杂交瘤技术和单克隆抗体技术.ppt
3、免疫系统含有109以上淋巴细胞遍布全身，保证了它们在 任何部位都能迅速反应。淋巴细胞由骨髓中的原始干细胞不 断产生，经血液及淋巴系统循环，暂时停顿并积聚于称作淋 巴器官的特异化的结构中，在哺乳动物中就是淋巴结和肝脏。 在免疫反应过程中，免疫原积聚于一个淋巴器官中，这个淋 巴器官就变成了免疫反应的焦点。
七、一个有效免疫系统的成熟是由广泛的细胞间信பைடு நூலகம்交换来 调节的。
第二节、抗体分子
抗体是具有共同结构和功能形式的一大类糖蛋白。抗体分 成五类：IgG、IgM、IgA、IgE和IgD（见表2-1）。
一、IgG类抗体有两个相同的抗原结合位点 含有抗原结合位点的两个区域被称作Fab片段，涉及到免 疫调节的蛋白区称作Fc片段，在Fab和Fc片段之间的部分称 作铰链区。
对于鼠，大体积注射常采用腹腔注射，若需缓慢释放则
采用肌注或皮下注射，若需立即释放宜采用静脉注射。
对于鼠来说，第二次和第三次免疫应间隔至少3周。 对于兔来说，每3~6周注射一次。 超免疫化动物血清主要含IgG抗体。其实质部分为特异性 抗体。抗原特异的IgG水平可达1mg/ml，这几乎等于血清中 总IgG水平的10%。
二、抗原来源
开始一个免疫程序之前，对制备抗原的考虑主要于抗原 所需的剂量和纯度。这应基于预计产生抗体的用途。如果
仅仅需要识别相应抗原的高特异性抗体，那么抗原必须要 相当纯，或抗原制备物用于制备单克隆抗体。
1、纯抗原 2、从聚丙烯酰胺凝胶中纯化抗原。 3、半抗原：半抗原若被偶联于大的蛋白分子上就能被 用于诱发抗体。半抗原起抗原决定簇作用，与B细胞表面 抗体结合，载体提供II级T细胞受体结合位点。总之，半 抗原应被偶联于可溶性载体上，如BSA。 4、合成多肽也要连接到载体上。
四、免疫系统能将外来微生物和分子与自身成分区别开来。
五、系统记忆每一次与外来抗原的遭遇
免疫反应遇到同一抗原时一次比一次强，具有特异性。免 疫记忆可以延续动物终生。
六、免疫反应的许多性质是通过克隆选择确定的
一种抗原活化一种淋巴细胞。当淋巴细胞表面受体结合 抗原时，B淋巴细胞就被活化，分泌抗体被刺激而增殖（急 剧分裂克隆）。
九、这些重组及其它机制产生了无数的抗原结合位点。 十、等位基因排斥确保在任一B细胞中只有重新排列的一 个轻链和一个重链被表达。产生不同重链和轻链的基因重组 不总是产生一个功能基因，在B细胞分化过程中，轻链重排 开始于κ区内。然后，若二倍体基因中的一个首先重排，产 生一个功能性等位基因，另一个拷贝则进行重组。若二个重 组都产生非功能性等位基因，那么重组就要λ位点开始，以同 样的机制产生功能性重链。一旦重组产生一个功能性抗体， 一个未知的机制就制止进一步重组。将抗原性结合位点固定 ，直到细胞死亡。这个机制叫等位基因排斥。它可以解释为 什么B淋巴细胞分泌的只有一种抗原结合位点的抗体和抗体 只有一种类型的轻链。 十一、其它：重组被用于生产各种类和亚类的抗体。
B细胞：分泌抗体，并在细胞表面携带同一抗体的修饰型， 功能相当于受体。
毒性T细胞：携带结合抗原的细胞表面受体。 辅助T细胞：在控制B细胞和细胞毒性T细胞反应方面起关 键的调节作用。
体液介导的适应性免疫反应：体液反应引发产生可结合外 来抗原的循环抗体，由B淋巴细胞产生，由辅助T淋巴细胞 介导是抗体技术的基础。
淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体技术
1960年，法国的Barski等首先发现，两种不同类型的细 胞在混合培养的过程中会自发融合形成融合细胞。与此同 时，日本的Okada也发现紫外线灭活的仙台病毒(Sandai virus)可以诱发艾氏腹水瘤细胞相互融合，在此基础上用灭 活的仙台病毒诱导产生了第一个种间的杂交细胞。
氨基酸、 核苷酸库
氨基 蝶呤A
次黄嘌呤H 肌苷酸
脱氧核苷酸
次黄嘌呤磷酸核糖 转移酶(HGPRT)
