杂而精细的实验技术，需要熟练的实验操作和严密的实验设计。
在实验过程中，需要注意反应体系的优化、质粒构建产物的验证和质粒的稳定性等因素。
稳转细胞系构建流程
稳转细胞系构建流程英文回答：Stable cell line generation workflow.Stable cell line generation is a crucial technique in cell biology and biotechnology. It involves introducing genetic material into a host cell to create a cell linethat stably expresses the desired gene product. This approach allows for the production of therapeutic proteins, industrial enzymes, and other valuable products.The workflow for stable cell line generation typically includes the following steps:1. Plasmid construction: The gene of interest is cloned into an expression vector, which contains elements necessary for gene expression, such as a promoter, transcription termination signal, and selection marker.2. Transfection or transduction: The expression vectoris introduced into the host cell using a variety of methods, including transfection with chemical reagents or electroporation and transduction with viral vectors.3. Selection: Cells that successfully take up and express the expression vector are selected using a suitable selection marker, such as antibiotic resistance or fluorescence.4. Clonal expansion: Individual cells are isolated and expanded to establish clonal cell lines.5. Characterization: Clonal cell lines arecharacterized for their expression levels, stability, and other relevant properties to identify those with thedesired characteristics.Stable cell lines are essential tools for basic research, drug discovery, and industrial biotechnology.They offer several advantages over transient expression systems, including sustained and high-level production ofthe desired gene product, genetic stability, andscalability for large-scale production.中文回答：稳转细胞系构建流程。
CRISPR实验流程
CRISPR/Cas9 实验流程一、利用Cas9质粒建立knock-out细胞系实验的详细过程1.1 确定待敲除基因的靶位点1.2 设计识别靶位点的识别的一对DNA Oligo（引物）1.3 构建表达sgRNA的质粒1.4 sgRNA活性检测1.5 利用Cas9质粒建立knock-out细胞系1.1、确定待敲除基因的靶位点根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找。
找到该基因CDS区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。
按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。
对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。
如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。
1.2、设计识别靶位点的一对DNA Oligos确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input框中（/），然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列。
