单克隆抗体制备知识点
单克隆抗体制备课件
肿瘤免疫治疗
单克隆抗体可以用于免疫调节治疗，通过与免疫细胞表面的受体或配体结合，调节免疫细胞的活性，治疗自身免疫性疾病和感染性疾病。
免疫调节治疗
单克隆抗体可以用于制备诊断试剂，通过与特定抗原或抗体结合，用于临床诊断和实验室检测。
单克隆抗体可以用于治疗疾病，如肿瘤、自身免疫性疾病等。
单克隆抗体可以用于生物标记，如免疫荧光、免疫组化等。
03
02
01
02
CHAPTER
单克隆抗体的制备流程
根据实验需求，选择适当的抗原作为免疫原，如蛋白质、多肽、细胞或组织等。
确定免疫原
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
对免疫原进行纯化，去除杂质，提高免疫效果。
免疫原的纯化
将免疫原与佐剂混合，增强免疫反应。
THANKS
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单克隆抗体由单一B细胞克隆产生，因此其结构和特性高度均一，具有很高的特异性。
高度均一
单克隆抗体与抗原的亲和力很高，可以检测出低浓度的抗原。
高亲和力
单克隆抗体可以在长期保存过程中保持稳定，便于长期保存和使用。
长期稳定
单克隆抗体可以用于诊断疾病，如免疫组化、酶联免疫吸附试验等。
诊断试剂
生物药物
生物标记
利用离心、过滤等方法去除细胞碎片和杂质，获得较为纯净的抗体溶液。
初步纯化
利用凝胶颗粒的孔径大小分离不同大小的抗体分子，去除杂蛋白和其他杂质。
凝胶过滤层析
利用抗体分子的电荷性质分离不同电荷状态的抗体分子，进一步提高纯度。
离子交换层析
04
CHAPTER
单克隆抗体的质量控制
单克隆抗体制备
单克隆抗体制备单克隆抗体的制备是蛋白质工程技术的重要研究内容，有着重要的应用价值。
单克隆抗体的制备原理是：充分发挥宿主生物体（大肠杆菌、哺乳动物细胞等）免疫功能，运用宿主中细胞免疫反应产生浓缩单克隆抗体。
一、抗原介绍1、抗原的来源：单克隆抗体的抗原来源丰富，可以是完整的抗原蛋白、抗原酶、细胞因子、小分子物质以及抗原细胞等。
2、抗原的选择：在单克隆抗体制备的过程中，选择抗原是十分重要的，需要综合考察所选抗原的抗原性、可表达性、毒性及抗击物种的范围。
二、免疫动物1、种类：动物免疫是单克隆抗体制备中的重要步骤，常用的宿主有小鼠、大鼠、兔子、猪以及山羊等。
2、准备：在实验免疫之前，需要对动物体进行一定的准备，主要包括规范动物体衣服清洁、照明、温度调节以及饲养等。
三、免疫原剂的选择1、动力学考察：实验免疫之前，需要对实验免疫抗原和抗体的动力学机制进行考察，以确定细胞免疫强度和灌注次数。
2、选择：免疫原剂的选择要根据实验的需要以及实验动物的免疫能力，可以通过单克隆抗体表位等技术进行原剂优化。
四、免疫原剂的灌注1、灌注体积：灌注体积要根据实验动物的大小和重量以及抗体细胞水平调节，以保证药物的有效抗性。
2、体外灌注：为了提高抗体的产量，需要进行体外灌注，如采用实验室常用试管灌注等方式，将相应药物注入动物体内。
五、细胞免疫1、吞噬作用：属于免疫细胞，吞噬病原体是细胞免疫杀灭病毒的关键，充分发挥宿主生物免疫功能，进而形成抗体。
2、细胞免疫诱导：当病原体进入宿主体后，需要经过几个免疫过程，从而最终诱导细胞免疫，从而产生抗体。
六、浓缩抗体1、浓缩：通过单克隆抗体分离技术，将混杂在抗原的复合抗体进行浓缩，产生有针对性的单克隆抗体。
2、纯化：要获取单克隆抗体，必须对前期产生的抗体进行纯化处理，利用配体结合和抗原亲和纯化以及膜分离等技术，产生纯度较高的单克隆抗体。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项单克隆抗体（Monoclonal antibody，mAb）是指由单一B细胞克隆分离得到的抗体，其具有高特异性和高亲和力。
制备单克隆抗体的方法主要有杂交瘤技术和重组DNA技术。
以下是单克隆抗体制备的步骤及注意事项。
步骤一：抗原免疫1.选择合适的抗原：根据需要检测的分子或细胞表面标志物，选择合适的抗原。
2.免疫动物：常用的动物有小鼠、兔子等。
选择适合的动物后，根据抗原的种类和免疫动物对该抗原的敏感性，设计免疫方案。
3.免疫计划：免疫计划包括免疫剂量、免疫途径和免疫次数等。