胸腺嘧 啶核苷T
dGTP、 dTTP
DNA 合成
胸腺嘧啶核苷 激酶（TK）
杂种细胞的筛选：细胞融合带有一定的随机性， 除不同亲本细胞间的融合外，还伴有各亲本细胞的 自身融合。因此，在紧随细胞融合之后，必须设法 把含有两亲本细胞染色体的杂种细胞分离或筛选出 来。最简便的办法无疑是应用选择培养基，使亲本 细胞死亡，而仅让杂种细胞存活下来。为此，已先 后利用亲本细胞的药物抗性、营养缺陷型和温度敏 感性等遗传标记，建立了多种选择系统，并已成功 地用于杂种细胞的筛选。
一、免疫原性
许多外源分子、病毒或细胞单纯注射在实验动物体内能 引起强的抗体反应，而一些物质却不能，对于这些情况， 常可通过修饰抗原或改变宿主而使免疫系统反应增加。
好的免疫原分子必须具备以下条件： 1、抗原结合于原始B细胞表面抗体分子对于抗体反应是 绝对必要的。这个结合决定了产生抗体的特异性。因为表 面抗体分子上的抗原决定位点与分泌抗体的结合位点是一 致的。 2、它必须能促进B细胞与辅助T细胞间的信息交换。这 要求在两个细胞间有物理连接。即有一个位点被II级蛋白 及T细胞受体所识别。 3、通常它必须可被降解。
一个重链的可变区和一个轻链的可变区结合形成一个抗原 结合位点。可变区的异质性提供了动物有效进行免疫反应所 需的无数结合位点的基础。序列异质性并不是由整个可变区 的每一部分决定的，而是集中在与抗原接触的位点上。多数 可变性决定于每一个链的三个短区，它们形成轻链的三个超 变区和重链的三个超变区。这些超变区形成抗原抗体结合的 接触残基的主体，同时这些超变区位于扩展进入抗原反应区 的短环上。由于它们是实际的抗原结合位点，故被认为是互 补决定区。
第四讲 杂交瘤细胞和单克隆抗体技术
第一节、免疫的基本知识
一、免疫系统：分非适应性免疫和适应性免疫两类。 1、非适应性免疫是由非特异性反应的细胞介导的。如：巨 噬细胞的吞噬作用，泌细胞分泌的溶菌酶，以及中性细胞造 成的细胞裂解机制。 2、适应性免疫：是针对特定分子，而且可经反复暴露于外 源分子使之加强淋巴细胞合成细胞表面受体或分泌特异性蛋 白结合外源分子。这些分泌的蛋白称为抗体；可与抗体结合 的分子被称为抗原。当一个分子被用于诱导适应性反应时， 这个分子就被叫做免疫原。
1976年Kohler和Milstein创建了一个方法，他们将分泌一 种特异性抗体的B细胞和体外持续生长的浆细胞瘤融合，产 生的杂交细胞克隆表达了抗体生成的正常B细胞和浆细胞瘤 细胞的免疫球蛋白基因，同时也具有在体外无限增殖的能 力。为此创造了杂交瘤(hybridoma)这个名词，以描述一个 正常抗体生成细胞和一个浆细胞瘤细胞的融合产物。由于 他们的重要科学贡献，Kohler和Milstein在1984年荣获了诺 贝尔医学生理奖。
四、抗体重链的分子结构
重链的序列也存在可变区和恒定区（图2-1）。IgG重链含 有一个可变区和三个恒定区，每区含110个氨基酸，其它重 链含有附加的恒定区。
IgG重链序列也显示γ链有四种亚类，即：IgG1、IgG2a、 IgG2b和IgG3。鼠重链多肽编码区在第12染色体上。
五、重链和轻链的可变区形成抗原结合位点
HAT选择培养基：HAT培养基是指在细胞培养基中加有次黄 嘌呤（H）、氨基喋呤（A）或氮丝氨酸（A）和胸腺嘧啶核 苷（T）的培养基。细胞为合成DNA所需要的嘌呤和嘧啶，可 由两条途径获得。一条为主要途径，即从磷酸核糖焦磷酸 （PRPP）和谷氨酰胺合成肌苷酸（IMP），进而转变为脱氧 鸟苷三磷酸（dGTP），及从脱氧尿苷酸（dUMP）合成脱氧 胸苷酸（dTMP），再转变为脱氧胸苷三磷酸（dTTP）。这 一合成途径，可为加入的会抑制为嘌呤或嘧啶合成提供甲基的 二氢叶酸还原酶的叶酸类似物A所阻断。此时，只有HGPRT+ 和TK+细胞才能通过另一条应急途径，利用外加的核苷酸的 “前体”H来合成IMP和利用T来合成dTMP，而得以有活下 来。相反，HGPRT－和TK－细胞则将因无法利用H和T来合成 DNA而死亡。因此，在HGPRT－和TK－细胞融合后，应用 HAT培养基即可将通过基因互补而同时获得HGPRT和TK酶 的杂种细胞筛选出来。
