杂交瘤技术

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2. 细胞融合技术
分泌抗体 短命 脾细胞 (B淋巴细胞)
长命 不分泌抗体
骨髓瘤细胞
分泌抗体 长命 杂交瘤细胞
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3. 杂交瘤细胞的筛选
脾细胞 (B淋巴细胞)
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞பைடு நூலகம்筛选出
脾细胞脾细胞
不能长期存活
骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞
脾细胞 骨髓瘤细胞
不能长期存活
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HAT培养基筛选
B淋巴细胞： HGPRT+，TK+ 骨髓瘤细胞： HGPRTˉ或TKˉ 杂交瘤细胞： HGPRT+，TK+
HGPRTˉ或TKˉ细胞在HAT培养基上不能存活； HGPRTˉ与TKˉ细胞融合或与正常细胞融合后的
杂交细胞，可在HAT培养基上存活。
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HGPRTˉ细胞的筛选
可人为地筛选或致突变，诱发一些细胞缺乏 HGPRT或缺乏TK，如用毒性药物8-氮鸟嘌呤（8azaguanine，8-AG)作用于细胞株，可选育出 HGPRTˉ细胞株，这是因为HGPRT+细胞利用了8AG后，因合成毒性核苷酸而死亡。
存活但短命 死亡
存活
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（三）单克隆抗体的制备过程
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三个基本环节和两个决定因素
选
择 培
免疫鼠
培养筛选
取脾细胞 骨髓瘤细胞系
饲 养
养 基
细 胞
（HAT）
融合
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1、免疫小鼠和脾细胞的制备
免疫动物：6~8周龄BALB／c小鼠 免疫抗原：各种病毒、细菌、细胞或可溶性抗原。一
般可溶性抗原用完全佐剂效果较好。 免疫途径：皮下、腹腔或静脉注射 免疫程序：基础免疫2次，静脉再加强免疫1次。 免疫后3~5天解剖，取脾细胞配制成适量浓度细胞悬液
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12、杂交瘤抗体的贮存
因为反复冷冻和融化往往导致杂交瘤抗体变性，所以 对培养上清可加0.1%NaN3在4℃保存，对血清和腹水可以 小容量分装，冻存-70 ℃以下，在-20 ℃保存亦可。将它 们以硫酸铵沉淀物的形式（加等体积的饱和硫酸铵），保 存在4 ℃是一种节约、完全和长期贮存的方法。对纯化的 杂交瘤蛋白保存在4 ℃下，含0.1% NaN3的PBS中。
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（4）慢慢加入预热的无血清1640 1ml ，1min，目的是稀释 PEG；再加入1ml，1min。最后加入7ml ，2-3min内加完， 并持续轻轻搅动，此时细胞对机械损伤非常敏感。
（5）离心1000rpm，室温10 min，去上清。
（6）取预热的15%牛血清1640，先加10ml，对准细胞团加液， 使细胞颗粒均匀分布于悬液中；再加入90ml。
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（3）电融合法
电融合法是80年代出现的细胞融合技术，将细胞置于电 场中，使它们彼此靠近紧密接触并排列呈串，然后在高 强度、短时程的直流电脉冲的作用下，相互连接的细胞 膜被击穿而导致细胞融合。
其优点是：
融合率高、重复性强、对细胞伤害小； 可在显微镜下观察融合过程； 诱导过程可控性强。
取抗体阳性的克隆，可继续克隆化或进一步扩 大培养。
阳性杂交瘤细胞应及时冻存，以防染色体丢失、 变异及污染。
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9、抗体大量生产
方法主要有两种： 体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从
上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一 般培养液含量为10～60μg／ml，如果大量生产， 费用较高。 体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。腹水 可达每毫升几毫克抗体。
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H—hypoxanthine （次黄嘌呤） A—aminopterin （氨基喋呤） T—thymidine （胸腺嘧啶核苷）
糖和
A
氨基酸
核苷酸 前体
T
TMP
TK HGPRT
H
IMP
核苷酸 DNA
DNA的生物合成途径与HAT选择培养基
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凡能在HAT选择培养基中生长的细胞，必须能利 用外源性次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T）；
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电融合示意图
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3、杂种细胞的筛选
人工诱导细胞融合是一个随 机的过程，可能产生多种类型的 细胞，筛选的目的是获得优良的 杂种细胞。
应根据其细胞特性来选择适 当的筛选方法（如酶缺陷、药物 抗性标记、营养缺陷、温度敏感 等）。
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HAT是最常用的筛选系统
原理
细胞DNA合成有两条途径： 主要合成途径 补救合成途径
（7）加入已含有饲养细胞的96孔板或24孔板（每孔加入细胞 数分别为2×105 和1×106 ）。
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6、HAT 和HT选择培养
（1）接种24h后加入HAT选择培养液。 （2）融合后7~10天用HAT培养液半量换液(留一半旧的加
一半新的)，以后每2~3天半量换液一次。 （3）两周后换HT培养液（目的是洗出残留于细胞内的氨
的动物脾细胞融合，形成的杂交细胞即可产生 抗体，又可无限增殖，从而创立了具有划时代 意义的杂交瘤技术。 这种技术的基础是细胞融合技术。
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一、细胞融合（cell fusion）
1、概述
细胞融合是指两个或更多个相同 或不同细胞通过膜融合形成单个 细胞的过程。
可在自发或人工诱导下发生。
