牛支原体及其脂质相关膜蛋白诱导胎牛肺细胞IL-1β表达的分子机制研究

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牛支原体黏附素及黏附素结合蛋白研究进展

畜牧兽医学报 2023,54(8):3206-3216A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.08.008开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):牛支原体黏附素及黏附素结合蛋白研究进展武琪,张玉娟,刘桐,辛九庆*,徐青元*(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨150069)摘要:牛支原体(M .b o v i s )是感染牛的一种重要病原体,可导致感染牛出现肺炎㊁关节炎㊁乳房炎㊁角膜结膜炎和生殖道炎等多种临床症状,给养牛业造成了巨大经济损失㊂M .b o v i s 黏附素在M .b o v i s 致病过程中发挥重要作用,包括病原感染㊁细胞入侵㊁免疫逃逸和毒力产生㊂迄今为止,已鉴定出十多种M .b o v i s 黏附素㊂这些黏附素主要结合宿主细胞的纤溶酶原(p l a s m i n o g e n ,P l g )㊁纤连蛋白(f i b r o n e c t i n ,F N )㊁硫酸肝素(h e pa r i n s u l f a t e ,H S )和淀粉样前体样蛋白-2(a m yl o i d p r e c u r s o r -l i k e p r o t e i n -2,A P L P 2)㊂本文将对目前已知的M .b o v i s 黏附素及其宿主细胞靶蛋白的研究现状进行综述,为M .b o v i s 已知和未知黏附素的鉴定和应用提供参考㊂关键词:M y c o pl a s m a b o v i s ;黏附素;黏附素结合蛋白中图分类号:S 852.62 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)08-3206-11收稿日期:2022-12-16基金项目:国家自然基金面上项目(31872468)作者简介:武琪(1998-),女,河南三门峡人,硕士生,主要从事动物传染病及其病原分子流行病学研究,E -m a i l :3468704132@q q.c o m *通信作者:辛九庆,主要从事动物传染病及其病原分子流行病学研究,E -m a i l :x i n j i u q i n g @ca a s .c n ;徐青元,主要从事动物传染病及其病原分子流行病学研究,E -m a i l :x u q i n g yu a n @c a a s .c n R e s e a r c h P r o g r e s s o f M y c o p l a s m a b o v i s A d h e s i n s a n d A d h e s i n -b i n d i n g Pr o t e i n s WU Q i ,Z H A N G Y u j u a n ,L I U T o n g ,X I N J i u q i n g *,X U Q i n g yu a n *(S t a t e K e y L a b o r a t o r y o f V e t e r i n a r y B i o t e c h n o l o g y ,H a r b i n V e t e r i n a r y R e s e a r c h I n s t i t u t e ,C h i n e s e A c a d e m y o f A gr i c u l t u r a l S c i e n c e s ,H a r b i n 150069,C h i n a )A b s t r a c t :M y c o pl a s m a b o v i s (M .b o v i s )i s a n i m p o r t a n t p a t h o g e n t h a t i n f e c t s c a t t l e ,w h i c h c a n l e a d t o a v a r i e t y o f c l i n i c a l s y m p t o m s s u c h a s p n e u m o n i a ,a r t h r i t i s ,m a s t i t i s ,k e r a t o c o n ju n c t i v i t i s a n d g e n i t a l t r a c t i t i s i n i n f e c t e d c a t t l e ,c a u s i n g h u g e e c o n o m i c l o s s e s t o t h e c a t t l e i n d u s t r y.M .b o v i s a d h e s i n s p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n p a t h o g e n e s i s o f M .b o v i s ,i n c l u d i n g p a t h o ge n i c i nf e c -t i o n ,c e l l i n v a s i o n ,i mm u n e e v a s i o n ,a n d v i r u l e n c e p r o d u c t i o n .S o f a r ,m o r e t h a n t e n k i n d s o fM .b o v i s a d h e s i n s h a v e b e e n i d e n t i f i e d .T h e s e a d h e s i n s p r i m a r i l y b i n d p l a s m i n o g e n (P l g),f i b r o n e c t i n (F N ),h e p a r i n s u l f a t e (H S ),a n d a m yl o i d p r e c u r s o r -l i k e p r o t e i n -2(A P L P 2)o f h o s t c e l l s .T h i s a r t i c l e w i l l r e v i e w t h e c u r r e n t r e s e a r c h s t a t u s o f M .b o v i s a d h e s i n s a n d t h e i r h o s t c e l l t a r g e t pr o t e i n s ,a n d p r o -v i d e r e f e r e n c e f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n a n d a p pl i c a t i o n o f k n o w n a n d u n k n o w n a d h e s i n s o f M .b o v i s .K e y wo r d s :M .b o v i s ;a d h e s i n ;a d h e s i n -b i n d i n g p r o t e i n *C o r r e s p o n d i n g au t h o r s :X I N J i u q i n g ,E -m a i l :x i n j i u q i n g @c a a s .c n ;X U Q i n g y u a n ,E -m a i l :x u -q i n g yu a n @c a a s .c n 牛支原体(M y