细胞介导的适应性免疫反应：毒性T淋巴细胞结合于外来 或感染的细胞，随后将这些细胞裂解，辅助T细胞参与该反 应。 二、免疫系统能特异性地对无数种分子反应。
免疫系统持续地受无数抗原刺激。免疫系统的一个主要形 式是它能合成大量的抗体及细胞表面受体。各个带有不同抗 原结合位点的抗体和T细胞受体与外来分子的结合提供了免 疫反应特异性的基础。
重链分子量为5.5kDlt；轻链分子量为2.5kDlt。 二、不同类型抗体的区别
IgG、IgM、IgA、IgE和IgD因重链形式不同而有所区别。 它们的重链分别称作γ、μ、α、ε和δ。
重链的不同使这些蛋白具有不同形式的免疫功能，并且在 完成反应成熟的不同阶段发挥作用。这些差异主要是由于Fc 片段上的蛋白序列不同所致。
轻链只有两种：κ、λ。
三、抗体轻链的分子结构
比较轻链的氨基酸结构发现，轻链有一个恒定区和一个可 变区。轻链由220个氨基酸组成，分为两个区，每个区由大 约110个氨基酸组成。-NH2末端那半部分是异源性的，称为 可变区（V）；羧基末端那部分称为恒定区（C）。
恒定区有两种类型：一种是决定κ轻链的，另一种是决定 λ轻链的。κ轻链基因位于第6染色体上，而λ轻链的基因则 位于第16染色体上。
三、动物免疫
1、动物选择 Balb/c小鼠，6~8周龄；兔子生后约12周。 动物数：小鼠4~6只；兔子2~4只。
2、佐剂 免疫反应的非特异性刺激物叫做佐剂，诱导对可溶性抗原
的抗体反应必须使用佐剂。但对颗粒性抗原或全细胞抗原则 不是必须的。
佐剂包含两种因素：一是佐剂是储备性物质以防止抗原迅 速代谢；二是佐剂必须是可以非特异性地刺激免疫反应的物 质。实验时一般是将水溶液注入到佐剂中。 3、抗原剂量
六、功能性κ、λ轻链和重链基因的一个明显特征是在所有 细胞中这些基因转录后的选择性剪接是不同的（见图2）。 200个V区，4个功能性J区。
七、形成λ轻链pre-mRNA外显子也要重排（图3）。V-JC-J-C。
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单克隆抗体PPT课件
单克隆抗体的应用领域
01
02
03
04
基础研究
用于研究生物分子结构和功能 ，探索生命现象的本质。
诊断
用于检测生物样本中的抗原、 抗体、激素等生物分子，用于
疾病的诊断和监测。
治疗
用于治疗肿瘤、自身免疫性疾 病、感染性疾病等，通过与靶 分子结合，发挥治疗作用。
免疫学检测
用于检测食品、环境、生物武 器等中的有害物质和病原微生
高特异性
总结词
单克隆抗体具有极高的特异性，能够精确地识别和结合特定的抗原，几乎不会 与其它物质发生交叉反应。
详细描述
单克隆抗体的特异性表现在它能够精确地识别和结合细胞、蛋白质、病毒等抗 原的特定表位，这种结合具有高度的选择性，避免了与其他物质的交叉反应， 提高了检测和治疗的准确性。
高灵敏度
总结词
单克隆抗体可以用于鉴别血型、 检测血红蛋白病和白细胞表面抗 原，有助于血液疾病的诊断和治 疗。
生物标记与示踪研究
1 2
细胞分型
利用单克隆抗体标记不同细胞表面抗原，对细胞 进行分型和鉴定，有助于研究细胞发育、分化及 功能。
示踪研究
将单克隆抗体与荧光、放射性同位素等标记物结 合，追踪生物体内的物质分布、代谢和排泄过程。
良好的重复性
总结词
单克隆抗体的生产和制备具有高度的一致性和重复性，保证了产品质量和实验结果的可靠性。
详细描述
通过采用适当的细胞培养技术，可以在实验室条件下实现单克隆抗体的规模化生产和制备。由于单克 隆抗体的克隆来源单一，其生产和制备过程具有高度的一致性和重复性，这使得单克隆抗体的质量稳 定可靠，实验结果的可重复性强。
提高单克隆抗体的生产效率与质量
