标准的PCR反应体系
PCR反应体系
反 应 体 系
PCR
镁离子
引物及探针 模板
06
PCR buffer
PCR反应缓冲液的目的是给Taq DNA聚合酶提供一 个最适酶催反应条件。
成分 Tris-HCl KCl NH4+ 小牛血清白蛋白 明胶 Tween 20 二硫苏糖醇（DTT） 浓度 10-50mmol/L ≤50mmol/L 16.6mmol/L 100μg/ml 0.01% 0.05% ～0.1% 5mmol/l 有助于酶的稳定，提高试 剂的稳定性。 作用 平衡ph值 利于引物的退火（产率比 较高） 特异性比较好
的提高了扩增的准确性内参基因是为了平衡不同模板之
间的差异。加入浓度50μ L体系加入0.1μ L 25μ M ROX， 终浓度为versetranscripatase）是以RNA为模板指
导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。 ROX（ROX Reference Dye）一般用于ABI、 Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪上。用于消 除信号本底以及效正孔之间产生的荧光信号，最大限度
Taq酶
Taq酶是从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分 离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。
5'到 3'合成 DNA能力 普通Taq酶 有 5'到 3'外 切酶活性 有 3'到 5'外 切酶活性 无 3'端加A
延伸速度
有
2000base/min
热启动Taq酶
有
有
无
有
2000base/min
P C R 反 应 体 系
PCR 原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）是指在DNA聚合酶催化下， 以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等 步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
PCR的反应体系主要包括哪些
PCR的反应体系主要包括哪些PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学和遗传学研究中广泛应用的技术。
它是通过扩增DNA片段的方法，使得微量的DNA能够在体外得到大量复制。
PCR的反应体系主要包括以下几个关键组分：引物、DNA模板、聚合酶、缓冲溶液和dNTP。
引物PCR反应需要两种引物，称为前向引物和反向引物。
它们是用来定位要扩增的DNA 区域的短链RNA或DNA片段。
引物的设计是PCR反应中非常关键的一步，需要根据DNA序列的特点来选择适当的引物。
合理的引物设计可以提高扩增效率和特异性。
DNA模板PCR反应的DNA模板通常是从细胞或组织中提取出来的DNA。
模板可以是基因组DNA、cDNA或已知序列的DNA片段。
PCR通过基本的核酸配对准则，利用引物将所需的DNA片段扩增出来。
聚合酶PCR反应中所使用的聚合酶是一种特殊的酶，称为DNA聚合酶。
常用的DNA聚合酶有Taq聚合酶和Pfu聚合酶等。
聚合酶能够识别DNA模板上的引物结合位点，并在这个基础上合成新的DNA链。
它具有高度稳定的酶活性和较高的耐热性，使得PCR反应可以在高温条件下进行。
缓冲溶液缓冲溶液是PCR反应中的重要组分之一，它提供了适当的pH值和离子平衡条件，使反应能够在适宜的环境中进行。
缓冲溶液通常含有Tris-HCl、KCl等成分，以维持反应的稳定性和效率。
dNTPPCR反应需要四种脱氧核苷酸三磷酸盐（dNTPs）作为合成新DNA链的原料。
这四种成分分别是脱氧腺嘌呤核苷酸（dATP）、脱氧鸟嘌呤核苷酸（dGTP）、脱氧胸腺嘧啶核苷酸（dTTP）和脱氧胞嘧啶核苷酸（dCTP）。
它们提供了构建新DNA链所需要的碱基。
反应条件PCR反应还需要适当的温度条件下进行。
常见的PCR反应温度是95°C的高温变性步骤、50-60°C的引物结合步骤和72°C的DNA链合成步骤。
这些温度可以使PCR反应能够在合理的时间内完成扩增。
pcr原理,反应体系和基本过程
PCR（聚合酶链式反应）是一种广泛应用于分子生物学和遗传学研究的技术，用于扩增DNA 序列。
PCR基于DNA的复制原理，在体外模拟DNA的自然复制过程，通过酶和适当的反应体系，使特定DNA序列在反应中进行指数级扩增。
以下是PCR的基本原理、反应体系和过程：原理：PCR反应基于DNA的双链结构。
通过加热将DNA双链分离为两条单链，然后通过引物（primer）与目标DNA序列的特定区域结合，然后在适当的温度下，DNA聚合酶（DNA polymerase）催化合成新的DNA链，形成两条新的双链DNA。
这个过程包括三个基本步骤：变性（Denaturation）、退火（Annealing）和延伸（Extension）。
反应体系：PCR反应通常包含以下组分：模板DNA：要扩增的DNA样本。
引物（primer）：短的DNA序列，与目标DNA序列的两端相互补，作为起始合成新DNA链的起点。
DNA聚合酶：如Taq聚合酶，用于合成新的DNA链。
dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）：包括A、T、C和G四种碱基的单元，供DNA聚合酶使用。
缓冲液：维持反应体系的pH和离子浓度，提供适宜的环境供DNA聚合酶催化反应。
基本过程：PCR反应通常涉及以下的循环步骤，每个循环依次进行变性、退火和延伸：变性（Denaturation）：将PCR反应管中的混合物加热至94-98摄氏度，使DNA双链解离为两条单链。
退火（Annealing）：将反应温度降低至45-68摄氏度，使引物与目标DNA序列的特定区域结合。
延伸（Extension）：将温度提高至72摄氏度，DNA聚合酶催化新的DNA链的合成。
DNA 聚合酶使用dNTPs作为碱基单元，延伸引物，合成新的DNA链。
这个循环步骤会重复多次（通常为20-40次），每次循环都会使目标DNA序列扩增约一倍，最终产生大量目标序列的DNA。
通过PCR，可以在短时间内从少量的起始DNA模板扩增出大量的目标DNA序列，为分子生物学、基因组学研究以及遗传疾病诊断等提供了强大的工具。
简述PCR反应所需要的体系及简要过程
