斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达
斑马鱼g型溶菌酶基因序列分析及其原核表达
斑马鱼g型溶菌酶基因序列分析及其原核表达作者：陈华林晨韬陈曦葛均青来源：《南方农业学报》2022年第01期摘要：【目的】實现斑马鱼g型溶菌酶在大肠杆菌中表达，以获得高纯度且具溶菌活性的融合蛋白，为探究g型溶菌酶在斑马鱼抗菌过程中的作用机制及其开发利用打下基础。
【方法】通过ClustalW、ExPASy、SignalP-5.0 Server及PSIPRED等在线软件对斑马鱼g型溶菌酶进行生物信息分析，经密码子优化后合成斑马鱼g型溶菌酶基因，亚克隆至pET-28a（+）表达载体并转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，以IPTG进行诱导表达，并通过非干扰型蛋白浓度测定试剂盒和溶菌酶测定试剂盒（比浊法）测定其浓度及溶菌活性。
【结果】从GenBank检索获得的斑马鱼溶菌酶基因g1（NM_001002706.1）和g2（XM_002664371.5）分别命名为Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2。
Zeb-Lys-g1基因开放阅读框（ORF）长591 bp，共编码196个氨基酸残基，其编码蛋白分子量约21.6 kD;Zeb-Lys-g2的ORF长576 bp，共编码191个氨基酸残基，其编码蛋白分子量约21.1 kD;2种斑马鱼g型溶菌酶序列中均含有2个半胱氨酸残基及3个保守的催化残基位点（Glu、Asp和Asp）。
Zeb-Lys-g1的N端含有17个氨基酸的信号肽，而Zeb-Lys-g2不存在典型的信号肽结构，但其三级结构均具有多个α-螺旋结构。
在基于溶菌酶序列相似性构建的系统发育进化树中，Zeb-Lys-g1序列与金鱼g型溶菌酶序列的亲缘关系最近，而Zeb-Lys-g2序列与鲈形目和鲽形目鱼类的g型溶菌酶序列亲缘关系较近。
将合成的斑马鱼 g型溶菌酶基因（Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2）亚克隆至pET-28a（+）表达载体并转化BL21（DE3）感受态细胞，20 ℃下经IPTG（终浓度0.5 mmol/L）诱导16 h，可获得融合蛋白Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2，纯化后的浓度分别为1.01和1.66 mg/mL，对应的溶菌活性分别为689.68和44.39 U/mg。
《基因工程》课程综合实验---转基因斑马鱼的构建
《基因工程》课程综合实验---转基因斑马鱼的构建实施方案《基因工程》课程综合实验教学在专业培养目标中的定位与目标《基因工程》是生命科学学院等各专业的专业主干课，在这些专业的本科生教学计划中占有极为重要的地位。
《基因工程》也是我们学校基地班和生技专业的专业必修课，已经有10余年的开课历史。
全国其他高等综合院校都十分重视《基因工程》课程建设，绝大多数院校都将《基因工程》作为学校精品课程进行建设。
XX师X大学大学在《基因工程》教学和研究方面具有坚实的基础，2008年《基因工程》建设成为了XX省精品课程，从而为我校《基因工程》的教学改革提供了契机。
基因工程是以遗传学为理论基础的一门实践性很强的学科，是生物学科中一门体系还欠完整却发展十分迅速的学科，对探索生命的本质、推动整个生物学科的发展起着巨大的作用；同时又是一门紧密联系生产实际的实验科学，对新品种选育和良种繁育、遗传疾病防治等都具有重要的应用价值。
通过《基因工程》的学习，使学生掌握基因工程的基本原理、基本方法和最新发展动态；通过《基因工程》课程综合实验教学，使学生熟悉基因工程的基本操作方法，注重对学生的实验操作技能的培养。
基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建教学大纲课程名称：基因工程（实践课程部分）课程编号：面向专业：生物技术、生物科学、基地班课程总学时：理论51学时，实验34学时_实验学时：34_课程学分：理论3学分，实践2学分一、实验目的本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生基因工程基本实验操作、实验设计、实验结果分析和创新实验能力，通过基因工程综合实验的开设，注重学生综合素质和实践能力的培养。
二、实验内容、学时分配与组织三、教学管理模式与注意事项1．学生在实验前必须认真复习课程有关内容，预习实验指导书。
2．指导教师适当讲解相关理论及注意事项，提示具体的实验方法和操作，演示重要仪器的使用。