c o pl a s m a b o v i s ,M .b o v i s )又称牛霉形体,属于原核生物界软壁菌门柔膜体纲支原体目支原体科支原体属,无细胞壁,基因组大小约为1080k b ㊂M .b o v i s 最早于1961年在美国患有乳8期武琪等:牛支原体黏附素及黏附素结合蛋白研究进展腺炎奶牛的牛乳中分离到[1],20世纪90年代,在欧洲和北美牛场流行㊂2008年,辛九庆等[2]首次从我国患肺炎的犊牛肺中分离到M.b o v i s,随后湖北甘肃等地相继出现M.b o v i s感染病例[3-4]㊂易感动物主要通过呼吸道㊁乳头管或生殖道感染M.b o v i s,带菌精液的人工授精也是一种常见的传播途经[5]㊂M.b o v i s可侵袭牛的肺㊁乳腺㊁关节㊁角膜㊁生殖道等器官,进而引起感染牛出现肺炎㊁关节炎㊁乳房炎㊁角膜结膜炎和生殖道炎等临床症状,并且不同年龄不同品种牛均可感染[6]㊂M.b o v i s与某些病原体还存在协同作用,常导致混合感染,如溶血性曼氏杆菌㊁多杀性巴氏杆菌㊁睡眠嗜组织菌㊁化脓隐秘杆菌[7]以及牛呼吸道合胞病毒㊁副流感3型病毒㊁腺病毒㊁牛病毒性腹泻病毒及牛传染性鼻气管炎病毒[7-8]㊂从M.b o v i s首次分离至今虽已过去数十年,但是由于存在缺乏基因组操作方法和昂贵的动物模型等不利因素,导致其诊断㊁治疗和疫苗的研究进展缓慢,此外,虽然有许多关于M.b o v i s体内和体外感染研究,但对牛支原体的致病机制仍知之甚少㊂M.b o-v i s通过黏附素结合于宿主细胞,进而实现对宿主组织的定植和感染,其致病性与其黏附能力密切相关㊂因此本文主要对M.b o v i s黏附素和黏附素结合蛋白的研究进展进行综述,以期为M.b o v i s致病及免疫逃逸机制和今后M.b o v i s已知未知黏附素的鉴定和应用提供参考㊂1M.b o v i s与宿主细胞的黏附M.b o v i s感染的第一步是在宿主体内定植,而黏附于特定的靶细胞是定植的前提,因此黏附是M.b o v i s感染的关键步骤㊂与肺炎支原体和生殖道支原体不同,M.b o v i s没有行使黏附功能的特殊细胞器,但M.b o v i s可以表达具有黏附功能的膜蛋白介导其与宿主之间的黏附并在调节宿主防御方面发挥重要作用,包括炎症因子的产生和免疫细胞的凋亡[7,9-10]㊂此外,M.b o v i s的一些代谢物如核酸酶㊁过氧化氢也可诱导宿主产生炎症反应[11]㊂这些对宿主造成的损伤都与黏附蛋白在病理生理过程中发挥的作用密切相关㊂M.b o v i s虽然主要感染牛,但对绵羊[12]㊁山羊[13]㊁猪[14]㊁鹿[15]和人类[16]的感染也有报道,现已从感染牛的呼吸道㊁乳房㊁关节㊁心㊁大脑等多个器官分离到M.b o v i s[17-18]㊂M.b o v i s还能黏附多种类型的宿主细胞包括胎牛肺细胞(E B L)㊁牛肾细胞(M D B K)㊁兔肾细胞(R K)和胚胎牛气管细胞(E B T r)[19],M.b o v i s对不同细胞的黏附导致病原体向不同定植点传播可能是其多种临床表现的原因,同时也可能与其逃避免疫系统杀伤以及削弱抗生素的治疗效果相关㊂这种M.b o v i s感染多种动物㊁组织和细胞的现象表明,M.b o v i s的黏附素可能是复杂多样的㊂当前M.b o v i s的疫苗产品和M.b o v i s的检测方法还有很大的改进空间,而且M.b o v i s非常容易产生耐药性,致使M.b o v i s疾病的预防㊁控制和清除均非常困难[20]㊂考虑到黏附素在M.b o v i s感染和致病方面的重要作用,理论上可将其做为疫苗的候选成分㊂此外,许多黏附素具有良好的免疫原性和反应原性,具备建立血清学检测方法的潜力㊂2M.b o v i s黏附素迄今为止,已鉴定出16种蛋白参与M.b o v i s 的黏附(表1)㊂其中7种黏附素具有明确的宿主结合蛋白,3种黏附素可以与两种不同的宿主蛋白相互作用(图1),4种黏附素除了具有结合功能外,还具有酶活性㊂以下将对这些黏附素的发现过程㊁以及部分生物学特性进行详细的阐述,以期为M.b o-v i s黏附蛋白的研究与应用提供思路㊂2.1N A D H氧化酶N A D H氧化酶(N A D H o x i d a s e,N O X)黏附素包含454个氨基酸,相对分子质量(M r)为49k u,无信号肽或跨膜区,分布于M.b o v i s的细胞质和细胞膜㊂有些细菌如肺炎链球菌的N O X具有黏附活性并且该蛋白高度保守[21]㊂Z h a o等[22]发现M.b o v i s 基因组中存在n o x基因的同源物,因此推测该同源物可能是M.b o v i s的黏附素并且具有酶活性㊂分析发现M.b o v i s的n o x基因与肺炎链球菌和化脓性链球菌基因相似性分别为39%和42%㊂研究证实原核重组N O X(r N O X)能与E B L细胞的细胞膜和细胞质蛋白结合,并与膜蛋白的结合强于细胞质蛋白㊂此外,r N O X能催化N A D H为N A D+同时产生H2O2,其催化位点和黏附位点相互独立㊂r N O X蛋白和抗r N O X血清均能阻断M.b o v i s对E B L细胞的黏附㊂与野生型菌株相比,N O X蛋白缺陷菌的黏附性和过氧化氢产量下降㊂包世俊等[23]还发现在补体存在下N O X黏附素抗体对M.b o v i s的杀菌率高达57.86%㊂Z h a o等[22]用r N O X包被E L I S A板筛选人肺c D N A文库的T7噬菌体证实r N O X可以特异性地黏附在A P L P-2和F N上㊂7023畜牧兽医学报54卷表1 M .b o v i s 黏附素信息汇总T a b l e 1 S u m m a r y of M .b o v i s a d h e s i n i n f o r m a t i o n 黏附素A d h e s i n N CB I 蛋白I DN C B I P r o t e i n I D氨基酸数N o .o f a a相对分子质量/k u M r (k u )等电点I s o e l e c t r i cpo i n t 靶蛋白T a r g e t pr o t e i n 抗原性A n t i g e n i c i t y 保守性Co n s e r v a t i s m 细胞定位C e l l u l a rl o c a l i z a t i o nN O X W P _013954704.1454495.98A P L P -2F N 未知高细胞膜细胞质F B A W P _013954544.1291346.25P l g F N 有高细胞膜细胞质M b f N A D R 25360.1612968.98H S F N有未知细胞膜α-烯醇酶α-e n o l a s e A E I 90157.145449.3695.27P l g 有高细胞膜细胞质M i l AA D R 24994.126703038.71H S 有未知细胞膜细胞外T r m F O A E I 89864.142748.86.43F N 有高细胞膜细胞质V pm a X A E I 90145.1229355.65未知未知低全细胞M B O V _0503A F M 51859.154859.489.14未知未知未知细胞膜P 27MB O V _R S 0344024127.19.26F N有高全细胞P 26未知未知32未知未知有未知未知24k u未知未知24未知未知未知低未知V S P s未知未知未知未知未知有低细胞膜V S P s 包括V s p A ㊁V s p B ㊁V s p C ㊁V s p E 和V s p F V S P s i n c l u d i n g V s p A ,V s p B ,V s p C ,V s p E a n d V s pF 图1 M .b o v i s 黏附素与黏附素结合蛋白互作F i g .1 I n t e r a c t i o n o f M .b o v i s a d h e s i n s a n d