杂交瘤技术和单克隆抗体技术
杂交瘤技术制备单克隆抗体
杂交瘤技术制备单克隆抗体1975年Koehler和Milstein在体细胞融合技术的基础上创立了淋巴细胞杂交瘤（hybri-doma)技术，他们将丧失合成次黄嘌吟-鸟嘌吟磷酸核糖转移酶的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞举行融合，融合的细胞不仅可以延续传代，而且能分泌抗绵羊红细胞的单克隆抗体，这项技术开创了医学与生物学基础讨论的新纪元。
杂交瘤技术具有周期长，高度延续的特点，涉及大量组织细胞培养，细胞免疫学和免疫化学等办法。
一、杂交瘤技术的原理 B淋巴细胞接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，是重要的体液免疫细胞。
B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再举行细胞分裂。
骨髓瘤细胞是恶性增殖的转化细胞，通过细胞融合技术将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，所产生的融合细胞既具有亲本骨髓瘤细胞的无限繁殖的生物学特性，又具有另一亲本B淋巴细胞合成、分泌特异性抗体的能力。
B淋巴细胞杂交瘤技术的原理可以从以下三个关键之处来阐明：首先是细胞融合剂的挑选，用法细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于互相粘连而融合在一起。
最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。
（PEG1000～2000）是目前最常用的细胞融合剂，普通应用浓度为40% (W/V)。
第二，细胞融合的挑选培养基中有3种关键成分：次黄嘌呤( hypoxanthine, H )、甲氨蝶吟( aminopterin, A）和(thymidine, T )，所以取三者的字头称为HAT培养基。
甲氨蝶吟是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT-细胞株，所以不能在该培养基中生长。
惟独融合细胞具有亲代双方的遗传性能，能在HAT培养基中长久存活与繁殖。
第三，细胞融合是随机的过程，在已经融合的细胞中有相当比例的无关细胞的融合体，需经筛选去除。
筛选过程普通分为两步举行：一是融合细胞的抗体筛选，二是在此基础上举行的特异性抗体筛选，从而找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后举行冻存、体外培养或动物腹腔接种培养，这一过程称作克隆化。
简述杂交瘤技术生产单克隆抗体的原理。
简述杂交瘤技术生产单克隆抗体的原理。
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制备单克隆抗体
从筛选得到的杂交瘤 细胞中提取单克隆抗 体，进行纯化和定量 。
应用单克隆抗体
将单克隆抗体应用于 临床诊断、治疗和基 础研究等领域。
单克隆抗体技术的实验操作流程
免疫原制备
制备免疫原，如抗原蛋白或多糖等，并进行 纯化和定量。
免疫动物
将免疫原注射入动物体内，刺激机体产生特异 性抗体。
制备杂交瘤细胞
杂交瘤技术和单克隆
抗体技术ppt课件模
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2024-01-11
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较 • 杂交瘤技术与单克隆抗体技术的实
验操作流程 • 杂交瘤技术与单克隆抗体技术的应
用案例
01
杂交瘤技术简介
杂交瘤技术的定义
杂交瘤技术是一种将免疫系统的B淋巴细胞与骨髓瘤细 胞融合，形成杂交瘤细胞的技术。
单克隆抗体的应用领域
01 肿瘤诊断与治疗
用于肿瘤的早期诊断、靶 向治疗、免疫治疗等。
03
免疫性疾病。
02 感染性疾病
用于诊断和治疗病毒性肝 炎、艾滋病等感染性疾病 。
04 心血管疾病
用于诊断和治疗冠心病、
心肌梗死等心血管疾病。
杂交瘤技术与单克隆抗体技
杂交瘤技术与单克隆抗体技
04
术的实验操作流程
杂交瘤技术的实验操作流程
准备免疫动物
选择适宜的免疫动物 ，如小鼠或大鼠，并 进行免疫接种，刺激 机体产生特异性抗体 。
制备杂交瘤细胞
将免疫动物的脾细胞 与肿瘤细胞融合，形 成杂交瘤细胞。
克隆化筛选
通过选择性培养基筛 选出能够产生所需抗 体的杂交瘤细胞，并 进行克隆化培养。
杂交瘤技术和单克隆抗体技术