优化细胞培养条件
杂交瘤技术制备单克隆抗体
杂交瘤技术制备单克隆抗体1975年Koehler和Milstein在体细胞融合技术的基础上创立了淋巴细胞杂交瘤（hybri-doma)技术，他们将丧失合成次黄嘌吟-鸟嘌吟磷酸核糖转移酶的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞举行融合，融合的细胞不仅可以延续传代，而且能分泌抗绵羊红细胞的单克隆抗体，这项技术开创了医学与生物学基础讨论的新纪元。
杂交瘤技术具有周期长，高度延续的特点，涉及大量组织细胞培养，细胞免疫学和免疫化学等办法。
一、杂交瘤技术的原理 B淋巴细胞接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，是重要的体液免疫细胞。
B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再举行细胞分裂。
骨髓瘤细胞是恶性增殖的转化细胞，通过细胞融合技术将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，所产生的融合细胞既具有亲本骨髓瘤细胞的无限繁殖的生物学特性，又具有另一亲本B淋巴细胞合成、分泌特异性抗体的能力。
B淋巴细胞杂交瘤技术的原理可以从以下三个关键之处来阐明：首先是细胞融合剂的挑选，用法细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于互相粘连而融合在一起。
最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。
（PEG1000～2000）是目前最常用的细胞融合剂，普通应用浓度为40% (W/V)。
第二，细胞融合的挑选培养基中有3种关键成分：次黄嘌呤( hypoxanthine, H )、甲氨蝶吟( aminopterin, A）和(thymidine, T )，所以取三者的字头称为HAT培养基。
甲氨蝶吟是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT-细胞株，所以不能在该培养基中生长。
惟独融合细胞具有亲代双方的遗传性能，能在HAT培养基中长久存活与繁殖。
第三，细胞融合是随机的过程，在已经融合的细胞中有相当比例的无关细胞的融合体，需经筛选去除。
筛选过程普通分为两步举行：一是融合细胞的抗体筛选，二是在此基础上举行的特异性抗体筛选，从而找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后举行冻存、体外培养或动物腹腔接种培养，这一过程称作克隆化。
《单克隆抗体技术》课件
单克隆抗体的制备与纯化
单克隆抗体是通过杂交瘤细胞在体外培养或注射到动物体内进行体内培养产生的，经过一系列的分离 和纯化过程，最终获得高纯度、高特异性的单克隆抗体。
制备过程中通常采用各种层析技术、沉淀技术等对抗体进行分离和纯化，以确保获得高质量的单克隆 抗体。
单克隆抗体的鉴定与质量控制
鉴定是通过对单克隆抗体的免疫学特 性、生物学活性和分子结构等方面进 行检测和评估，以确定其特异性和质 量。
总结实验过程和结果，分析存在的问题和改 进方向，为后续实验提供参考和依据。
感谢您的观看
THANKS
生物标记物
用于研究细胞生物学、分子生物学 等领域。
03
02
生物药物
用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病等 。
免疫分析
用于检测生物样品中的抗原、抗体 等。
04
02 单克隆抗体技术的原理
杂交瘤细胞系的建立
杂交瘤细胞系的建立是单克隆抗体技 术的核心步骤之一，通过将免疫脾细 胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细 胞。