a d h e s i n -b i n d i n g pr o t e i n s 2.2 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(f r u c t o s e -1,6-b i s ph o s -ph a t e a l d o l a s e ,F B A )是糖酵解㊁糖异生和卡尔文循环过程中的关键酶[24],这种酶催化果糖-1,6-二磷酸可逆转化为甘油醛-3-磷酸和磷酸二羟基丙酮㊂除能量代谢外,F B A 还具有许多生物学功能,包括作为P l g 结合蛋白㊁转录调节因子㊁抗真菌剂的靶标和参与宿主细胞黏附[25-29]㊂H u a n g 等[30]和Ga o 等[31]对M .b o v i s 的F B A 进行了研究,发现该蛋白是M .b o v i s 的黏附素,并证实了该黏附素的结合蛋白为F N 和P l g㊂M .b o v i s 的F B A 黏附素包含291个氨基酸,M r 为34k u,无信号肽和跨膜区,分布于细胞质和细胞膜中,具有免疫原性㊂F B A 在支原体中高度保守,M .b o v i s 不同菌株中的F B A 相似性高达99%,与其它支原体的相似性高达60%㊂原核表达的重组M .b o v i s F B A (r M b F B A )能将N A D H 转化为N A D+,兔抗r M b F B A 血清在补体存在下可杀死44.1%的M .b o v i s ,r M b F B A 抗体可阻断34.4%的M .b o v i s 对E B L 细胞的黏附㊂80238期武琪等:牛支原体黏附素及黏附素结合蛋白研究进展2.3M.b o v i s纤维连接蛋白结合脂蛋白A d a m u等[32]在研究支原体脂蛋白的生化作用时,通过生物信息学分析发现一个富含亮氨酸重复(l e u c i n e-r i c h r e p e a t,L R R)的脂蛋白可能具有黏附活性㊂进一步研究发现该蛋白由m b f N基因编码,该基因位于M.b o v i s P G45菌株核苷酸654047和655885之间㊂完整的L R R蛋白包含612个氨基酸,M r为96k u,等电点为8.98,有信号肽无跨膜区,主要分布于M.b o v i s细胞膜表面,具有免疫原性㊂L R R黏附素的226―284残基中存在一个G 蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白1(G I T1)样结构域,该结构域在真核生物的细胞黏附㊁运动㊁细胞骨架重塑和跨膜运输中发挥重要作用㊂L R R蛋白具有完整蛋白和C端147个氨基酸缺失两种形态,具体表现为蛋白质电泳中呈现出70和48k u两种条带㊂由于该L R R蛋白是第一个发现与F N结合的M.b o v i s脂蛋白,因此被命名为M.b o v i s纤维连接蛋白结合脂蛋白(M.b o v i s f i b r o n e c t i n-b i n d i n g l i p o-p r o t e i n,M b f N)㊂重组M b f N(r M b f N)与F N的结合呈剂量依赖性,在一定浓度下可达到饱和黏附,抗r M b f N蛋白抗体可特异性阻断该反应㊂与野生型菌株P G45相比,被转座子破坏M b f N开放阅读框的突变菌株黏附能力显著降低,且抗r M b f N抗体可显著降低M.b o v i s对M DB K细胞的黏附㊂体外结合试验表明该蛋白还可以结合H S㊂2.4α-烯醇酶S o n g等[33]发现许多细菌中存在α-烯醇酶(α-e n o l a s e),这种酶的存在与细菌和宿主细胞的黏附密切相关,但是这种现象尚未在M.b o v i s中得到证实㊂该团队分析发现M.b o v i s湖北株中存在α-烯醇酶的编码基因,该基因编码454个氨基酸,蛋白M r为49.369k u,等电点为5.27,无信号肽和跨膜区㊂M.b o v i s湖北株的α-烯醇化酶与其他支原体物种的相似性可超过90%,是一种高度保守的蛋白㊂该蛋白包含典型的P l g结合基序,包括赖氨酸作为C端残基(F Y N I K)和保守的带正电荷富赖氨酸内部基序(L Y D E N S K K Y)㊂进一步研究证实,α-烯醇化酶分布于M.b o v i s的细胞膜和可溶性胞质蛋白组分中,具有抗原性㊂同时他们还发现在对细胞进行P l g预处理后可以使M.b o v i s对E B L细胞的黏附率提高11.9%,胰蛋白酶对此株菌进行蛋白水解也可以增强M.b o v i s对E B L细胞的黏附,并且比单独使用P l g处理细胞更有效㊂兔抗α-烯醇化酶血清可以抑制M.b o v i s对P l g预处理后的E B L细胞的黏附,而未经过P l g预处理的细胞黏附则不受影响㊂配体印迹试验和E L I S A试验证明该黏附素结合蛋白为P l g,呈剂量依赖式,并且这种结合可以被抗α-烯醇化酶血清所抑制㊂2.5支原体免疫原性脂肪酶AS h a r m a等[34]和L e e[35]通过转座子诱变研究M.b o v i s基因功能时发现m i l A基因所编码的支原体免疫原性脂肪酶A(M y c o p l a s m a i mm u n o g e n i c l i p a s e A p r o t e i n,M i l A)可能在M.b o v i s中发挥重要作用㊂A d a m u等[36]为了进一步探索该蛋白的生物功能,利用生物信息学技术对该蛋白的功能域和生物学活性进行了识别和预测,并通过试验证实该蛋白具有黏附素活性,能与H S和1-苯胺萘-8-磺酸各种脂质结合㊂序列分析表明,M i l A黏附素包含经典的H S结合基序 X B B X B X ,并且具有与A T P相互作用的残基,在其它支原体物种中也存在M i l A 的同源物㊂M i l A黏附素编码基因位于M.b o v i s P G45基因组814575和822587之间,包含2670个氨基酸,M r为303k u,等电点为8.71,具有信号肽和跨膜区㊂该黏附素是一种膜表面蛋白,它的N 端(M i l A-a b)和C端(M i l A-E F)具有免疫原性,而中间部分(M i l A-C D)没有明显的免疫反应性㊂M i-l A在表达后被水解成226和50k u的两个片段, 226k u片段可被抗M i l A-a b和抗M i l A-E F血清识别,而50k u片段仅被抗M i l A-E F血清识别㊂M i l A 黏附素的M i l A-E F具有A T P酶活性,而M i l A-C D 不具有该酶活性㊂他们还发现226k u的M i l A可以在培养上清中检测到,说明M i l A可能会分泌到培养基中或翻译后从细胞表面裂解㊂M i l A-E F抗血清在体外可抑制M.b o v i s3683株的增殖,针对M i l A其他区域的抗血清则不影响该菌株的生长㊂H S可与M i l A-a b和M i l A-E F结合,但与M i l A-C D 不结合,这与M i l A的N端和C端存在H S结合基序的序列分析结果相符㊂2.6亚甲基四氢叶酸t R N A-(尿嘧啶-5-)-甲基转移酶亚甲基四氢叶酸t R N A-(尿嘧啶-5-)-甲基转移酶[m e t h y l e n e t e t r a h y d r o f o l a t e t R N A-(u r a c i l-5-)-m e t h y l t r a n s f e r a s e,T r m F O]包含427个氨基酸, M r为48.8k u,等电点为6.43,无信号肽和跨膜区,分布于细胞质和细胞膜中,具有抗原性[37]㊂该蛋白的保守性较高,在M.b o v i s不同菌株间的相似性超9023畜牧兽医学报54卷过98%㊂同时T r m F O是一种保守的黄素二核苷酸(F A D)结合蛋白,已被鉴定为t R N A修饰酶的成员负责叶酸依赖的m5U-54生物合成[38]㊂G u o等[37]在开发M.b o v i