如何构建一个真核生物基因在大肠杆菌中高效表达的受体
争鸣如何构建一个真核生物基因在大肠杆菌中高效表达的受体余砚笈由外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理，可以从启动子、终止子、核糖体结合位点、密码子、质粒拷贝数等方面进行改善构建。
一、表达载体表达载体应具有以下条件：1、能够独立复制。
2、应具有灵活得多克隆位点和方便的筛选标记，便于外源基因的克隆、鉴定和筛选。
而且多克隆位点应位于启动子序列之后，以使外源基因表达。
3、应具有很强的启动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别。
4、应具有使启动子受抑制的阻遏子，只有在受到诱导时才能进行转录。
5、应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关基因。
6、所产生的mRNA必须有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列。
二、启动子启动子是表达载体最重要的组成成分，这是因为启动子控制了基因表达的第一个阶段，决定了mRNA合成的速度。
启动子是在转录水平上影响基因表达。
转录的最大速率取决于启动子中碱基的组成，往往会因为一个碱基的不同，启动子效率可能提高上千倍。
也就是说启动子会有强弱之分。
要获得高效表达必须选择强启动子。
由于真核基因启动子不能被大肠杆菌RNA聚合酶识别，因此必须将真核基因编码区连接在大肠杆菌RNA聚合酶能够识别的强启动子控制之下。
通常用的强启动子有lac、trp、tac、bla、λp L等，将外源基因插入这类启动子的下游，可以增加基因的表达产量。
三、终止子有效的转录终止子是表达载体必不可少的元件，因为它们具有极其重要的作用。
贯穿启动子的转录将抑制启动子的功能，造成所谓的启动子封堵。
这种效应可以通过在编码序列下游的适当位置放置一转录终止子，阻止转录贯穿别的启动子来避免。
同样地，在启动目的基因的启动子上游放置一转录终止子，将最大限度地减小背景转录。
四、核糖体结合位点1、Shine-Dalgarno（SD）序列一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16SrRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。
斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达
p53 基 因 在 大 肠 杆 菌 中 成 功 表 达 ，表 达 的 p53 融 合 蛋 白 分 子 量 大 约 为 53kD，透 析 复 性 后 获 得 了 高 纯 度
可溶性的 p53 蛋白。
关键词：p53 基因；斑马鱼；原核表达
中 图 分 类 号 ：Q786
文 献 标 识 码 ：A
文 章 编 号 ：0439－8114 （2010）03－0526-03
胞。 挑取单克隆菌落接种于 LB 培养基中，37℃摇荡 过夜， 转接扩大培养至菌液 OD600 达 0．5～0．8 时，加 入 终 浓 度 为 1 mmol ／ L 的 IPTG，37℃ 诱 导 1、3、5h 后，分别取样进行 SDS－PAGE 分析，5 h 后收集菌体 溶 于 溶 菌 缓 冲 液 （50 mmol ／ L NaH2PO4，300 mmol ／ L NaCl，10 mmol ／ L 咪唑，pH 值 8．0） 中， 超声破碎菌 体 ，12 000 r ／ min 离 心 20 min， 分 别 取 上 清 和 沉 淀 进行 SDS－PAGE 分析。 1．2．6 p53 蛋 白 的 变 性 纯 化 及 复 性 参 照 Qiagen 镍柱蛋白纯化操作步骤，在变性条件下纯化以包涵 体形式表达的 p53 蛋白。 采用尿素梯度透析法对纯 化的 p53 蛋白进行复性，尿素浓度梯度分别为 8、6、 4、2，0M。 首先将变性纯化的 p53 蛋白用变性结合缓 冲 液 （8 mol ／ L 尿 素 ，100 mmol ／ L NaH2PO4，100mM Tris－HCl， pH 值 8．0）稀释 5 倍后装入透析袋中，放 置在透析液中 （100 mmol ／ L Tris－HCl，100 mmol ／ L NaH2PO4，1 mmol ／ L EDTA，2 mmol ／ L 还原型谷胱甘 肽，0．2 mmol ／ L 氧化型谷胱甘肽，20％丙三醇，1％甘 氨酸，pH 值 8．0），4℃磁力搅拌透析 12 h， 每隔 12 h 更换含低浓度尿素的透析液，其他成分不变，最后 将 p53 透析至水中，离心去除沉淀，复性的 p53 蛋 白 冷 冻 干 燥 后 经 12％ SDS－PAGE 电 泳 检 测 后 于－ 80℃保存。