四、免疫系统能将外来微生物和分子与本身成份区别开来。
五、系统记忆每一次与外来抗原旳遭遇
免疫反应遇到同一抗原时一次比一次强，具有特异性。免 疫记忆能够延续动物终身。
六、免疫反应旳许多性质是经过克隆选择拟定旳
一种抗原活化一种淋巴细胞。当淋巴细胞表面受体结合 抗原时，B淋巴细胞就被活化，分泌抗体被刺激而增殖（急 剧分裂克隆）。
重链分子量为5.5kDlt；轻链分子量为2.5kDlt。 二、不同类型抗体旳区别
IgG、IgM、IgA、IgE和IgD因重链形式不同而有所区别。 它们旳重链分别称作γ、μ、α、ε和δ。
重链旳不同使这些蛋白具有不同形式旳免疫功能，而且在 完毕反应成熟旳不同阶段发挥作用。这些差别主要是因为Fc 片段上旳蛋白序列不同所致。
四、抗体重链旳分子构造
重链旳序列也存在可变区和恒定区（图2-1）。IgG重链具 有一种可变区和三个恒定区，每区含110个氨基酸，其他重 链具有附加旳恒定区。
IgG重链序列也显示γ链有四种亚类，即：IgG1、IgG2a、 IgG2b和IgG3。鼠重链多肽编码区在第12染色体上。
五、重链和轻链旳可变区形成抗原结合位点
B细胞：分泌抗体，并在细胞表面携带同一抗体旳修饰型， 功能相当于受体。
毒性T细胞：携带结合抗原旳细胞表面受体。 辅助T细胞：在控制B细胞和细胞毒性T细胞反应方面起关 键旳调整作用。
体液介导旳适应性免疫反应：体液反应引起产生可结合外 来抗原旳循环抗体，由B淋巴细胞产生，由辅助T淋巴细胞 介导是抗体技术旳基础。
HAT选择培养基：HAT培养基是指在细胞培养基中加有次黄 嘌呤（H）、氨基喋呤（A）或氮丝氨酸（A）和胸腺嘧啶核 苷（T）旳培养基。细胞为合成DNA所需要旳嘌呤和嘧啶，可 由两条途径取得。一条为主要途径，即从磷酸核糖焦磷酸 （PRPP）和谷氨酰胺合成肌苷酸（IMP），进而转变为脱氧 鸟苷三磷酸（dGTP），及从脱氧尿苷酸（dUMP）合成脱氧 胸苷酸（dTMP），再转变为脱氧胸苷三磷酸（dTTP）。这 一合成途径，可为加入旳会克制为嘌呤或嘧啶合成提供甲基旳 二氢叶酸还原酶旳叶酸类似物A所阻断。此时，只有HGPRT+ 和TK+细胞才干经过另一条应急途径，利用外加旳核苷酸旳 “前体”H来合成IMP和利用T来合成dTMP，而得以有活下 来。相反，HGPRT－和TK－细胞则将因无法利用H和T来合成 DNA而死亡。所以，在HGPRT－和TK－细胞融合后，应用 HAT培养基即可将经过基因互补而同步取得HGPRT和TK酶 旳杂种细胞筛选出来。
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理一、引言单克隆抗体（Monoclonal Antibody，mAb）是由单一B细胞克隆产生的抗体，具有高度特异性和亲和力。
其制备方法主要有杂交瘤技术、酶联免疫吸附试验法（ELISA）、荧光激发技术等。
其中，杂交瘤技术是制备单克隆抗体最重要的方法之一。
二、杂交瘤技术基本原理1. B细胞与肿瘤细胞的融合杂交瘤技术的基本原理是将体内产生的特异性抗体B细胞与无限增殖能力的肿瘤细胞进行融合，形成可分泌大量同种特异性抗体的杂交瘤细胞。
在此过程中，B细胞提供了高度特异性的抗体基因组，而肿瘤细胞提供了无限增殖能力。
2. 杂交瘤细胞筛选和分离将获得的杂交瘤细胞进行筛选和分离，以获取单一同种特异性抗体产生的杂交瘤细胞株。
这里需要注意的是，筛选和分离的条件需要严格控制，以确保所得到的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力。
3. 单克隆抗体的大规模制备通过对单克隆抗体杂交瘤细胞株进行培养和扩增，可以大规模制备单克隆抗体。
此过程中需要注意对培养条件、生长因子、营养物质等进行优化，以提高单克隆抗体的产量和质量。
三、杂交瘤技术的优点1. 高度特异性和亲和力通过杂交瘤技术制备的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力，可以用于检测、诊断、治疗等领域。
2. 无限复制能力杂交瘤细胞具有无限复制能力，可以大规模制备同种特异性抗体。
3. 可重复性好由于单一B细胞产生的同种特异性抗体都是完全相同的，因此通过杂交瘤技术制备出来的单克隆抗体具有良好的可重复性。
四、杂交瘤技术存在的问题及解决方法1. 杂交瘤细胞的稳定性杂交瘤细胞的稳定性对于单克隆抗体的制备至关重要。
为了提高杂交瘤细胞的稳定性，可以采用多种方法，如对培养条件进行优化、添加生长因子等。
2. 克隆选择在杂交瘤技术中，克隆选择是一个非常重要的环节。
为了确保所得到的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力，需要对杂交瘤细胞进行筛选和分离。