s减毒疫苗时发现,体外传代150代的M.b o v i s H B0801株的T r m F O蛋白表达水平下调,同时N O X以及可变脂蛋白V s p X这两种已被鉴定的黏附素表达也发生了下调㊂在此基础上,该团队对T r m F O的生物学功能开始进一步的验证㊂研究发现,T r m F O可以黏附于E B L细胞,兔抗T r m F O抗体可显著降低T r m F O和M.b o v i s对该细胞的黏附,并且该抗体在补体存在下显示出有效的M.b o v i s杀伤能力㊂进而证实了T r m F O是一种M.b o v i s黏附素,该黏附素的结合蛋白F N也在该项研究中通过免疫学试验证实㊂2.7可变表面脂蛋白A辛九庆团队对M.b o v i s H u b e i-1株进行全基因组分析时发现了一个独特的基因v p m a X,该基因被注释为v s p A,但是序列比对结果表明该基因编码蛋白与V s p A差异很大,因此将其编码蛋白命名为可变表面脂蛋白A(v a r i a b l e s u r f a c e l i p o p r o t e i n A, V p m a X)[39]㊂V p m a X是一种由229个氨基酸组成的大小约为35k u的膜蛋白㊂序列分析表明该蛋白具有典型的原核信号肽和两个重复单元,即 K P S E-Q G S G T N S Q Q G S G 和 Q G S G ,其中大单元重复3次,小单元重复7次,这一结构特征与V S P家族蛋白非常相似㊂由于M.b o v i s H u b e i-1株基因组缺失v s p基因簇,因此他们推测该蛋白可能是一个黏附蛋白㊂同时他们还发现同样从湖北省分离的M.b o v i s H B0801中的V s p X的蛋白序列与M.b o v i s H u b e i-1菌株的V p m a X的具有100%相似性,这与M.b o v i s标准株差异较大㊂进一步研究发现,原核生物表达的r V p m a X蛋白可以直接黏附到E B L细胞上,抗r V p m a X血清可以阻断此蛋白的黏附㊂在鉴定V p m a X的过程中他们发现一个有趣的现象,当r V p m a X的浓度较低时,该蛋白主要黏附于E B L 细胞的表面,当r V p m a X的浓度较高时,该蛋白可以进入E B L的细胞质,这表明此蛋白可能与M.b o-v i s入侵细胞有关㊂该团队在后续研究中发现试验所用的M.b o v i s H u b e i-1株在含有抗r V p m a X血清的培养基中传至第5代时会表达一种分子量为55k u的新蛋白与兔抗r V p m a X血清反应,这表明该蛋白可能与M.b o v i s H u b e i-1株的免疫逃逸有关㊂以上研究表明V p m a X是一种M.b o v i s黏附素,且这种黏附素可能与M.b o v i s的细胞入侵和逃逸宿主免疫相关㊂2.8M B O V_0503编码蛋白Z h u等[40]建立了M.b o v i s H B0801转座子突变文库,筛选出9株黏附能力下降的菌株,其中M B O V_0503蛋白突变株特性最稳定,该蛋白的突变株对E B L细胞的黏附减少了近10倍㊂经分析M B O V_0503黏附蛋白包含548个氨基酸,M r为59.48k u,无信号肽,具有跨膜区㊂研究证实M B O V_0503蛋白是一种膜表面蛋白可直接黏附于E B L细胞表面,与E B L细胞膜蛋白结合并且呈剂量依赖性㊂此外,该蛋白能在一定程度上影响M.b o v i s与宿主细胞的黏附㊂进一步研究发现, M B O V_0503黏附蛋白的缺失导致突变体跨越细胞屏障的能力显著下降,但并没有影响突变体的增殖㊂以上研究结果表明M B O V_0503蛋白是一种M.b o v i s黏附素,且该黏附素可能与病原菌入侵细胞能力有关㊂2.9P27蛋白郭爱珍团队[41]对M.b o v i s H B0801株进行基因组分析时发现由M B O V_R S03440基因编码的一个27k u的P27蛋白被注释为一个假定的脂蛋白,该蛋白包含4个富亮氨酸的重复序列(L R R s),有文献证实这种重复序列与细胞黏附㊁细胞运输㊁酶抑制和激素受体相互作用有关[42],因此他们推测该蛋白可能是一种M.b o v i s黏附素,并通过试验证实了这一假设㊂P27黏附蛋白包含241个氨基酸,有信号肽,无跨膜区,有抗原性㊂该蛋白分布于整个细胞但大部分暴露在表面,其氨基酸序列高度保守,M.b o v i s不同菌株间相似性可达100%,与其他支原体物种的同源蛋白也具有高度的同源性㊂研究表明重组P27可直接黏附于E B L细胞上,抗P27血清可特异性阻断M.b o v i s黏附㊂同时他们还证实了P27的靶蛋白为F N,并且二者相互作用具有剂量依赖性㊂2.10P26蛋白B e r t h o l d等[43]使用M.b o v i s J282菌株的全菌体蛋白作为免疫原制备单克隆抗体,其中一株识别26k u蛋白的抗体4F6具有良好的特异性㊂S a c h s e 等[44]发现M.b o v i s对E B L细胞的黏附可以被该单克隆抗体4F6特异性的阻断㊂P26黏附蛋白是一种亲水性的32k u蛋白,具有抗原性[45]㊂进一步研究发现,M.b o v i s120菌株中P26蛋白表达量高于菌01238期武琪等:牛支原体黏附素及黏附素结合蛋白研究进展株454,在非阻断条件下120菌株对E B L细胞的黏附能力高于454菌株,当使用单克隆抗体4F6阻断时发现120和454株M.b o v i s对E B L细胞的黏附分别降低46%和70%,这表明P26蛋白在M.b o v i s 与E B L细胞的黏附过程中可能发挥着重要作用㊂在他们后期的研究中发现当P26蛋白与M.b o v i s 总蛋白的比例为1ʒ100时,可阻断20%~50%M.b o v i s的黏附[45]㊂这些结果充分证明了P26蛋白是M.b o v i s的一种黏附蛋白㊂2.1124k u蛋白有报道称M.b o v i s2610P116(体外传至第116代)菌株比M.b o v i s2610P7(体外传至第7代)菌株的黏附率下降2.5倍~6倍[46]㊂T h o m a s等[46]利用二维电泳对M.b o v i s2610P116菌株和M.b o v i s 2610P7菌株所表达的蛋白进行分析,发现一个M r 为24k u的蛋白在高传代菌株中表达量显著降低㊂对此24k u蛋白进行质谱分析发现,该蛋白与M.b o v i s数据库中的已知序列均不匹配㊂胰酶消化试验结果表明该蛋白是一种膜蛋白㊂进一步研究发现针对该蛋白的抗血清或单克隆抗体都可降低2610p7株与B B E细胞的黏附㊂以上研究表明该蛋白是一种M.b o v i s黏附素㊂2.12膜表面可变脂蛋白家族蛋白(V S P s)在M.b o v i s标准株P G45基因组中,编码膜表面可变脂蛋白家族蛋白(m e m b r a n e s u r f a c e v a r i a b l e l i p o p r o t e i n f a m i l y p r o t e i n s,V S P s)的基因簇由15个开放阅读框组成,其中13个编码V S P s[47]㊂所有V S P蛋白的氨基端都有一个相似性超过99%的保守原核信号肽锚定在细胞膜上,并且都具有抗原性㊂T h o m a s等[48]通过阻断试验发现识别V s p C和V s p F的单克隆抗体9F1和2A8能够抑制M.b o v i s 对B B E细胞的黏附,单克隆抗体1E5也具有一定的阻断能力,这表明V s p C和V s p F可能是一种黏附素㊂S a c h s e等[49]在对M.b o v i s的V s p A㊁V s p B㊁V s p E和V s p F的免疫原性和黏附性研究中发现并鉴定出这些序列都含有重复序列㊂用人工合成的重复序列或针对这些序列的特异性抗体进行M.b o v i s 黏附抑制试验,结果表明V s p A㊁V s p B㊁V s p E和V s p F以及抗V s p A㊁V s p B和V