近年湖北省优秀学士学位论文
近年湖北省优秀学士学位论文：获奖时间作者指导教师论文题目2012年董亚爽艾辉基于Cytb的C.sp.5种内及八种Caenorhabditis种间的系统遗传学研究2012年李佩玉李学宝棉花GhERF218转录因子亚细胞定位及在拟南芥中功能分析2012年张倩李学宝棉花GhERF101基因的鉴定及功能研究2012年粟思韵李学宝三个AtPSP基因的克隆及其功能初步研究2012年徐博李毅人博卡病毒非结构蛋白NP1真核表达质粒的构建及其在细胞中的定位研究2012年夏诗慧刘德立柑橘青霉菌CYP51基因克隆与同源模建2012年刘文平王东湖北产紫堇属（Corydalis DC.）的分类学研究2012年贺真王玉凤铅染毒条件下Wolbachia感染对果蝇免疫途径的影响2012年罗清杨旭纳米Fe3O4通过氧化胁迫致小鼠肝脏和肾脏的组织损伤2011年张红周青春三带喙库蚊细胞凋亡调控基因iap和mx的克隆，鉴定及序列分析2011年晏荟文杨旭Moesin与细胞骨架的结合对细胞粘附分子CDX细胞迁移能2011年黄舟杨红几种不同的白蚁的分子鉴定及白蚁共生古菌多样性的比较研究2011年廖静杨旭EBV相关淋巴瘤疫苗的构建及免疫检测2011年周纯王玉凤Wolbachia感染降低了果蝇的抗铅的能力2011年吴艳任峰油菜BnPHR1启动子的克隆与分析2011年王雪梅刘胜祥湖南省黑麋峰抽水蓄能电站竣工验收环境影响评估报告（陆生生态）2011年杨媛王少辉PJ34对GSK-3激活引起的小鼠记忆障碍的保护作用2011年郑仁大崔鸿中学生物教师知识结构的初步研究2010年刘丹杨旭纳米水滑石的生物效应及载药性能研究2010年孙锐李爱英美达霉素生物合成基因med-ORF12的原核表达及多抗血清的制备2010年张华刘德立玉米黑粉菌cyp51基因上游调控区克隆与分析2010年郑燕李毅利用杆状病毒表达系统生产人类博卡病毒结构蛋白VP2的初步研究2010年刘音黎路林与小菜蛾颗粒体病毒39K发生相互作用的宿主昆虫蛋白因子的酵母双杂交分析2010年李三兰陈其才听神经元对声刺激的冲动编码和时间编码在强度识别中的意义——在体细胞内记录2010年田方云李学宝棉花223基因的原核表达载体构建和蛋白表达纯化2010年冷年华杨劭大型枝角类对铜绿微囊藻DS（Microcystis aeruginosa DS）摄食性研究2009年辛永娟吴飞键Neuregulin 1-ErbB4信号转导系统在颞叶癫痫发生发展过程中的作用2009年孙萍萍杨继红羊轮状病毒的分离纯化及其单克隆抗体的制备2009年王红蕾丁书茂单壁碳纳米管对小鼠肝和肾氧化损伤的诱导2009年孙含丽黎路林大肠杆菌中人源受体酪氨酸激酶TrKA-Ig2的克隆，表达纯化和初步结晶研究2009年彭博李毅家蚕浓核病毒伊那株非结构蛋白基因的克隆与蛋白纯化2009年杨玲玲李学宝棉花HL325基因克隆及其在拟南芥中的功能分析2009年李佳芮彭建新自噬作用对两种鳞翅目昆虫细胞凋亡的不同影响2009年谭刚王玉凤中国六个不同地理种群拟果蝇中Wolbachia感染检测及其wsp基因序列分析2009年肖晗任峰拟南芥AtCIPK17基因克隆及转基因分析2009年邓玉杰丁书茂运用RAPD图谱技术对气态甲醛致小鼠骨髓细胞DNA损伤的遗传毒性研究2009年周起超程凯CO2浓度倍增对噬藻体PP增殖能力和光修复作用的影响2009年雷明祁超硒多糖抗癌药物的研究2008年魏晨曦丁书茂久效磷人工抗原的合成与鉴定2008年梅杨王玉凤转录因子FOXO3a对hPDGFRα表达调控的初步研究2008年刘克金刘凯于昆虫细胞自噬对其凋亡的影响2008年周颖李学宝棉花ARFL蛋白的筛选鉴定2008年张志霞刘德立甲基对硫磷降解菌的分离鉴定和降解特性研究2008年郭靖杨旭邻苯二甲酸丁基苄酯对小鼠肝脏细胞DNA 损伤作用的研究2008年李文英熊丽DBP对斑马鱼肝脏和鳃中SOD活性的影响2008年周洁李文新鲫鱼肝脏GPT动力学特性。
淀粉酶基因的构建及其在大肠杆菌(amp+)中的表达
淀粉酶基因的构建及其在大肠杆菌（amp+）中的表达一、相关背景淀粉酶是较早发现的酶类之一，早在1833年Payen和Persoz已首次从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀分离到淀粉酶。
1894年高峰让吉从米曲霉(Aspergillus oryzae)中提取出作为消化剂的酶，即高峰淀粉酶。
1919年法国Boidin和Effront首次用枯草杆菌生产淀粉酶。
淀粉酶(amylase，AMY,AMS)是作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α－1，4-葡聚糖，水解α－1，4-糖苷键的酶类的总称。