这里需要注意的是，筛选和分离的条件需要严格控制。
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理介绍在生物医学研究和临床诊断中，单克隆抗体作为一种重要的实验工具和治疗药物被广泛应用。
其中，利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体具有高特异性和高亲和力的特点，成为研究人员的首选。
本文将介绍利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理。
杂交瘤技术概述杂交瘤技术是一种将体外培养的B细胞（淋巴细胞瘤）与骨髓瘤细胞融合，从而形成能够长期生长并分泌抗体的细胞株的方法。
这种技术利用了淋巴细胞瘤的抗体产生能力和骨髓瘤细胞的无限生长能力，使得细胞株能够持续产生具有特定结构和功能的单克隆抗体。
杂交瘤技术的步骤利用杂交瘤技术制备单克隆抗体一般包括以下几个步骤：1. 免疫原注射首先，在动物体内注射免疫原，激发机体产生特异性抗体。
免疫原可以是蛋白质、多肽、糖类、脂质等。
免疫原的选择要根据研究目的和所需抗体的特异性来确定。
2. B细胞提取从动物体内采集淋巴组织，提取出具有特异性抗体的B细胞。
B细胞是产生抗体的主要细胞类型，其具有表面上能与抗原结合的B细胞受体（BCR）。
3. 骨髓瘤细胞准备获得与B细胞体表BCR相对应的骨髓瘤细胞株。
骨髓瘤是一种恶性浆细胞增生性疾病，该病的细胞具有无限生长的能力。
4. 细胞融合将提取的B细胞与骨髓瘤细胞进行体外融合，形成杂交瘤细胞。
融合细胞的过程一般利用聚乙二醇（PEG）或电脉冲等方法实现。
5. 杂交瘤细胞筛选将杂交瘤细胞进行培养，并添加合适的选择性培养基，筛选出能够分泌特异性抗体的单个细胞克隆。
6. 单克隆抗体制备从筛选出的单个细胞克隆中，取出细胞进行进一步培养和扩增。
细胞培养过程中，单克隆细胞会不断分裂和分泌抗体，从而得到大量的单克隆抗体。
制备单克隆抗体的原理利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的原理主要基于两个关键特性：1. B细胞多样性B细胞具有多样的B细胞受体，这使得它们能够识别和结合各种不同的抗原。
当机体暴露于免疫原时，B细胞会通过BCR与特异性抗原结合，并启动免疫反应。
什么是杂交瘤技术？杂交瘤技术的原理及步骤
什么是杂交瘤技术？杂交瘤技术的原理及步骤杂交瘤技术（hybridoma technique）即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。
它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。
克勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）（1975）证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。
这一技术的基础是细胞融合技术。
骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。
如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合，则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，融合的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。
杂交瘤技术原理及步骤：杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。
这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。
被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。
在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。
其原理从下列3个主要步骤阐明。
(一)细胞的选择与融合建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。
脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。
融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。