s p F的单克隆抗体都可降低M.b o v i s对宿主细胞的黏附㊂这表明V s-p A㊁V s p B㊁V s p C㊁V s p E和V s p F是M.b o v i s的黏附素㊂但是一些抑制M.b o v i s与E B L细胞黏附的单克隆抗体不能抑制M.b o v i s对B B E细胞的黏附[48],这一现象表明M.b o v i s对不同宿主细胞的黏附可能是不同的㊂3M.b o v i s黏附素结合蛋白病原体对特定组织或细胞的黏附是一个复杂的过程㊂细菌黏附素的靶蛋白主要是宿主细胞外基质(E C M)的成分,包括胶原蛋白㊁弹性蛋白㊁F N㊁血小板源性生长因子和层黏连蛋白等[50]㊂支原体中位于细胞膜上的蛋白也可以结合宿主细胞的E C M成分进而介导支原体的定植或侵袭,如胶原蛋白㊁层黏连蛋白㊁F N㊁P l g和H S[51]㊂迄今为止,已鉴定出四种类型M.b o v i s黏附素结合蛋白,即P l g㊁F N㊁H S 和A P L P2㊂3.1纤溶酶原纤溶酶原(p l a s m i n o g e n,P l g)存在于血管组织和大多数体液中,主要合成部位是肝,是一种M r为92k u的单链血浆糖蛋白,经纤溶酶原激活物催化激活后变为双链纤溶酶[52]㊂纤溶酶可以被许多细菌㊁真菌㊁蠕虫㊁寄生虫和病毒利用来抑制宿主的免疫反应和逃避局部免疫攻击[53]㊂到目前为止,在共生和致病的细菌中已经报道了超过40种病原微生物以P l g为结合蛋白[53],从而促进其对宿主细胞的黏附和侵袭,如化脓性链球菌与人P l g结合进而促进链激酶切割并提高菌体毒力[54],多杀性巴氏杆菌能够利用宿主P l g来跨越组织屏障和逃避宿主先天免疫[55],结核分枝杆菌与P l g结合后促进其组织重建和对宿主的侵袭[56]㊂在支原体中已经发现发酵支原体㊁L e a c h i i支原体㊁M.b o v i s㊁鸡毒支原体㊁鸡滑液支原体㊁猪肺炎支原体㊁肺炎支原体㊁猪鼻支原体和无乳支原体能够与P l g结合[57-59]㊂这也提示我们P l g在可能在M.b o v i s定植过程中起着重要作用,并与M.b o v i s的发病机制和免疫逃逸密切相关,其结合和激活可能是M.b o v i s毒力决定因素之一㊂3.2纤连蛋白纤连蛋白(f i b r o n e c t i n,F N)是一种高分子量的多功能细胞外基质糖蛋白,广泛存在于血液㊁体液及各种组织中㊂F N主要有两种形式:血浆纤维连接蛋白和细胞纤维连接蛋白,其主要功能是将细胞与细胞的E C M连接起来[60]㊂纤维连接蛋白结合蛋白(F n B P s)是多种病原体重要的黏附素,已有研究证实支原体中存在F n B P s,如M.b o v i s的N O X[22]㊁F B A[30]㊁M b f N[32]㊁T r m F o[37]和P27[41]㊁猪肺炎支原体的N A D H氧化酶[61]㊁鸡滑液支原体的二氢脂1123畜牧兽医学报54卷酰胺脱氢酶[62]㊁无乳支原体的MA G_6130黏附素[59]以及猪鼻支原体的烯醇化酶[63]㊂F n B P s不仅存在于支原体中,许多细菌真菌以及病毒都可与F N结合,目前已经鉴定出100多种细菌F n B P s[64]㊂F n B P s在细菌与其宿主的相互作用中起着关键作用,许多研究表明一些F N结合蛋白基因的失活会显著降低细胞的黏附性,如金黄色葡萄球菌的f n-b A和f n b B双突变体[65]㊁化脓性链球菌的p r t F I突变体[66]㊂有证据表明,F N也会参与病原体的入侵以及具有信号传递作用,如金黄色葡萄球菌黏附蛋白与F N结合后招募整合素通过内吞途径入侵靶细胞[67]㊁猪肺炎支原体通过和F N相互作用后与上皮细胞表面的整合素β1结合,并启动信号事件刺激病原体进入网格蛋白包被的囊泡和小窝体中[68]㊂由于牛支原体也利用该蛋白作为黏附素结合蛋白,所以应对牛支原体是否利用该蛋白进行细胞入侵进行进一步研究㊂3.3硫酸肝素硫酸肝素(h e p a r a n s u l f a t e,H S)为一种硫酸糖胺聚糖,广泛分布于大多数动物组织的细胞表面和细胞外基质[69]㊂H S在高尔基体中合成,由重复的N-乙酰氨基葡萄糖和己糖醛酸残基组成[70]㊂其强大的阴离子特性和高度可变的结构使这种糖胺聚糖能够为许多蛋白质配体(包括免疫系统的许多可溶性介质)提供结合位点,并可能促进或抑制其活性[69]㊂已证实H S蛋白聚糖是多种病原体黏附和定植的靶蛋白,参与病原体的内化过程,促进黏附㊁附着和进入细胞,与逃避免疫防御和致病机制密切相关[71],如猪肺炎支原体裂解产物P159结合于H S 促进其定植P K15细胞,并且可能与病原体内化有关[72]㊁产单核细胞李氏杆菌与H S结合以促进其附着和内化,进而穿过肠道黏膜进入体循环引起菌血症和脑膜炎[73]㊁细胞表面H S的失活有效的减少了白色念珠菌和光滑念珠菌对该细胞的黏附[74]㊂在M.b o v i s中与H S结合的M b f N[32]和M i l A[36]以及有待鉴定的M.b o v i s黏附素是否也参与了病原菌的内化帮助其入侵还有待学者们进一步的探索㊂3.4淀粉样前体样蛋白2淀粉样前体样蛋白2(a m y l o i d p r e c u r s o r-l i k e p r o t e i n-2,A P L P2)是淀粉样前体蛋白(A P P)的第一个同源物㊂A P P在哺乳动物中具有两种同源物:淀粉样前体样蛋白1(A P L P1)和A P L P2,三者在进化上高度保守,这三种蛋白每个蛋白都由一个胞外结构域㊁一个跨膜结构域和一个50个氨基酸长的胞质尾部结构域组成[75]㊂A P L P2对调节机体生存㊁运动功能㊁突触发育㊁髓鞘形成㊁视网膜发育㊁葡萄糖和胰岛素稳态㊁细胞黏附㊁癌症生长和转移㊁神经元祖细胞的细胞周期退出和金属稳态至关重要[76]㊂对基因敲除小鼠的研究已经证实,与A P P和A P L P1相比,A P L P2是A P P家族中小鼠存活所需的必要成员[77-78]㊂A P P和A P L P-2在基因上相关,但在转录上不同,在每个基因中都有独特的序列基序,具有特殊的㊁不重叠的功能[75]㊂虽然A P L P-2是细胞黏附的重要组成部分,但是A P L P-2作为病原体受体的报道较少,目前已证实A P L P-2是M.b o v i s黏附的靶蛋白[22],对于其在M.b o v i s致病机制中所扮演角色的相关研究还存在空缺㊂4小结与展望本文对M.b o v i s目前已鉴定黏附素的发现过程㊁部分生物学特性以及宿主结合蛋白进行了综述㊂其中将生物信息学技术和传统生物学及免疫学试验验证相结合,或者利用不同菌株间的表型和基因型进行差异基因筛选均为M.b o v i s黏附素筛选可行方案㊂研究表明M.b o v i s黏附素在感染㊁病原体定植入侵和宿主损伤中具有关键作用㊂目前已鉴定的M.b o v i s黏附素大部分为膜表面蛋白,部分黏附素具有良好的保守性和免疫原性,并且具备多种生物活性,它们的主要宿主结合蛋白为H S㊁P l g㊁F N和A P L P2,其中H S㊁P l g和F N可与多种已鉴定的M.b o v i s黏附素结合㊂有些M.b o v i s黏附素结合蛋白可能与多种病原感染密切相关,如P l g是多种细菌黏附素的靶蛋白,说明这些病原的定植与入侵可能具有相同或相似的机制㊂此外,鉴于M.b o v i s可以感染多种动物,可引起多种组织器官感染并导致多种临床症状,而当前鉴定的黏附素主要针对E B L细胞和M D B K细胞,且这两种细胞的黏附素也存在差异,因此不难推测尚有针对不同细胞的重要黏附素还有待验证㊂M.b o v i s已经成为危害养牛产业的重要病原之一,对牛场及养殖户收益影响较大,因此对M.b o v i s 疾病的预防和控制是养牛产业兴旺发展的关键举措㊂M.b o v i s无细胞壁特性使其致病性高度依赖于细胞表面的黏附素㊂黏附素是M.b o v i s研究的一个重要方向,加强M.b o v i s黏附素的研究将有助于M.b o v i s致病机制的阐明,同时对预防性和诊断性2123。