现在淀粉酶大致可分为四大类:第一类α-淀粉酶，广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。
第二类β-淀粉酶(EC3.2.1.2)从底物非还原性末端顺次水解每隔一个α-1,4糖苷键，切下的是麦芽糖单位。
第三类葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3）,习惯上简称糖化酶，从底物的非还原性末端顺次水解α-1，4糖苷键和分支的α-1,6键生成葡萄糖。
第四类解枝酶或异淀粉酶(EC3.2.1.9)只水解糖原或支链淀粉分支点α-1,6糖苷键，切下整个侧枝。
还有淀粉α-1，6葡萄糖酶是在分支点的葡萄糖单位仅一个时起作用。
淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶退浆机械作用小，水的用量少，可以在低温条件下达到退浆效果，具有鲜明的环保特色。
除此之外，不同性质的α-淀粉酶还具有许多不同的用途。
耐热性α-淀粉酶，由于使用时温度提高，液化完全，用酶量少，操作比较容易，β-淀粉酶在食品工业中主要用于制造麦芽糖浆、啤酒、面包、酱油等。
在制醋工业中，常用β-淀粉酶代替部分麸曲节省成本，在白酒和其他工业中也可以用其作糖化剂。
在医药工业上，β-淀粉酶的一个重要用途是制造麦芽糖，医学上常用该酶和α-淀粉酶一道作为消化剂使用。
二、目前研究情况1 .国内外研究机构由于α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶，国内外很多课题组对它进行了研究。
什么是大肠杆菌DH5α菌株？斑马鱼是一种怎么样的模式动物？
什么是大肠杆菌DH5α菌株？斑马鱼是一种怎么样的模式动物？2021年6月高考试题中，选修3测试是一道斑马鱼模式动物为情景的试题。
内容涵盖体外受精、胚胎发育、基因工程、环境水质监测、药物毒性与安全性评价等。
问题：什么是大肠杆菌D H5α菌株？斑马鱼是一种怎么样的模式动物？什么是克隆载体？什么是表达载体？试题：（2021年6月浙江选考试题）斑马鱼是一种模式动物，体外受精发育，胚胎透明、便于观察，可用于水质监测、基因功能分析以及药物毒性与安全性评价等。
（1）由于人类活动产生的生活污水日益增多，大量未经处理的污水直接排人河流、湖泊会引起水体，导致藻类大量繁殖形成水华。
取水喂养斑马鱼，可用斑马鱼每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。
（2）为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用D N A连接酶将该基因连接到质粒载体形成，导入到大肠杆菌菌株D H5α中。
为了能够连接上该目的基因、并有利于获得含该目的基因的D H5α阳性细胞克隆，质粒载体应含有（答出2点即可）。
提取质粒后，采用法，将该基因导入到斑马鱼受精卵细胞中，培养并观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。
（3）为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选，可用分散斑马鱼囊胚的内细胞团，取分散细胞作为初始材料进行培养。
培养瓶中添加成纤维细胞作为，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。
答案：（1）富营养化（2）重组D N A分子；限制性核酸内切酶的识别序列、抗生素抗性基因；显微注射（3）胰蛋白酶；原代；饲养层细胞解析：（1）未经处理的污水中含有大量磷元素，排入河流、湖泊会引起水体的富营养化。
（2）重组D N A是将目的基因（外源D N A分子）用D N A连接酶在体外连接到适当的载体（如质粒）上，形成重组D N A分子；质粒载体应含有限制性核酸内切酶的识别序列，以便目的基因能成功插入到质粒载体上，质粒载体还应含有标记基因如抗生素抗性基因，以便检验目的基因是否导入；将目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法。
斑马鱼 SFPQ 蛋白的原核表达及纯化
斑马鱼 SFPQ 蛋白的原核表达及纯化杨川;胡敏【摘要】Splicing Factor Proline and Glutamine Rich 简称为 SFPQ，是广泛表达在脊椎动物中的一类蛋白。
它作为抑癌基因，对生物体内肿瘤发生具有重要的调控作用。
目前对于 SFPQ 的研究主要集中在人和小鼠上，对于斑马鱼 SFPQ 的研究还比较少。