一般地，基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列（Protospacer Adjacent Motif）前间区序列邻近基序，这是一种见于crRNA分子的短核苷酸基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割）的20个nt。
而PAM序列的特征为NGG（其中N为任意核苷酸）。
因此，sgRNA模板序列选择非常方便，即使没有软件，研究者也可手工进行选择。
不过，在线软件可以给出该序列在基因组中存在相似序列的情况，即可能的脱靶位点。
因此，利用在线软件可以选择脱靶机会小的序列作为sgRNA模板序列。
根据选择的sgRNA模板序列，合成一对序列互补的DNA Oligos。
1.3、构建可表达sgRNA的质粒（Precut SgRNA Cloning kit and pSD-gRNA Plasmid构建试剂盒）将合成的Oligos以逐步降温的方法退火成双链，然后与我们提供的质粒进行连接，连接后转化感受态的大肠杆菌，再进行涂板。
载体构建质粒构建步骤有哪些？
载体构建质粒构建步骤有哪些？载体构建过程：1、引物设计2、⽬的⽚段选取：RNA提取、RNA反转录、PCR扩增、PCR产物纯化3、双酶切4、连接:T4 DNA ligase连接或者同源重组连接（新贝⽣物：#B101、#B102）5、转化6、菌落PCR7、测序：1)摇菌；2)送样; 3)⽐对；8、菌种保存：菌种⽐对成功，则可保存菌种备⽤。
9、质粒提取：菌种⽐对成功，冻存菌种后，菌液⽤于提取质粒。
⼀、载体构建基本原理分、切、连、转、筛1、分：分离出要克隆的⽬的基因及载体。
2、切：⽤限制性内切酶切割⽬的基因和载体，使其产⽣便于连接的末端。
限制性内切酶：是⼀类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸⽔解酶。
限制性核酸内切酶根据识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性分为三⼤类。
其中Ⅱ型酶能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内切割，产⽣特异性DNA⽚段，是DNA 重组技术中常⽤的酶。
Ⅰ型酶：具有修饰和切割功能，⽆固定切割位点Ⅲ型酶与Ⅰ型类似，能识别特异位点，但切割位点在识别位点以外Ⅱ型酶特点：①识别顺序⼀般为4－6个碱基对②识别顺序具有180度的旋转对称性，呈完全的回⽂结构③Ⅱ型酶对双链DNA两条链同时切割，可产⽣两种不同末端：平末端，粘末端平末端：在识别顺序的对称轴上，对DNA同时切割形成平末端，如：SmaI5’－CCC GGG－3’ 5’－CCC GGG－3’3’－GGG CCC－5’ 3’－GGG CCC－5’5′突出粘末端：在识别序列的两侧末端切割DNA双链，于对称轴的5 ′末端切割产⽣5 ′端突出的粘性末端，如：Hind Ⅲ5’―AAGCTT―3’ 5’― A 5’－AGCTT―3’3’―TTCGAA―5’ 3’― TTCGA－5’ A―5’3′突出粘末端:与5′突出粘末端作⽤相反，产⽣3 ′端突出粘末端，如：PstI5’―CTGCAG―3’ 5’―CTGCA－3’ G―3’3’―GACGTC―5’ 3’―G 3’－ACGTC―5’3、连：将切割后的⽬的基因和载体⽤T4 DNA连接酶连接或者同源重组⽅法连接。
重组质粒构建流程
重组质粒构建流程导言在分子生物学研究中，质粒是一种重要的工具，可用于携带外源DNA，转导到靶细胞内进行表达或操纵基因。
在许多应用中，需要从头开始构建特定的质粒来满足实验需求。
本文将介绍重组质粒的构建流程，包括质粒设计、DNA片段的合成、连接和转化等步骤。
质粒设计重组质粒的构建首先需要进行质粒设计。
在设计过程中，需要考虑以下几个方面：质粒拓扑结构、宿主细胞、选择标记、启动子、终止子等。
其中，质粒拓扑结构是质粒构建的基础，可以选择环状质粒或线性质粒；宿主细胞是质粒的宿主细胞，需要考虑宿主细胞的特性和适用范围；选择标记是用于筛选携带外源DNA的宿主细胞，可以选择抗生素抗性标记、荧光蛋白标记等；启动子和终止子则是用于调控外源DNA的表达水平。
DNA片段的合成在质粒构建中，需要合成一系列DNA片段，包括载体骨架、选择标记、启动子、基因、终止子等。
DNA片段的合成可以通过多种方法进行，包括化学合成、PCR扩增、酶切和连接等。
在合成过程中，需要确保DNA片段的正确性和纯度，以保证后续的连接和转化效率。
连接连接是质粒构建的关键步骤，通过连接不同的DNA片段来构建目标质粒。
连接的方法包括酶切和连接、PCR扩增和连接、重组DNA技术等。
在连接过程中，需要确保连接效率和准确性，避免产生错误连接或杂交产物。
此外，对于大片段DNA的连接，还需要考虑连接的稳定性和转化效率。
质粒的放大和提取连接完成后，需要将质粒放大到足够的数量，并提取纯净的质粒DNA。
放大的方法可以选择细菌发酵、真菌发酵等，根据质粒的特性选择合适的宿主细胞进行放大。
质粒提取的方法包括碱裂解法、隐式裂解法等，确保提取的质粒DNA的纯度和完整性。
质粒的转化最后一步是将构建好的质粒转化到目标宿主细胞中，进行表达或操纵基因。
转化的方法可以选择化学转化、电转化、热激转化等，根据宿主细胞的特性和实验需求选择合适的转化方法。
在转化过程中，需要考虑转化效率、亲和性和表达水平等因素，确保转化的质粒可以稳定存在和表达。