·选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。
多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。
使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起。
杂交瘤技术与单克隆抗体概要
杂交瘤技术与单克隆抗体概要（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）摘要：用绵羊红细胞免疫B A L B / C 小鼠, 取其脾淋巴细胞与同品系小鼠的骨髓瘤细胞融合, 形成的杂交细胞能分泌脾淋巴细胞的单一型抗体分子, 又具有骨髓瘤细胞无限增殖的特性。
这种杂交细胞叫做杂交瘤。
杂交瘤能在离体培养条件下分泌抗体,如果移植在同品系或F 1小鼠体内, 在其血清或腹水中可以获得较高浓度的抗体。
这种抗体是由单一增殖的纯系细胞分泌的单克隆抗体。
由于其纯度高、特异性强、可以复制[1],这种技术自问世以来已广泛应用于疾病的免疫诊断、免疫治疗和免疫预防等各个领域[2]。
本文对杂交瘤技术的基本原理、程序、工作中注意问题、优点及应用等进行了综述。
关键词：杂交瘤技术基本原理程序注意问题优点应用自从1975年Kohler和Milstein建立杂交瘤技术以来[3]，淋巴细胞杂交瘤技术在许多研究实验室成为产生特异性抗体的重要工具，日益引起基础科学和临床工作者以及工业家的注意[4]。
许多科技工作者开展了这项新的生物技术的研究和应用,该技术不仅促进了现代医学、微生物学、肿瘤学、免疫学、寄生虫学和药学等学科的发展，并且正在从生物医学领域向工业、农业和牧业等新领域渗透，取得了一定的成果。
[5] 对其今后的发展和应用，N.A.5taines[6]和A.W.Edwards[7]都有较详细的叙述。
1979年我国引入了这项技术，并分别在北京、上海举办多次培训班，推广该项技术,[8]开展了杂交瘤技术的研究[9-10],并且取得显著成绩，但是由于国内的设备和物资条件的影响，杂交瘤技术开展比较慢，仍需迎头赶上。
1 单克隆抗体的概念单克隆抗体是由一个淋巴细胞增殖分化形成一个基因相同的细胞群称为克隆，或无性繁殖细胞系（简称细胞系），由单一克隆产生的抗体称为单克隆抗体。
众所周知，我们人体或动物体受天然抗原刺激后产生的抗体是多种抗体组成的混合抗体，即所谓的多克隆抗体。
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第二节、抗体分子
抗体是具有共同结构和功能形式的一大类糖蛋白。抗体分 成五类：IgG、IgM、IgA、IgE和IgD（见表2-1）。
一、IgG类抗体有两个相同的抗原结合位点 含有抗原结合位点的两个区域被称作Fab片段，涉及到免疫 调节的蛋白区称作Fc片段，在Fab和Fc片段之间的部分称作 铰链区。 重链分子量为5.5kDlt；轻链分子量为2.5kDlt。 二、不同类型抗体的区别 IgG、IgM、IgA、IgE和IgD因重链形式不同而有所区别。 它们的重链分别称作γ、μ、α、ε和δ。 重链的不同使这些蛋白具有不同形式的免疫功能，并且在 完成反应成熟的不同阶段发挥作用。这些差异主要是由于Fc 片段上的蛋白序列不同所致。 轻链只有两种：κ、λ。
细胞介导的适应性免疫反应：毒性T淋巴细胞结合于外来 或感染的细胞，随后将这些细胞裂解，辅助T细胞参与该反 应。 二、免疫系统能特异性地对无数种分子反应。
免疫系统持续地受无数抗原刺激。免疫系统的一个主要形 式是它能合成大量的抗体及细胞表面受体。各个带有不同抗 原结合位点的抗体和T细胞受体与外来分子的结合提供了免 疫反应特异性的基础。
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四、免疫系统能将外来微生物和分子与自身成分区别开来。
五、系统记忆每一次与外来抗原的遭遇
免疫反应遇到同一抗原时一次比一次强，具有特异性。免 疫记忆可以延续动物终生。
六、免疫反应的许多性质是通过克隆选择确定的
一种抗原活化一种淋巴细胞。当淋巴细胞表面受体结合 抗原时，B淋巴细胞就被活化，分泌抗体被刺激而增殖（急剧 分裂克隆）。
变区和重链的三个超变区。这些超变区形成抗原抗体结合的
接触残基的主体，同时这些超变区位于扩展进入抗原反应区
的短环上。由于它们是实际的抗原结合位点，故被认为是互
补决定区。
六、功能性κ、λ轻链和重链基因的一个明显特征是在所有
细胞中这些基因转录后的选择性剪接是不同的（见图2）。
200个V区，4个功能性J区。