简述PCR反应所需要的体系及简要过程引言PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，可以在体外快速扩增DNA 序列。
它的广泛应用使得PCR成为现代生物科学研究的重要工具。
本文将简要介绍PCR 反应所需的体系以及整个过程。
PCR反应体系PCR反应体系由以下几个关键组分组成：模板DNA模板DNA是PCR反应中的起始物质，它含有我们想要扩增的DNA序列。
模板DNA可以来自多种来源，如基因组DNA、cDNA、病毒DNA等。
引物引物是PCR反应中的两个短寡核苷酸序列，它们与目标DNA序列的两端互补。
引物的设计非常重要，需要确保引物能够特异性地结合目标DNA序列，并且不能与其他非目标DNA序列结合。
反应缓冲液反应缓冲液提供了适宜的环境条件，使PCR反应能够顺利进行。
缓冲液中通常包含一定浓度的镁离子（Mg2+），以促进DNA聚合酶的活性。
dNTPsdNTPs是反应中所需的四种脱氧核苷酸，即dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
它们作为DNA合成的原料，与模板DNA中的单链碱基互补结合，参与新DNA链的合成。
DNA聚合酶DNA聚合酶是PCR反应的关键酶类，它负责在反应过程中合成新的DNA链。
常用的PCR反应酶包括Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶等。
PCR反应过程PCR反应经历三个主要的循环步骤：变性、扩增和延伸。
变性反应开始时，PCR反应体系中的DNA双链结构被加热至高温，使其变性成两条单链DNA。
这一步又称为变性步骤，其目的是使DNA解开双链结构，使得引物能够结合到目标序列的起始位点。
扩增在变性步骤之后，PCR反应体系中的温度被降低，使引物能够与目标DNA序列的两端互补结合。
DNA聚合酶沿着引物向3’方向合成新的DNA链，每一个引物结合位点都会产生两条新的DNA链。
这一步又称为扩增步骤，其结果是将目标DNA序列扩增为双数目标序列。
延伸在扩增步骤之后，PCR反应体系中的温度再次升高，以使未完成的DNA链得以延伸。
标准的pcr反应体系
标准的pcr反应体系PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，它可以在体外大量复制DNA片段。
PCR反应是在一定的条件下，通过DNA引物和DNA聚合酶，使目标DNA片段在体外迅速扩增，是分子生物学研究中常用的技术手段之一。
标准的PCR反应体系包括以下几个方面：1. DNA模板，PCR反应的第一步是添加待扩增的DNA模板。
这可以是从细胞中提取的基因组DNA，也可以是经过纯化的质粒DNA或PCR产物。
DNA模板的质量和纯度对PCR反应的效果有很大影响，因此在使用之前需要进行质检和定量。
2. 引物，PCR反应需要两个引物，它们分别位于待扩增DNA片段的两端。
引物的设计需要考虑到目标DNA的序列，确保引物能够特异性地结合到目标DNA 上。
此外，引物的长度和碱基组成也需要符合一定的要求，以保证PCR反应的效率和特异性。
3. DNA聚合酶，PCR反应中使用的DNA聚合酶通常是热稳定的，能够在高温下保持活性。
常用的DNA聚合酶有Taq聚合酶和Pfu聚合酶等。
在PCR反应中，DNA聚合酶起着复制DNA的作用，能够在高温下将引物结合到DNA模板上，并在适当的条件下合成新的DNA链。
4. 缓冲液，PCR反应需要在特定的pH和离子浓度条件下进行，因此需要添加合适的缓冲液来维持反应体系的稳定性。
常用的PCR缓冲液包括Tris-HCl缓冲液和KCl缓冲液等。
5. 脱氧核苷酸（dNTPs），PCR反应需要四种脱氧核苷酸作为DNA合成的原料，它们分别是脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胸苷酸（dCTP）和脱氧胸嘧啶酸（dTTP）。
在PCR反应中，这些脱氧核苷酸会被DNA聚合酶利用，与引物结合到DNA模板上，合成新的DNA链。
6. 离子，PCR反应中需要适当的离子浓度来维持DNA聚合酶的活性，通常通过添加Mg2+离子来实现。
Mg2+离子的浓度对PCR反应的效果有很大影响，需要根据具体的引物和DNA模板来进行优化。
标准的PCR反应体系
标准的PCR反应体系PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系:10X扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umolL引物各10〜100mol模板DNA01 〜2ugTqDNA聚合酶25ug2+15mmolL加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTR模板和g2+引物：引物是PCR寺异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30b ，常用为20b 左右。
②引物扩增跨度：以200-500b为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3' 端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCF失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度01〜lumol或10〜100mol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种TqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量2。
5U（指总反应体积为100ul 时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
pcr反应体系的基本构成
pcr反应体系的基本构成PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，它能够在体外迅速扩增特定DNA片段。
PCR反应体系的基本构成包括引物、DNA模板、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）、聚合酶、缓冲液和水。
引物是PCR反应中的关键组成部分，它是DNA的两条链的起始序列，能够指示扩增特定DNA片段的位置。
引物一般由合成寡核苷酸组成，长度通常为18-30个碱基。
在PCR反应中，引物与DNA模板的两个互补序列结合，作为DNA聚合酶的起始点。