20170814 质粒构建流程
20170814质粒构建流程武汉大学Angelo一、引物设计1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI2）软件分析目的基因可用酶切位点。
使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用酶切位点。
3）选择载体。
根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。
如pMSCV，4）选择酶切位点。
对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。
载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。
5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子前的全部碱基。
6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。
一般选择三个保护碱基。
7）引物设计完成，送公司合成。
二、目的片段获取方法一：1. RNA提取2. RNA反转录获得目的片段方法二：从韩家淮实验室索取（通常采用）具体流程：1、PCR扩增PCR程序：95℃5min 95℃30s 58℃30s 72℃延伸（根据基因片段大小设定时间）35cycle 72℃5min 22℃保存注：可根据不同基因调节退火温度，延伸时间，循环数。
2、PCR产物纯化1）根据PCR基因的大小配制1%-2%琼脂糖凝胶，放电泳槽里，点样并电泳10-20min2）割胶回收（产物电泳结果含杂带）① 将含目的条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入1.5ml EP管。
② 加等体积（1g=1ml）GC buffer ,65℃水浴10min左右至胶溶解（溶液为淡黄色），混匀2min，进行试剂盒回收③ 溶液加入回收柱中，12000rpm离心，1min，废液倒回再离一次④ 弃废液，加500μl washing buffer，离心12000rpm，1min ⑤ 弃废液，加500μl PW washing buffer，离心12000rpm，1min ⑥ 空管离心12000g，2min，弃废液，柱子转移到新1.5ml EP 管⑦加入30-50μl elution buffer于硅胶膜上，室温孵育2min，离心13000g，1min标上基因名称，日期⑧电泳检测三、载体和片段双酶切（分开酶切）20μl 反应体系如下片段：PCR纯化产物16μl FD buffer(10×) 2μl 酶A 1μl 酶B 1μl 反应条件：37℃水浴2h 加loading buffer（10×）终止反应注：buffer类别依使用的酶具体选择载体：载体质粒大于1.5ug并补ddH2O至16ul FD buffer(10×) 2μl 酶A 1μl 酶B 1μl 反应条件：37℃水浴2h或以上加loading buffer（10×）终止反应注：buffer类别依使用的酶具体选择四、载体酶切产物回收和纯化片段一般不进行胶回收，只进行回收柱纯化1）一般配制1%琼脂糖凝胶，放电泳槽里，点样并电泳20-30min（琼脂糖凝胶配制：琼脂糖凝胶（1%）30ml 琼脂糖粉0.3g 1×TAE 30ml 微波炉加热溶解，冷却一会儿后加入1μl gold view核酸染料或溴化乙锭（有毒），混匀，倒板，插梭子。
6分钟提取质粒
6分钟提取质粒
"6分钟提取质粒" 通常指的是在分子生物学实验中，从细菌中提取质粒的过程，该过程可以在相对较短的时间内完成。
提取质粒是为了获取质粒中的目标基因、DNA片段或其他重要的遗传物质。
以下是一般的质粒提取步骤，这个过程可以在大约6分钟内完成：
1. 培养菌株：
- 开始前，先在培养基中培养含有目标质粒的大肠杆菌（E. coli）菌株。
2. 离心：
- 将培养好的菌液进行离心，将菌体沉淀。
3. 去除培养基：
- 弃去上清液，保留含有大肠杆菌的菌体沉淀。
4. 溶解：
- 使用缓冲液溶解菌体，使DNA释放。
5. 加入溶解剂：
- 加入一些溶解剂，如碱性SDS（十二烷基硫酸钠），破坏膜脂，释放DNA。
6. 快速离心：
- 进行瞬时离心，将膜脂等杂质快速沉淀。
7. 取上清：
- 取上清液中含有的质粒DNA。
8. 沉淀：
- 加入醋酸等溶液，使DNA沉淀。
9. 洗涤：
- 对DNA沉淀进行洗涤，去除残余的盐和其他污染物。
10. 溶解：
- 最后，用适当的缓冲液溶解沉淀的质粒DNA。
这样的质粒提取方法通常使用快速、高效的离心和溶解步骤，使得整个过程可以在相对较短的时间内完成。
实际提取时间可能因具体实验方案和使用的提取试剂盒而有所不同。
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质粒构建流程一、引物设计1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI2）软件分析目的基因可用酶切位点。
使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。
3）选择载体。
根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。