IL-1β及其受体在雌牦牛主要生殖器官和孤雌激活胚胎中的表达定位

IL-1β及其受体在雌牦牛主要生殖器官和孤雌激活胚胎中的表达定位王靖雷;余四九;王萌;潘阳阳;李秦;何翃闳;黄玉风;赵凌;樊江峰;崔燕【摘要】为探索正常生理条件下IL-1β和IL1R1参与雌性牦牛生殖调控及早期胚胎发育的生物学作用,试验采集雌性牦牛主要生殖器官(卵泡期:输卵管、卵巢、子宫;黄体期:输卵管、卵巢、子宫;妊娠期:输卵管、卵巢、子宫),并生产孤雌激活胚胎.实时荧光定量PCR (Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测IL-1β和IL1R1 mRNA在组织和胚胎发育过程中的表达;并采用蛋白质免疫印迹(Western-blot,WB)和免疫组织化学方法从蛋白水平分析IL-1β和IL1R1在各生殖器官的表达水平与定位.结果显示IL-1 β和IL1R1在牦牛主要生殖器官和孤雌激活胚胎中均有表达.其中卵泡期输卵管中IL-1β和IL1R1表达均高于黄体期和妊娠期,卵泡期卵巢和妊娠期卵巢中IL-1β和IL1R1的表达高于黄体期,妊娠期子宫中IL-1β和IL1R1的表达高于卵泡期和黄体期,孤雌激活胚胎中IL-1β和IL1R1的表达桑椹胚最高,8细胞次之,2细胞和囊胚期最低.免疫组织化学结果显示IL-1β和IL1R1在输卵管黏膜上皮、卵泡颗粒层、黄体细胞、子宫上皮和子宫腺体均有表达.研究结果表明IL-1β和IL1R1参与牦牛生殖周期和胚胎发育的调控作用,为进一步探究IL-1β和IL1R1的作用机制提供了理论基础,有助于牦牛胚胎体外培养技术的改进.【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2018(027)010【总页数】10页(P1395-1404)【关键词】牦牛;IL-1β;IL1R1;孤雌胚胎【作者】王靖雷;余四九;王萌;潘阳阳;李秦;何翃闳;黄玉风;赵凌;樊江峰;崔燕【作者单位】甘肃农业大学动物医学院/甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心,兰州730070;甘肃农业大学动物医学院/甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心,兰州730070;甘肃农业大学动物医学院/甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心,兰州730070;甘肃农业大学动物医学院/甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心,兰州730070;甘肃农业大学动物医学院/甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心,兰州730070;甘肃农业大学动物医学院/甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心,兰州730070;甘肃农业大学动物医学院/甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心,兰州730070;甘肃农业大学动物医学院/甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心,兰州730070;甘肃农业大学动物医学院/甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心,兰州730070;甘肃农业大学动物医学院/甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心,兰州730070【正文语种】中文【中图分类】S823.8+5.2细胞因子最初被认定为免疫细胞分泌的肽和蛋白产物，在胚胎发育的子宫内膜生理和母体调控中发挥着重要作用[1-2]。

非致细胞病变牛病毒性腹泻病毒抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制探索

非致细胞病变牛病毒性腹泻病毒抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制探索非致细胞病变牛病毒性腹泻病毒抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制探索摘要：非致细胞病变牛病毒性腹泻病毒（noncytopathic bovine viral diarrhea virus, BVDV-1）是一种在牛群中广泛存在的病毒，常引起腹泻和免疫抑制。

然而，该病毒如何抑制Ⅰ型干扰素（interferon-alpha, IFN-α）的产生仍不清楚。

本文通过细胞实验和分子生物学手段，探索了BVDV-1抑制IFN-α产生的分子机制。

引言：非致细胞病变牛病毒性腹泻病毒是一种单股正链RNA病毒，属于黄病毒科。

BVDV-1引起的感染引起牛群中广泛的腹泻和免疫抑制，给养殖业造成了严重的经济损失。

干扰素是机体主要的抗病毒防御系统，而BVDV-1感染常伴随着Ⅰ型干扰素的抑制，使机体难以应对病毒感染。

结果：我们首先通过实时荧光定量PCR分析，观察了BVDV-1感染后IFN-α基因表达的变化。

结果显示，BVDV-1感染显著抑制了IFN-α mRNA的表达。

进一步的Western blot实验显示，BVDV-1感染后IFN-α蛋白的表达也受到显著抑制。

这表明BVDV-1通过抑制IFN-α的产生来削弱机体对病毒的抵抗能力。

为了进一步探究BVDV-1的抑制机制，我们考察了病毒对IFN-α信号通路的影响。

我们发现BVDV-1感染后，后续的干扰素信号通路激活受到阻断。

Western blot实验显示，感染后干扰素诱导的JAK-STAT信号通路中的关键分子JAK1和STAT1的磷酸化水平明显降低。

这表明BVDV-1通过抑制IFN-α诱导的信号通路来调控机体对病毒的抗感染能力。

进一步的实验发现，BVDV-1感染诱导了细胞内抗病毒蛋白PKR（double-stranded RNA-dependent protein kinase）的活化。