DNA模板是PCR反应中的待扩增的DNA片段，可以是从细胞中提取的基因组DNA，也可以是经过特定方法提取和纯化的DNA片段。
DNA 模板的质量和纯度对PCR反应的结果有重要影响，因此在PCR反应前需要对DNA模板进行质检和纯化处理。
dNTPs是PCR反应中的四种脱氧核苷酸三磷酸盐，分别是dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
它们是DNA合成的基本单元，在PCR反应中起到提供碱基的作用。
dNTPs的浓度需要适当控制，过高或过低都会影响PCR反应的效果。
聚合酶是PCR反应中的关键酶，它能够在适宜的温度下，在DNA模板和引物的指导下，合成新的DNA链。
常用的聚合酶有Taq聚合酶和Pfu聚合酶，它们具有高度的热稳定性和DNA聚合酶活性，适用于PCR反应的高温环境。
缓冲液是PCR反应中必不可少的成分，它可以维持PCR反应体系的pH值和离子浓度稳定，提供适宜的反应环境。
常用的PCR缓冲液包括Tris-HCl缓冲液和KCl缓冲液。
水是PCR反应体系中的溶剂，它起到稀释其他反应成分和提供体积的作用。
水的质量和纯度对PCR反应的结果有一定影响，因此需要使用去离子水或高纯水。
除了上述基本构成外，PCR反应中还可以添加其他辅助成分，如Mg2+离子、PCR增效剂和引物嵌合物等。
Mg2+离子是聚合酶活性的必需离子，能够稳定DNA双链结构和提供DNA结合的稳定性。
PCR 增效剂可以提高PCR反应的效率和特异性，减少非特异性扩增产物的生成。
(最新整理)PCR反应体系
模板
➢ 单、双链DNA均可。 ➢ 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、
DNA结合蛋白类。 ➢ DNA模板使用量一般为20-200ng。 ➢ 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 ➢ RNA模板注意保证其防止RNA降解。
其他成分
➢ RNasin（RNase Inhibitor）的作用：RNA酶 抑制剂，抑制RNA酶的活性。
➢ UNG酶的作用原理是选择性水解断裂含有dU 的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成 的有缺失碱基的DNA链，在碱性介质以及高 温下会进一步水解断裂，从而被消除。UNG 酶的最佳活性温度为50℃，95℃灭活。
其他成分
➢ 反转录酶（Reversetranscripatase）是以RNA为模板指 导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。
PCR反应体系
PCR 原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）是指在DNA聚合酶催化下， 以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等 步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
01 PCR buffer
PCR
02 Taq酶
反 应
03 dNTPs
非特异性 产物减少 扩增
导致错配 产物减少
Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的 浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
引物及探针
➢ 引物是人工合成的一段寡核苷酸序列。一般为20 个碱基。
➢ 引物的序列与模板结合的特异性是决定PCR反应 结果的关键。
➢ 探针是人工合成的在两端分别标记荧光基团的一 段寡核苷酸序列。
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标准的PCR反应体系PCR的反应体积一般有：10、20、25、40、50、100μl（一般不要低于10μl，体积过少会影响扩增效率及产物得率）PCR反应体系与反应条件--------------------------------------------------------------------------------标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umolL引物各10～100mol模板DNA 01～2ugTqDNA聚合酶25ug2+ 15mmolL加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和g2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30b，常用为20b左右。
②引物扩增跨度：以200-500b为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度01～1umol或10～100mol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种TqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量2。
5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。
dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1NH或1Tris。
HCL的缓冲液将其PH调节到70～75，小量分装，-20℃冰冻保存。
多次冻融会使dNTP降解。
在PCR反应中，dNTP应为50～200umolL，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。
浓度过低又会降低PCR产物的产量。
dNTP能与g2+结合，使游离的g2+浓度降低。
模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。
SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。
提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。
一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。
RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNse降解RNA。