如pcDNA3.1(+)，4）选择酶切位点。
对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。
载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。
5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。
6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。
一般选择三个保护碱基。
7）引物设计完成，送公司合成。
二、目的片段获取1. RNA提取试剂盒：Bioteke 高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存）准备：冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套操作步骤：1）将1000μl裂解液RL加入细胞中，混合5min。
2）加200μl氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。
3）4℃，12000rpm离心10min。
4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550μl）5）加入1倍体积（550μl）70%乙醇，混匀6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃，10000rpm离心45s7）弃废液，重套收集管，加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45s8）弃废液，重套收集管，加700μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s9）弃废液，重套收集管，加500μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min11）吸附柱放入新EP管，加50μl RNase free water于膜上，室温放置2min12）4℃，12000rpm离心60s13）点样：5μl RNA+ 1μl 10×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，3min，可见3条亮带。
14）-20℃保存2.RNA反转录试剂盒：TaKaRa primescript RT reagent kit with gDNA eraser（-20℃保存）准备：冰盒，②④⑤⑥取出解冻，①③为酶不可取出，预冷离心管操作步骤：1）基因组DNA去除（10μl体系）② 5×gDNA eraser buffer 2μl① gDNA eraser 1μlTotal RNA 4μl(可根据RNA浓度调整)⑥ RNase free water 3μlPCR仪中进行，程序：42℃，2min→4℃注：RNA的量可根据浓度调整，混合液冰上配制，酶最后加入2）反转录反应（20μl体系）④ 5×primerScript buffer 2 4μl③ primerScript RT enzyme mix I 1μl⑤ RT primer mix 1μl⑥ RNase free water 4μl1）反应液10μlPCR仪：37℃，15min→85℃，5s→4℃注：可直接将第2步反混合液好后加入到第1步反应液中3）1.5mlEP管收集，-20℃长期保存3. PCR扩增高保真酶primerstar扩增，50μl5×PS buffer 10μldNTP 4μldH2O 32.5μlPrimerstar 0.5μlcDNA 1μl(可变)R-primer 1μlF-primer 1μl点样：5μl PCR产物+ 1μl 6×buffer，4.PCR产物纯化1）液相纯化（产物电泳结果只含目的条带）试剂盒：Microelute cycle-pure spin protocol(OMEGA bio-tek) D6293-01①将PCR产物加入1.5mlEP管，加入5倍体积buffer CP，混匀。
②转移至HiBind MicroElution DNA 柱（套收集管），室温离心10000g，1min。
③弃废液，加700μl DNA wash buffer（含乙醇）到柱子，室温离心10000g，1min。
④弃废液，重复③⑤弃废液，空管离心13000g，1min⑥柱子放入新EP管，加10-20μl Elution buffer到膜上，室温孵育3-5min，离心10000g，1min⑦电泳检测2）割胶回收（产物电泳结果含杂带）①将含目的条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入1.5ml EP管。