为了获得原核表达的 SFPQ 蛋白进行下一步研究，构建了斑马鱼SFPQ-pET28a 重组质粒，然后转化到 BL21化学感受态细胞中，探索用 IPTG 进行低温诱导蛋白的最适条件，然后用 Ni-NTA 琼脂糖镍柱纯化 SFPQ 蛋白。
实验结果表明，当 IPTG 浓度为0.75 mmol/L，诱导时间为10 h 时，蛋白表达量最大，Western blot 结果表明纯化得到的斑马鱼 SFPQ 蛋白可以和抗体特异性结合，说明纯化得到的斑马鱼 SFPQ 蛋白可以用于下一步实验。
%Splicing Factor Proline and Glutamine Rich(SFPQ)is a protein that expresses widely in vertebrates. As a tumor suppressor gene, it plays the vital regulation role in tumorigenesis of living organisms. So far the researches of SFPQ were focused on human being and mice, little has been known about the SFPQof zebrafish. In order to acquire the prokaryotic-expressed SFPQ proteinfor further research, recombinant pET28a-SFPQ plasmid of zebrafish was constructed and transformed into the chemical competent cells of BL21. The optimal condition was explored while IPTG was applied to induce the expression of zebrafish SFPQ protein in low-temperature, and the SFPQ protein was purified by Ni-NTA agarose nickel column. The results demonstrated that the expression of the protein was the most while inducing for 10 h by 0.75 mmol/L IPTG at 27℃. The results of Weste rn blotrevealed that the purified SFPQ protein specifically bound with the antibody, indicating that the purified zebrafish SFPQ protein may be utilized in the further experiments.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2016(000)001【总页数】6页(P163-168)【关键词】斑马鱼SFPQ;原核表达;蛋白纯化【作者】杨川;胡敏【作者单位】四川大学生命科学学院，成都 610041;四川大学生命科学学院，成都 610041【正文语种】中文脯氨酸、谷氨酰胺的剪接因子（Splicing factor proline and glutamine rich，SFPQ），最先被人们发现与前体mRNA剪切相关的蛋白，分子量为72 kD，由707个氨基酸组成，碱基序列中GC含量丰富，为广泛分布在动物体内的核蛋白［1，2］。
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斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达
作者：赵向忠刘明丁丽丽吴宁林秀坤
来源：《湖北农业科学》2010年第03期
摘要：利用原核表达系统克隆表达斑马鱼p53基因。
RT-PCR法从斑马鱼胚胎中扩增获得p53基因编码区，并将其克隆至原核表达栽体pET28a上，构建重组质粒pET28a／z—p53，将重组质粒转化E coli BL21(DE3)受体茵，IPTG诱导表达，表迭产物经镍柱纯化、尿素透析复性，SDS—PAGE电泳分析，结果表明，p53基因在大肠杆菌中成功表达，表达的p53融合蛋白分子量大约为53kD，透析复性后获得了高纯度可溶性的p53蛋白。
关键词：p53基因；斑马鱼；原核表达
中图分类号：Q786
文献标识码：A。