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两个不同基因型的细胞可形成一个杂种细胞。 基本过程包括细胞融合形成异核体、异核体 通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单 核的细胞称为杂种细胞或杂交细胞（hybrid cell） 。
B淋巴细胞（B lymphocytes）： 接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异 性抗体，在体液免疫中具有重要功能。 本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细 胞分裂，存活一段时间后便会死亡——短命 细胞。
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骨髓瘤细胞 (myeloma cells)： 恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可 永远分裂和存活——长命细胞。 没有抗体分泌。 经筛选HGPRTˉ或TKˉ。
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由此可见，HAT选择培养基及补救合成途 径酶缺乏的突变细胞株的建立，是细胞融合后 选择出杂交细胞株的关键因素。
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二、杂交瘤技术与单克隆抗体的制备
（一）基本概念
杂交瘤细胞 指肿瘤细胞与体细胞融合形成的杂交细
胞，它既保留了肿瘤细胞无限增殖的能力， 又具有参与融合的体细胞的一些特征。
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杂交瘤技术（也称单克隆抗体制备技术） 是指建立杂交瘤细胞系的技术，通常指B
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主要合成途径
即利用糖和氨基酸这些可从培养液中摄取 的简单的含碳、含氮复合物来合成核苷酸，进 而合成DNA。
这一过程需四氢叶酸参与供甲基及甲酰基， 因此该途径可被叶酸拮抗物氨基喋呤阻断。
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补救合成途径
细胞可通过次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移 酶 （HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）， 将核苷酸前体合成核苷酸以供DNA合成的原料。
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2、诱导细胞融合的常用方法
生物方法：如仙台病毒 化学方法：如聚乙二醇（PEG） 物理方法：如电融合
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（1）仙台病毒融合法
常用的能诱导细胞融合的病毒有疱疹病毒、牛痘病毒和 副粘病毒科病毒等。其中属副粘病毒科的仙台病毒应用 最为广泛。
因病毒具有凝集细胞的能力，某些病毒的糖蛋白还有促 进细胞融合的功能，因此可以用紫外线灭活的此类病毒 诱导细胞融合。
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用 灭 活 的 病 毒 诱 导 的 动 物 细 胞 融 合 过 程 示 意 图
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（2）聚乙二醇融合法
聚乙二醇（polyethyleneglycol ，PEG） 分子可在质膜 之间形成分子桥，使细胞质膜发生粘连促使质膜的融 合。
其优点是融合成本低，勿需特殊设备；简便、融合效 率较高。因此在1975年获得成功后很快取代仙台病毒 法。
克隆培养方法
有限稀释法（较常用）：使96孔板上其中36孔每孔5个 细胞，另36孔每孔1个细胞，余下24孔每孔0.5个细胞； 亦有经连续稀释成最终30个/ml，每孔0.1ml接种48孔。
软琼脂平板法 FACS选取法 显微挑选法
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克隆化培养后，通常在10~14天测抗体进行阳 性克隆的筛查。
杂交瘤技术
（hybridoma technique）
安徽医科大学微生物学教研室
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内容纲要
细胞融合
概述 诱导细胞融合的常用方法 杂种细胞的筛选（HAT）
杂交瘤技术与单克隆抗体的制备
基本概念 三个技术关键 单克隆抗体的制备过程
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杂交瘤技术又称单克隆抗体制备技术。 1975年，Kohler和Milstein将骨髓瘤细胞与免疫
（1）SP2/0细胞和免疫脾细胞按1:4的比例放于一个50ml离 心管中，充分混匀，离心后尽量吸尽上清，置于37℃玻 璃杯水浴中。
（2） 用1ml吸管将1ml 37 ℃预热的50%PEG溶液，逐滴缓 慢加入混合细胞管中（1min以内加完），边加边轻轻搅 拌。
（3）继续搅动团块1分钟，目的使所有的细胞尽可能地与 PEG接触。
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8、克隆化
由于在一个培养孔内不能保证只存在一种杂交瘤细胞系， 因此必需克隆化。一般需克隆化3~5次，才能获得稳定 型基因和稳定分泌特异性抗体的细胞。
要尽早克隆化，以防止单克隆抗体细胞系被竞争淘汰。 分泌抗体的克隆一般生长较慢。
克隆化后的杂交瘤细胞也需定期再克隆，以防突变和染 色体丢失。
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用于融合。
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2、骨髓瘤细胞的准备
常用骨髓瘤细胞系有NS1、SP2/0、X63等。 选择要点：稳定易培养、自身不分泌抗体、融
合率高、HGPRT缺陷株（8-氮鸟嘌呤定期筛 选）。 融合条件：对数生长期，良好的细胞形态，活 力细胞达95%。
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3、饲养细胞的准备
在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨 髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数 分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加 入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞 称为饲养细胞（Feeder cells）。