通过抗原-抗体反应检测杂交瘤细胞产生的 抗体特异性。
克隆筛选
通过选择性培养基筛选出能够产生所需抗体 的杂交瘤细胞克隆。
细胞培养与抗体纯化
将筛选出的杂交瘤细胞进行培养，并采用蛋 白质纯化技术获得单克隆抗体。
实验结果分析与总结
结果分析
对实验结果进行统计分析，评估杂交瘤细胞 的抗体产生能力和特异性。
总结
这些杂交瘤细胞既具有脾细胞无限增 殖的能力，又具有产生特异性抗体的 能力，从而为单克隆抗体的制备提供 了稳定的细胞源。
杂交瘤细胞的筛选与克隆化
在筛选过程中，通过抗原-抗体反应检 测杂交瘤细胞产生的抗体，筛选出能 够产生所需特异性抗体的杂交瘤细胞 。
杂交瘤技术和单克隆抗体技术PPT课件模板
制备单克隆抗体
从筛选得到的杂交瘤 细胞中提取单克隆抗 体，进行纯化和定量 。
应用单克隆抗体
将单克隆抗体应用于 临床诊断、治疗和基 础研究等领域。
单克隆抗体技术的实验操作流程
免疫原制备
制备免疫原，如抗原蛋白或多糖等，并进行 纯化和定量。
免疫动物
将免疫原注射入动物体内，刺激机体产生特异 性抗体。
制备杂交瘤细胞
杂交瘤技术和单克隆
抗体技术ppt课件模
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2024-01-11
目录
• 杂交瘤技术简介 • 单克隆抗体技术简介 • 杂交瘤技术与单克隆抗体技术的比
较 • 杂交瘤技术与单克隆抗体技术的实
验操作流程 • 杂交瘤技术与单克隆抗体技术的应
用案例
01
杂交瘤技术简介
杂交瘤技术的定义
杂交瘤技术是一种将免疫系统的B淋巴细胞与骨髓瘤细 胞融合，形成杂交瘤细胞的技术。
单克隆抗体的应用领域
01 肿瘤诊断与治疗
用于肿瘤的早期诊断、靶 向治疗、免疫治疗等。
03
免疫性疾病。
02 感染性疾病
用于诊断和治疗病毒性肝 炎、艾滋病等感染性疾病 。
04 心血管疾病
用于诊断和治疗冠心病、
心肌梗死等心血管疾病。
杂交瘤技术与单克隆抗体技
杂交瘤技术与单克隆抗体技
04
术的实验操作流程
杂交瘤技术的实验操作流程
准备免疫动物
选择适宜的免疫动物 ，如小鼠或大鼠，并 进行免疫接种，刺激 机体产生特异性抗体 。
制备杂交瘤细胞
将免疫动物的脾细胞 与肿瘤细胞融合，形 成杂交瘤细胞。
克隆化筛选
通过选择性培养基筛 选出能够产生所需抗 体的杂交瘤细胞，并 进行克隆化培养。
杂交瘤技术制备单克隆抗体 2
效价的单克隆抗体。
免疫脾细胞
处于免疫状态脾脏中的B淋 巴母细胞或浆母细胞
动 物：
6～12周龄 20g～25g体重
2、骨髓瘤缺陷细胞株的培养和选择
对骨髓瘤细胞的要求：
（1）与免疫动物属同一品系（融合效率高、便于接种杂交瘤细胞在同一品
系小鼠腹腔中产生大量的单克隆抗体。）
（2）选择HGPRT—株（次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型)或TK（胸
阳性杂交瘤细胞的克隆化培养
克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是从细胞群体
中选育出遗传稳定的能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，淘
汰非特异性的，或遗传不稳定的杂交瘤细胞。 克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次
经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即 扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染 色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失， 还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗 体。