②加等体积（1g=1ml）binding buffer（XP2）,60℃金属浴7min左右至胶溶解（溶液为淡黄色），混匀2min③溶液加入离心柱，离心10000g，1min，废液倒回再离一次④弃废液，加300μl binding buffer（XP2），离心10000g，1min⑤弃废液，加700μl SPW washing buffer，离心10000g，1min⑥重复⑤⑦空管离心13000g，2min，弃废液，柱子转移到新EP管⑧加入30-50μl elution buffer 于膜上，室温孵育1min ，离心13000g ，1min⑨ 电泳检测三、双酶切30μl 反应体系如下：PCR 纯化产物 15μl10×M/L/K buffer 3μl3dH2O 10μl酶A 1μl酶B 1μl反应条件：takara 酶30℃水浴1h →65注：buffer 类别依使用的酶具体选择，见附表四、连接1）双酶切后，可将质粒酶切产物琼脂糖电泳1-2μl2）酶切产物液相纯化3）20μl 连接体系（皆可）PCR 产物 5μlpcDNA3.1 2μl10×T4buffer 2μlT4 ligase 1μl3dH2O 10μlPCR 仪中进行：22℃，30min →4注：连接产物-20℃可长期保存五、转化准备：碎冰，灭菌EP 管、LB 空液体培养基，带抗性培养板，超净工作台，移液枪，水浴锅加热42℃1）将感受态细胞置于冰上，待其融化2）超净工作台中，将连接产物10μl 加入100μl 感受态细胞，或质粒1-3μl 加入100μl 感受态细胞3）轻混匀，冰浴30min4）热击水浴42℃，45s ，冰浴1min5）加900μl LB 空培养基，摇菌150rpm ，37℃，1h6）浓缩离心13000rpm ，1min ，上清液留约200μl 重悬菌体，部分涂板（50-100μl ）7）完全吸收后，37℃倒置培养12-16h六、菌落PCR1）以rTaq 酶50μl 体系配制PCR 反应液，每个PCR 管分装15μl ，体系如下：3dH2O 35.7μl PCR 程序：95℃ 5min10×buffer 5μlMgCl2 3μldNTP 4μlrTaq 0.3μlR-primer 1μlF-primer 1μl2）灭菌牙签挑单菌落放入PCR体系中搅一下，再在新板划板（注意编号），每板挑10个菌。
新划的板37℃倒置培养12-16h。
3）琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，记录含目的条带的菌落号备用。
七、测序1.摇菌1）PCR检测有目的条带的菌落，挑选2-3个较好的以供摇菌2）三角瓶中分装10ml LB抗性液体培养基3）用10μl 枪头挑起选择的菌落打到培养基中4）37℃。
250rpm摇菌12-16h2.送样每瓶取1ml箘液，送华大基因测序3.比对将测序结果与基因序列进行比对，比对正确则构建成功，比对错误则重新构建。
（注：数据库中基因序列可能有误，若出现少数突变，可换其他数据库比对试试）八、菌种保存菌种比对成功，则可保存菌种备用。
1）超净工作台中取1.5mlEP管，加200μl 80%灭菌甘油。
2）再加入800μl 箘液，轻混匀。
3）液氮冻存。
（一个基因冻2管即可）九、质粒提取菌种比对成功，冻存菌种后，箘液用于提取质粒。
试剂盒：AXYGEN axyprep plasmid miniprep kit 250-prep操作步骤：1）取3-5ml箘液，室温下离心10000g，1min2）弃上清，加250μl solution I/ RNase A 重悬菌落，混匀3）加250μl solution II，倒置轻混匀，孵育2min。
（整个裂解反应不超过5min）4）加入250μl solution III，立即倒置混匀，直到生成白色絮状沉淀。
5）室温离心13000g，10min6）上清液小心转入HiBind miniprep column(有套管)，室温离心10000g，1min7）弃废液，加500μl buffer HB，室温离心10000g，1min8）选择性步骤：重复第7步9）弃废液，空管室温离心13000g，2min10）柱子转入新EP管，加30-50μl elution buffer或3dH2O到膜上，室温孵育1-2min 11）室温离心13000g，1min12）提取的质粒-20℃保存备用附：感受态制备方法（皆采用LB空白培养基）：1.菌种活化1）用接种环直接取冻存的E.coli/ DH5α菌种，在LB平板上划线，37℃倒置培养16h2）挑单菌落转到2-10ml LB液体培养基中，摇菌37℃，250rpm，12-16h3）取1ml箘液加入到100ml LB液体培养基，摇菌37℃，250rpm，3h4）检测箘液OD600≤ 0.5（0.3-0.4）2.感受态制备准备：0.1M CaCl2灭菌，50ml离心管灭菌，冰水，1.5ml离心管冰上预冷，离心机4℃预冷。
步骤：1）将箘液用50ml离心管分装，调平，4℃离心3000rpm，8min2）弃上清，0.1M CaCl2 10ml重悬（冰水中进行，动作轻），两管合成一管3）冰上放置一段时间，4℃离心2500rpm，8min4）弃上清，0.1M CaCl2 10ml重悬，4℃冰箱过夜沉淀5）上清液取出8ml，剩2ml，加670μl 80%甘油（箘液：80%甘油=3:1），轻混匀6）1.5mlEP管分装，每管分装100μl ，液氮冻存。
试剂配制：1.琼脂糖凝胶（1.2%）琼脂糖粉0.6g1×TAE 50ml微波炉加热溶解，冷却一会儿后加入1μl gold view核酸染料，混匀，倒板2.电泳缓冲液TAE（50×）2mol/L tris-碱242g1mol/L 冰醋酸57.1mlEDTA(pH8.0) 18.622g二蒸水至1L用NaOH调节pH至8.6，常温储存。
用时稀释成1×溶液使用。
3.LB培养基Yeast extract（酵母提取物）1gTryptone 2gNaCl 2gAgar powder（琼脂粉）3g（配1.5%固体培养基时加入）二蒸水200ml灭菌20min，冷却后加入抗生素。