PKR是一种关键的抗病毒蛋白，常通过磷酸化eIF2α抑制病毒蛋白的合成。

生殖支原体脂质相关膜蛋白激活核因子κB诱导人单核细胞表达前炎症细胞因子及凋亡

基金项目：国家自然科学基金（1%#"%%(1）；湖南省自然科学基金（%233#%!!）
" 通讯作者： 4/5： ’26"1!6’$’&###； 789： ’26"1!6’$’$(%"； :6;8<5： =<;->?>@ A<B8C +-;C +B
作者简介：邱
宏（&("( D ），女，湖南省怀化人，硕士研究生，主要从事生殖支原体致病机制的研究。 :6;8<5： E<>F D &("( @ &21G +-;
前炎症细胞因子（ NOA）的分子机制，用 HI 提取的 JKHLA 刺激 4ML6& 细胞，以 :JPQK 法和 R46LNR 方法分析 NOA 产生和其 ;RSK 的表达。不同试实验组的细胞经 KBB/9<BT 联合 LP 染色后通过流式细胞仪检测细胞凋亡。采用 :HQK 方法检测 JKHLA 处理的 4ML6& 细胞中核转录因子 U8VV8W （ S76 的激活，并分析 S76 W） W 抑制剂二硫代氨基甲酸吡 ! ! 对 JKHLA 处理的 4ML6& 细胞产生 NOA 的量和其 ;RSK 表达及细胞凋亡的影咯烷（ V=00-5<X<B/ X<,F<-+-80.8;8,/， LY4N）响。JKHLA 能以时间和剂量依赖方式刺激 4ML6& 细胞产生 4S76 、且能激活 S76 PJ6& W 诱导 4ML6& 细胞表 " ! #和 PJ62，达 NOA 的 ;RSK 及发生凋亡， LY4N 能显著抑制 NOA 的 ;RSK 表达水平和细胞凋亡。由于 JKHLA 能激活 S76 W 诱导 ! 因而可能是一个重要的致病因素。 4ML6& 细胞表达 NOA 及产生细胞凋亡，关键词：生殖支原体；膜蛋白；核因子! 细胞因子；凋亡 W；中图分类号： Z(12 文献标识码： K 文章编号： %%%&62$%(（$%%"）%#6%’((6%2

IL-1β诱导间充质干细胞外泌体调控巨噬细胞的极化在治疗新西兰兔尿道狭窄中的作用

IL-1β诱导间充质干细胞外泌体调控巨噬细胞的极化在治疗新西兰兔尿道狭窄中的作用IL-1β诱导间充质干细胞外泌体调控巨噬细胞的极化在治疗新西兰兔尿道狭窄中的作用摘要背景：尿道狭窄是一种常见的尿路疾病，常见于男性。

目前的治疗方法包括手术和内窥镜切割等，但治疗效果有限，易复发。

因此，寻找新的治疗方法具有重要意义。

目的：研究IL-1β诱导间充质干细胞外泌体调控巨噬细胞的极化在治疗新西兰兔尿道狭窄中的作用。

方法：将新西兰兔随机分为对照组和实验组，实验组采用间充质干细胞外泌体进行治疗，随访监测其尿流率和尿道狭窄程度，并采用免疫荧光和Western blotting方法检测巨噬细胞的极化情况，探讨外泌体调控巨噬细胞极化的机制。

结果：实验组的尿流率明显提高，尿道狭窄程度明显下降，治疗效果明显优于对照组。

外泌体可以调控巨噬细胞的极化，使其向M2型巨噬细胞极化，这可能是外泌体治疗尿道狭窄的核心机制之一。

结论：IL-1β诱导间充质干细胞外泌体调控巨噬细胞的极化可能是一种潜在的治疗新西兰兔尿道狭窄的方法，有望为尿道狭窄患者提供新的治疗选择。

关键词：间充质干细胞；外泌体；巨噬细胞极化；尿道狭窄；治疗尿道狭窄是一种常见的尿路疾病，常见于男性。

传统的治疗方法包括手术和内窥镜切割等，但治疗效果有限，易复发。

因此，寻找新的治疗方法具有重要意义。

近年来，干细胞及其外泌体治疗已成为一个热门研究领域。

研究表明，间充质干细胞（MSCs）外泌出的小囊泡（外泌体）具有多种生物学功能，包括具有免疫调节和组织修复作用的调节巨噬细胞极化的能力。

因此，本研究探究了IL-1β诱导MSCs外泌体调节巨噬细胞极化在治疗新西兰兔尿道狭窄中的作用。

实验结果表明，外泌体治疗组的尿流率明显提高，尿道狭窄程度明显下降，治疗效果明显优于对照组。

同时，外泌体可以促进巨噬细胞极化，使其向M2型巨噬细胞极化，这可能是外泌体治疗尿道狭窄的核心机制之一。

综上所述，IL-1β诱导MSCs外泌体调节巨噬细胞极化可能是一种潜在的治疗新西兰兔尿道狭窄的方法，为尿道狭窄患者提供了新的治疗选择。

IL-1β诱导新生牛脑微血管平滑肌细胞表达E-选择素解读

IL-1β诱导新生牛脑微血管平滑肌细胞表达E-选择素徐江平芮耀诚李铁军E-选择素是细胞粘附分子中选择素(Selection)家族的主要成员之一，属人类白细胞分化抗原CD62E，为110 kD的跨膜糖蛋白［1］；大多数研究认为，E-选择素只表达在受细胞因子作用后的血管内皮细胞［2］，但近来有文献报道，非内皮源性的细胞经细胞因子或脂多糖诱导后也可表达E-选择素［3，4］。

本研究将观察新生牛脑微血管内皮细胞(BCMSMC)经IL-1Β诱导后是否表达E-选择素。

中国图书分类号R392.111 材料与方法1.1 动物新生牛，雄性，购自上海光明乳制品公司奶牛场；Wistar大鼠，雌雄兼用，本校实验动物中心提供。

1.2 药品和试剂人源IL-1Β，意大利Sclavo research center 提供;抗E-选择素单克隆抗体(AEmAb),购自Pharmingen公司；辣根过氧化物酶标记羊抗大鼠IgG(HRP-IgG),Calbiochem公司产品；牛血清白蛋白(BSA)，邻苯二胺(OPD)，Sigma公司产品；新生牛血清(NBS)、羊血清(NGS)购自华美生物工程公司；其他试剂均为分析纯或所能达到的最高等级。

1.3 BCMSMC的培养按本室已建立的方法培养［5］。

原代细胞12～15 d形成融合单层，用0.1%胰酶（Sigma)消化,传代,3～5 d传1代，用4～6代细胞进行实验。

1.4 大鼠血单核细胞(Monocytes,MN)的分离按文献［6］进行。

将分离提纯的MN用0.1%BSA/PBS溶液悬浮，并调整细胞浓度为5×106 ml-1备用。

1.5 细胞粘附实验4～6代的BCMSMC在96孔培养板生长48 h，呈致密单层，经IL-1Β诱导4 h，加入0.1 ml MN，孵育90 min。

用Hank's溶液洗去未粘附细胞，再加入0.1 ml, 10 mmol/L EDTA/PBS溶液解离已粘附细胞30 min，吸出解离液，用血细胞记数仪（FACSⅢ型，BD公司）计数MN数目，以被粘附细胞占加入总细胞的百分率为粘附率。

牛支原体疫苗研究进展

牛支原体疫苗研究进展
东笑;陶攀;王贵平;贾爱卿
【期刊名称】《中国动物传染病学报》
【年(卷),期】2024(32)1
【摘要】牛支原体(M.bovis)是牛的重要病原体,能够引起牛的乳腺炎、关节炎和肺炎等疾病。

牛支原体已在全世界传播,对全球范围内的养牛业产生了重大不利影响。

目前,由于牛支原体的耐药性有增强的趋势,同时缺乏有效的疫苗和治疗方法,这严重阻碍了牛支原体感染的控制。

预防、控制甚至清除牛支原体最好的方法是使用有效的疫苗。

虽然目前我国还没有获得新兽药证书的牛支原体疫苗,但相关的研究已取
得了一定的进展。

本文根据多年来牛支原体疫苗研究的相关资料,从牛支原体感染
与免疫机制、灭活疫苗、弱毒活疫苗、基因工程疫苗四个方面进行综述,以期为今
后牛支原体疫苗的研制提供思路及参考。