腺嘧啶核苷激酶）缺陷型的骨髓瘤细胞（细胞系在核酸类似物存在时会产生 HGPRT缺乏的突变株，该突变株不能在HAT培养基上生长。）
(3)在细胞融合前两周复苏骨髓瘤细胞，保证骨髓瘤细胞处于对数 生长期。
骨髓瘤细胞的培养
1、采用一般的动物细胞培养液，小牛血清的浓度一般 在10%~20%，细胞的最大密度不得超过106cells/mL。
细胞融合
细胞融合剂：
PEG（聚乙二醇）:分子量4000 的PEG是最常用的细胞 融合剂
作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞
膜易打开而有助于细胞融合 作用特点：不同的分子质量、浓度、作用时间、pH,可 能直接影响融合效果
细胞融合的步骤
(1)将1ml 40％的PEG液，逐滴加入细胞团中，在60秒内加完，同时不断 轻微转动离心管或用手指轻弹离心管； (2)在不断转动离心管中加1ml无血清培养液，60秒钟内加完； (3)于5分钟内慢慢加完20ml无血清培养液；此时细胞对机械损伤非常敏 感， (4)离心(800转／分，8分钟)，去上清，用完全培养液10ml悬浮，轻轻混 匀； (5)取96孔板，每孔加50l； (6)取等体积细胞悬液，向另一96孔板中加 50l ； (7)送入5％CO2培养箱，37℃培养，24小时后更换成HAT选择性培养掖。 后每隔2—3天半量换HAT一次； 3—6天后出现杂交细胞集落。
杂交瘤技术制备单克隆抗体
杂交瘤技术制备单克隆抗体1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。
免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。
单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。
单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。
表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较单克隆抗体制备的一般流程如下:单克隆抗体的制备方法如下。
（一）动物的选择与免疫1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
杂交瘤技术与单克隆抗体
人—鼠杂交瘤：融合方法根本与鼠—鼠杂交瘤一样。 亲本骨髓瘤细胞是小鼠骨髓瘤细胞，亲本B细胞那么来 源于人外周血淋巴细胞、淋巴结细胞、脾细胞。但 是，人—鼠杂交瘤的人单克隆抗体分泌性能很不稳 定，多数情况下杂交瘤会很快失去抗体分泌能力。 人—人杂交瘤：可通过建立人骨髓瘤或其他人细胞系 与人淋巴细胞融合来制备人单克隆抗体。人源性融合 亲本细胞需具有较高的融合率、产生的杂交瘤核型稳 定并能产生一定量的具有特异性的抗体等特征。人— 人杂交瘤核型稳定，然而遗憾的是可供利用的人类骨 髓瘤细胞种类非常有限。
红霉素不敏感几乎到达100%，青霉素达 86%。
1983年23价肺炎链球菌夾膜多糖疫苗 PPV23诞生。2000年针对2岁以下儿童的 7价肺炎链球菌蛋白结合疫苗PPV7问世 。目前已经接种3亿剂，世界第一大单 个疫苗。
2003年 SARS病毒
SARS病毒属于冠状病毒 科，病毒粒子多呈圆形， 有囊膜，外周有冠状排列 的纤突，病毒直径在80120nm之间。 感染病毒的细胞线粒体肿 胀，局部线粒体外膜或嵴 溶解，病毒颗粒主要分布 在胞浆的内质网池、胞浆 空泡内和细胞外，多聚集 成堆。
科勒〔Kohler〕
米尔斯坦〔Milstein〕
12-2 单克隆抗体
〔一〕免疫学根底
1 抗原：
进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用 的外源物质。 包括：蛋白质、多糖、核酸、病毒、细菌、各 种细胞等。 特点：构造表位性〔抗原决定簇 〕