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3、免疫系统含有109以上淋巴细胞遍布全身，保证了它们在 任何部位都能迅速反应。淋巴细胞由骨髓中的原始干细胞不 断产生，经血液及淋巴系统循环，暂时停顿并积聚于称作淋 巴器官的特异化的结构中，在哺乳动物中就是淋巴结和肝脏。 在免疫反应过程中，免疫原积聚于一个淋巴器官中，这个淋 巴器官就变成了免疫反应的焦点。
第四讲 杂交瘤细胞和单克隆抗体技术
第一节、免疫的基本知识
一、免疫系统：分非适应性免疫和适应性免疫两类。 1、非适应性免疫是由非特异性反应的细胞介导的。如：巨 噬细胞的吞噬作用，泌细胞分泌的溶菌酶，以及中性细胞造 成的细胞裂解机制。 2、适应性免疫：是针对特定分子，而且可经反复暴露于外 源分子使之加强淋巴细胞合成细胞表面受体或分泌特异性蛋 白结合外源分子。这些分泌的蛋白称为抗体；可与抗体结合 的分子被称为抗原。当一个分子被用于诱导适应性反应时， 这个分子就被叫做免疫原。
B细胞：分泌抗体，并在细胞表面携带同一抗体的修饰型， 功能相当于受体。
毒性T细胞：携带结合抗原的细胞表面受体。 辅助T细胞：在控制B细胞和细胞毒性T细胞反应方面起关 键的调节作用。
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体液介导的适应性免疫反应：体液反应引发产生可结合外 来抗原的循环抗体，由B淋巴细胞产生，由辅助T淋巴细胞 介导是抗版
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五、重链和轻链的可变区形成抗原结合位点
一个重链的可变区和一个轻链的可变区结合形成一个抗原
结合位点。可变区的异质性提供了动物有效进行免疫反应所
需的无数结合位点的基础。序列异质性并不是由整个可变区
的每一部分决定的，而是集中在与抗原接触的位点上。多数
可变性决定于每一个链的三个短区，它们形成轻链的三个超
七、形成λ轻链pre-mRNA外显子也要重排（图3）。V-J-C-
J-C。
八、形成功能性重链基因需要pre-mRNA外显子的重排（
图4）。50—100种可变区，可1编2个辑版D区，4个J区。
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九、这些重组及其它机制产生了无数的抗原结合位点。 十、等位基因排斥确保在任一B细胞中只有重新排列的一个 轻链和一个重链被表达。产生不同重链和轻链的基因重组不 总是产生一个功能基因，在B细胞分化过程中，轻链重排开始 于κ区内。然后，若二倍体基因中的一个首先重排，产生一个 功能性等位基因，另一个拷贝则进行重组。若二个重组都产 生非功能性等位基因，那么重组就要λ位点开始，以同样的机 制产生功能性重链。一旦重组产生一个功能性抗体，一个未 知的机制就制止进一步重组。将抗原性结合位点固定，直到 细胞死亡。这个机制叫等位基因排斥。它可以解释为什么B淋 巴细胞分泌的只有一种抗原结合位点的抗体和抗体只有一种 类型的轻链。 十一、其它：重组被用于生产各种类和亚类的抗体。
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3
三、个别淋巴细胞识别个别抗原 一个细胞识别一个抗原，因为单一淋巴细胞上的所有抗 原受体是相同的。 在成熟淋巴细胞表面的所有受体都是糖蛋白，体细胞基 因重组、突变及基因转录后加工等使受体产生107个以上的 结合位点。抗原特异性通过确保只有一个类型的受体在一 个细胞内被合成的过程来维持。 虽然B细胞表面抗体和T细胞表面受体都具有类似的结构 ，但它们是由不同的基因家族编码的，其表达具有细胞型 的特异性。B细胞上的表面抗体能结合可溶性抗原，而T细 胞受体仅仅识别在其它细胞表面展示的抗原
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6
三、抗体轻链的分子结构 比较轻链的氨基酸结构发现，轻链有一个恒定区和一个可 变区。轻链由220个氨基酸组成，分为两个区，每个区由大 约110个氨基酸组成。-NH2末端那半部分是异源性的，称为 可变区（V）；羧基末端那部分称为恒定区（C）。 恒定区有两种类型：一种是决定κ轻链的，另一种是决定λ 轻链的。κ轻链基因位于第6染色体上，而λ轻链的基因则位 于第16染色体上。 四、抗体重链的分子结构 重链的序列也存在可变区和恒定区（图2-1）。IgG重链含 有一个可变区和三个恒定区，每区含110个氨基酸，其它重 链含有附加的恒定区。 IgG重链序列也显示γ链有四种亚类，即：IgG1、IgG2a、 IgG2b和IgG3。鼠重链多肽编码区在第12染色体上。