【总页数】6页(P222-227)
【作者】东笑;陶攀;王贵平;贾爱卿
【作者单位】广东海大畜牧兽医研究院有限公司广东省养猪与猪病防控技术研究企业重点实验室;广东海大集团股份有限公司
【正文语种】中文
【中图分类】S858.23
【相关文献】
1.牛支原体及其支原体病诊断技术研究进展
2.牛支原体疫苗的研究进展
3.牛支原体灭活疫苗免疫小鼠最小免疫剂量及抗体消长规律研究
4.牛支原体病病原特性及疫苗研究进展
5.牛支原体灭活疫苗免疫程序及母源抗体消长规律研究
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牛支原体免疫相关膜蛋白及宿主细胞内与牛支原体感染相关蛋白的筛选和鉴定

牛支原体免疫相关膜蛋白及宿主细胞内与牛支原体感染相关蛋白的筛选和鉴定牛支原体是一种常见的致病菌，能感染牛和其他反刍动物，引起严重的呼吸道感染和泌尿道疾病。

牛支原体感染的机制一直是研究的焦点之一。

在牛支原体感染过程中，牛支原体的免疫相关膜蛋白和宿主细胞内的与感染相关蛋白起着重要的作用。

牛支原体的免疫相关膜蛋白是其在宿主细胞内生存和传播过程中的关键因子。

研究表明，免疫相关膜蛋白可以与宿主细胞膜上的受体结合，进而介导牛支原体进入宿主细胞内，并与宿主细胞内的相关蛋白相互作用。

通过筛选和鉴定牛支原体免疫相关膜蛋白，可以揭示牛支原体感染的机制，为预防和治疗牛支原体感染提供理论基础。

牛支原体感染相关蛋白是感染过程中的另一个重要因素。

这些蛋白在牛支原体侵入宿主细胞、感染宿主细胞以及抵抗宿主免疫等方面发挥作用。

通过筛选和鉴定与牛支原体感染相关的宿主蛋白，可以深入研究牛支原体与宿主细胞的相互作用机制，为揭示感染过程提供重要线索。

近年来，随着蛋白组学和基因组学等研究技术的快速发展，牛支原体免疫相关膜蛋白和宿主细胞内与牛支原体感染相关蛋白的筛选和鉴定工作取得了重要进展。

例如，通过质谱法和蛋白芯片技术，已经鉴定出了多个与牛支原体感染相关的膜蛋白和宿主蛋白。

这些研究为进一步揭示感染过程中的关键因子提供了重要参考。

此外，也有研究表明，牛支原体感染可能与宿主的免疫系统状态有关。

研究发现，在牛支原体感染后，宿主细胞会产生多种免疫相关蛋白，并引起炎症反应。

这些免疫相关蛋白在牛支原体感染的清除过程中起到重要的作用。

因此，进一步研究牛支原体感染相关的免疫蛋白是十分必要的。

总之，牛支原体感染的机制非常复杂，免疫相关膜蛋白和宿主细胞内与牛支原体感染相关的蛋白起着重要作用。

通过筛选和鉴定这些蛋白，可以揭示感染过程中的关键因子，为预防和治疗牛支原体感染提供理论基础。

未来的研究将进一步探索牛支原体免疫相关膜蛋白和宿主细胞内与牛支原体感染相关蛋白的功能和调控机制，以期为解决牛支原体感染问题提供新的思路和策略综上所述，牛支原体感染的相关蛋白和宿主细胞的相互作用机制是揭示感染过程的关键因素。

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Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｂｏｖｉｓａｎｄｉｔｓｌｉｐｉｄ — ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｓ
ＬＩＵＳｕ — ｌｉ，ＷＡＮＧＹａｎｇ，ＬＩＹｕａｎ，ＺＨＯＵＹｕ－ｍｅｉ，ＧＡＯＬｉ — ｐｉｎｇ，ＳＨＡ０Ｊｉａ — ｒｉ，
ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００８－０５８９．２０１５．０６．０９
牛支原体及其脂质相关膜蛋白诱导胎牛肺细胞
ＩＬ一１Ｉ３表达的分子机制研究
刘素丽，汪洋，李媛，周玉梅，高利萍，邵佳日１，２，王琪，陈莹，辛九庆
摘要：为研究牛支原体（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）￣其脂质相关膜蛋白（ＬＡＭＰｓ）诱导胎牛肺（ＥＢＬ）细胞ＩＬ．１Ｂ表达的分子机
制，本研究首先以Ｍｂｏｒｉｓ及其ＬＡＭＰｓ刺激ＥＢＬ细胞，利用荧光定量ＰＣＲ检测细胞因子ＩＬ．１１３的动态变化；然
ＷＡＮＧＱｉ。，ＣＨＥＮＹｉｎｇ４，ＸＩＮＪｉｕ－ｑｉｎｇ
（１．ＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＭｙｃｏｐｌａｓｍａＤｉｓｅａｓｅｓ，ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＢｉｏｔｅｃｈｏｎｌｏｇｙ，ＨａｒｂｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｙｒＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，
中图分类号：￥８５２．６１文献标识码：Ａ文章编号：１００８．０５８９（２０／５）０６ — ０４４４．０４
ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＬ・１１３ｉｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｂｏｖｉｎｅｌｕｎｇｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙ
第３７卷第６期
２０１５年６月中国预来自防兽医学报
Ｖｏ１．３７．Ｎｏ．６Ｊｕｎ．２０１５
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｒｅｖｅｎｔｉｖｅＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ
ＩＬ．１Ｂ的表达；而且ＬＭＰＡｓ作用的最佳剂量为２ｉｘｇ／ｍＬ，最佳时间为１２ｈ。同时，激光共聚焦试验检测到ＬＡＭＰｓ能够诱导ｐ６５进入ＥＢＬ细胞核中。上述实验结果表明ＬＡＭＰｓ能够诱导ＥＢＬ细胞中ｐ６５进入细胞核内，从而激活ＮＦ．ＫＢ信号通路，诱导ＩＬ．１Ｂ上调表达。关键词：牛支原体；脂质相关膜蛋白；胎牛肺细胞；ＮＦ．ＫＢ信号通路；ＩＬ．１Ｂ
ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｒｂｉｎ１５０００１，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＪｉｌｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
后将融合表达的细胞ｐ６５（ＲｅｌＡ）蛋白和绿色荧光蛋白重组质粒ｐＥＧＦＰｐ６５转染ＥＢＬ细胞，以ＬＡＭＰｓ刺激ＥＢＬ细
胞，通过激光共聚焦观察ｐ６５的亚细胞分布。荧光定量ＰＣＲ结果显示，Ｍ．ｂｏｖｉｓ及其ＬＡＭＰｓ能够诱导ＥＢＬ细胞
（１．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／动物支原体病研究室，黑龙江哈尔滨１５０００１；２．吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春１３０１１８；３．东北农业大学资源与环境学院，黑龙江哈尔滨１５００３０；４．东北农业大学动物医学院，黑龙江哈尔滨１５００３０）
Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３０１１８，Ｃｈｉｎａ；３．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００３０，Ｃｈｉｎａ；