免疫原特异性：〔抗原与抗体的反响〕抗原---刺激 免疫系统---发生免疫应答-----产生应答产物。
免疫系统：包括体液免疫和细胞免疫，参与的细 胞包括 B淋巴细胞——发育成浆细胞，分泌抗体，参与 体液免疫，脾脏可以分泌。 T淋巴细胞——发育成吞噬细胞，直接参与细胞 免疫，经胸腺分泌。不能产生抗体，帮助B淋巴 细胞产生抗体。
单克隆抗体制备(共44张PPT)
单克隆抗体制备流程图
亲本细胞的选择与制备
骨髓瘤细胞 (NS-1)
骨髓瘤细胞需定期用
细胞株稳定，易传代培养；
细胞株本身不产生Ig
是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖 转换酶 缺陷株
(hypoxanthine-guanine phos phoribosyl transferase ,HGPRT)
最常用的骨髓瘤细胞是NS-1 和SP2/0细胞株
PEG可导致细胞膜上 脂类物质的物理结构 重排，使细胞膜容易 打开而有助于细胞融 合。
常见的几种融合形式
细胞DNA合成途经
HAT选择培养基
三种关键成分：
次黄嘌呤（hypoxanthine,H）
氨基蝶呤（aminopterin,A）
胸腺嘧啶（thymidine ，T）
◆是根据细胞内嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的 生物合成途径设计的用于筛选杂交瘤细胞
因此在传统抗血清中，都含有许多种不同的抗体，分别针对这些不同的eptope。
每 mL 含有100 个 但除非抗原来源困难或有其它目的，我们仍采用传统方法，因免疫反应的启动机制非常复杂，生物整体的免疫反应是最可靠的。
单克隆抗体的制备流程和应用
细胞，若只要取一个 试采血 确定有抗体产生后，即可取出 脾脏以收集脾脏细胞(大多为B 细胞) 与骨髓瘤细胞进行 细胞融合。
2)体外增量培养法： 把杂交瘤细胞在大型培养槽 中培养，收集培养液上清即得抗体，但每 mL 只得 约数 mg，浓度较腹水稀约一千倍。最近有一种细 胞培养瓶，可产生如腹水般浓度的上清，但价格极 为昂贵 (IBS Integra Bioscience: Integra Celline)。
单克隆抗体的性质鉴定
种抗体；因此在传统抗血清中， 都含有许多种不同的抗体，分
第四章 单克隆抗体杂交瘤技术课件
ห้องสมุดไป่ตู้
抗原决定簇 Antigenic determinant
图4-5 抗原决定簇 Fig. Antigenic determinant
•Antigenic determinant
是决定抗原性的特 殊化学基团。 •抗原分子越大，决 定簇的数目越多。 •如白喉类毒素有8 个抗原决定簇，流 感病毒有40多个抗 原决定簇。
体液免疫humoralimmunity细胞免疫cellularimmunity作用对象清除游离在寄主细胞外的抗原及其产生的有毒物质摧毁侵入到寄主细胞内的病毒胞内寄生菌或外来的组织团块癌变的细胞等作用方式通过效应b细胞浆细胞分泌抗体并与抗原发生特异性结合来清除抗原通过效应t细胞杀伤t细胞分泌穿孔素perforin使靶细胞溶解死亡2体液免疫与细胞免疫的区别与关系体液免疫与细胞免疫的区别鼻粘膜细胞上有很多微细绒毛因此大大增大了药物吸收的有效面积粘膜细胞下有着丰富的血管和淋巴管药物通过粘膜吸收后可以直接进入体循环减少了药物发挥功效的时间
由于一个抗原有多各决定簇，所以用抗原免疫 动物后获得的免疫血清均为多克隆抗体。
有时抗原上某些决定簇是很强的免疫反应触发 剂，使同一抗原上其他决定簇可能引发更强的 免疫反应，所以每次制备的多克隆抗体效价各 不相同;
前一次制备的多克隆抗体对某一决定簇的抗体 含量高，下次制备的真对该决定簇的抗体又可 能较低。
McAb具专一性、誉为 “生物导弹”。
McAb--顾名思义与“多克隆抗体”相对而 言.