g2+浓度g2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umolL时，g2+浓度为15～20mmolL为宜。
g2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
PCR反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。
在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。
对于较短靶基因(长度为100～300b时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度TqDNA酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。
一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。
此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。
变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。
由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。
退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。
对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)复性温度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允许围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。
复性时间一般为30～60se，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：TqDNA聚合酶的生物学活性：70～80℃150核苷酸S酶分子70℃60核苷酸S酶分子55℃24核苷酸S酶分子高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb 以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。
3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
循环次数循环次数决定PCR扩增程度。
PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。
一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
PCR技术概论聚合酶链反应(PolymerseCinReion,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。
它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。
过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。
PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。
PCR技术简史PCR的最早设想核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korn于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆RNA基因”。
PCR的实现1985年美国PE-Ceus公司人类遗传研究室的ullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。
其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。
PCR的改进与完善ullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶的Kleno片段，其缺点是：①Kleno酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。
②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。
此种以Kleno酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Kleno酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。
这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。
1988年初，Keonog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。
但每循环一次，仍需加入新酶。
1988年Siki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(ermusquius)中提取到一种耐热DNA 聚合酶。
此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2后其残留活性是原来的40%。
②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。
③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(20Kb)。
由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。
为与大肠杆菌多聚酶Kleno片段区别，将此酶命名为TqDNA多聚酶(TqDNAPolymerse)。
此酶的发现使PCR广泛的被应用。
PCR技术基本原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
到达平台期(Pleu)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。