多克隆抗体（polyclonal antibody）:由同一 抗原诱导而产生的针对多个不同抗原决定 簇的抗体即称为多克隆抗体。
动物机体一生会接触到许多种抗原物质， 同时一个抗原分子表面也会有几个抗原决 定簇。每一个抗原决定簇都会使机体产生 一种特异性的抗体。
抗原决定簇 Antigenic determinant
图4-5 抗原决定簇 Fig. Antigenic determinant
•Antigenic determinant
是决定抗原性的特 殊化学基团。 •抗原分子越大，决 定簇的数目越多。 •如白喉类毒素有8 个抗原决定簇，流 感病毒有40多个抗 原决定簇。
体液免疫humoralimmunity细胞免疫cellularimmunity作用对象清除游离在寄主细胞外的抗原及其产生的有毒物质摧毁侵入到寄主细胞内的病毒胞内寄生菌或外来的组织团块癌变的细胞等作用方式通过效应b细胞浆细胞分泌抗体并与抗原发生特异性结合来清除抗原通过效应t细胞杀伤t细胞分泌穿孔素perforin使靶细胞溶解死亡2体液免疫与细胞免疫的区别与关系体液免疫与细胞免疫的区别鼻粘膜细胞上有很多微细绒毛因此大大增大了药物吸收的有效面积粘膜细胞下有着丰富的血管和淋巴管药物通过粘膜吸收后可以直接进入体循环减少了药物发挥功效的时间
由于一个抗原有多各决定簇，所以用抗原免疫 动物后获得的免疫血清均为多克隆抗体。
有时抗原上某些决定簇是很强的免疫反应触发 剂，使同一抗原上其他决定簇可能引发更强的 免疫反应，所以每次制备的多克隆抗体效价各 不相同;
前一次制备的多克隆抗体对某一决定簇的抗体 含量高，下次制备的真对该决定簇的抗体又可 能较低。
McAb具专一性、誉为 “生物导弹”。
McAb--顾名思义与“多克隆抗体”相对而 言.
多克隆抗体（polyclonal antibody）:由同一 抗原诱导而产生的针对多个不同抗原决定 簇的抗体即称为多克隆抗体。
动物机体一生会接触到许多种抗原物质， 同时一个抗原分子表面也会有几个抗原决 定簇。每一个抗原决定簇都会使机体产生 一种特异性的抗体。
杂交瘤技术与单克隆抗体
作者研 究疾病诊断方法提供参 考资料。
关键字 ： 杂交瘤技术 ； 单克隆抗体
中 图分 类 号 ： ￥ ８ ５ ２ ． ３ ６
文献标 识 码 ： Ｂ
文章编 号 ： １ ０ ０ ３ — ４ ８ ８ ９ （ ２ ０ １ ４） ０ ４ — ０ ０ ２ ６ — ０ ２
１ 杂 交瘤技 术 的原 理 与操作 流 程（ 见 图１）
【 ３ 】 杜红霞． 鸡毒霉形体代谢抑制性单克隆抗体 的研制及初步 应用． 硕 士学位论文 ． 武汉 ： 华 中农业大学， ２ ０ ０ ７ ．
于人为处理和质量控制 ，这些优点使它一问世就受
到高度重视 。单抗作为单一抗原决定簇 的分子识别 【 ４ ］ 顾 云， 张莉 ， 大野 尚仁 ． 鼠和兔 中流行性 感冒病毒抗体的 工具有其独特的优势 ， 除在生物医学基础研究 、 免疫 制备及测定【 Ｊ Ｊ ． 药物 生 物技 术 ， ２ ０ ０ ３ ， １ ０ （ ２ ） ： １ ０ ６ ． 和治疗方面得到广泛应用外 ，在疫病诊断和检疫 中 ［ ５ 】 贾世玉 ， 刘俊 华． 正辛酸与硫 酸铵 两步沉淀法纯化腹 水单 正在并将继续发挥重要作用。 为被动免疫而应用 ， 即单抗发挥主要作用。 它与病变 细胞结合 ，通过抗体介导的细胞毒性作用（ Ａ Ｄ Ｃ Ｃ ） ， 或者抗原抗体复合物激活补体来杀灭病变细胞 。实 践证明 ，用单克隆抗体直接注入动物体内治疗疾病 （ 人工被动免疫 ） 效果显著 。另一种方法是单抗作为
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隆选择并伴 随着后续的克隆扩增 。Ｍ ｉ ｌ ｓ ｔ ｅ ｉ ｎ 和Ｋ ６ ｈ ｌ ｅ ｒ 以克 隆选择学说为理论根据巧妙地提出 以下学说 ：