通常先进行原位免疫，然后再以单体或混合抗原进行体内免疫。
步骤二：细胞融合1.收集脾细胞：在最佳时期，解剖免疫动物，取出脾脏。
2.细胞培养：将收集的脾细胞在无菌条件下分散成单个细胞，并在培养基中培养，以供细胞融合使用。
3.准备骨髓瘤细胞：选择合适的骨髓瘤细胞，例如NS0或SP2/0等。
将其培养至对数生长期。
4.细胞融合：在抗原刺激下，将脾细胞与骨髓瘤细胞以一定比例混合，用聚乙烯醇或其他化合物促进细胞融合。
步骤三：细胞筛选与扩展1. HT增重培养：用含有hprt缺陷的培养基筛选融合细胞，以选择杂交瘤细胞。
2. Limited Dilution扩展：以一细胞一孔的方式将杂交瘤细胞进行有限稀释，使其实现单克隆化。
3.细胞培养：将单克隆细胞株移植到培养瓶中，进行培养和扩增。
步骤四：单克隆抗体鉴定1.酶联免疫吸附试验（ELISA）：用ELISA方法筛选单克隆细胞株，检测其抗原特异性。
2.免疫组织化学检测：将单克隆抗体应用于细胞和组织切片，检测其在特定细胞或组织中的反应。
3.流式细胞术：通过流式细胞仪检测单克隆抗体与特定细胞表面标志物的结合情况。
步骤五：单克隆抗体生产与纯化1.细胞培养：将单克隆细胞株培养扩增至一定程度。
2.抗体收集：将培养上清液进行抗体收集。
3.纯化与浓缩：利用亲和层析、离子交换、凝胶过滤等技术，对抗体进行纯化和浓缩。
单克隆抗体高三知识点
单克隆抗体高三知识点单克隆抗体是一类由单一种克隆的细胞分泌的抗体，其具有特异性和高亲和力的特点。
现在让我们来了解一下高三生物单克隆抗体的一些重要知识点。
一、单克隆抗体的概念单克隆抗体是指通过将与特定抗原结合的淋巴细胞与癌症细胞融合，从而获得一种能够识别与之融合的抗原的抗体。
二、制备单克隆抗体的步骤1. 抗原注射：将目标抗原注射到小鼠体内。
2. 细胞融合：分离与抗原结合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞，使它们融合成为杂交瘤细胞。
3. 杂交瘤细胞筛选：利用杂交瘤细胞的克隆性，将其培养于选择性培养基中，筛选出能够产生特定单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。
4. 杂交瘤细胞培养：将筛选出的单克隆抗体杂交瘤细胞克隆培养，并收集细胞培养液。
5. 检测单克隆抗体：使用不同的方法对单克隆抗体进行检测，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫组织化学（IHC）等。
三、单克隆抗体的应用1. 生命科学研究：单克隆抗体可以用于研究细胞分子组成、细胞信号传导途径、蛋白质相互作用等。
2. 临床诊断：单克隆抗体可以用于检测疾病标志物，如癌胚抗原、风湿因子等，提高疾病的早期诊断率。
3. 药物研发：单克隆抗体具有特异性和高亲和力，可以作为药物靶点，用于治疗肿瘤、自身免疫病等疾病。
4. 蛋白质纯化：单克隆抗体可以用于纯化目标蛋白质，提高纯度和产量。
四、单克隆抗体的优势和局限性1. 优势：单克隆抗体具有高特异性和高亲和力，能够准确识别目标抗原，具有较低的交叉反应性。
2. 局限性：制备单克隆抗体的过程较为复杂和耗时，制备成本较高；同时，单克隆抗体可能存在较长的保护期，需要定期验证。
五、常见的单克隆抗体药物1. 曲妥珠单抗（Rituximab）：用于治疗非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病等。
2. 重组人源化抗EGFR单抗（Cetuximab）：用于治疗表达高表皮生长因子受体的转移性结直肠癌等。
3. 格列卫单抗（Trastuzumab）：用于治疗表达高表皮生长因子受体2的早期和转移性乳腺癌等。
【高中生物】高中生物知识点：单克隆抗体
【高中生物】高中生物知识点：单克隆抗体单克隆抗体：1、抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。
从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。
2、单克隆抗体的制备（1）制备产生特异性抗体的B淋巴细胞：向免疫小鼠体内注射特定的抗原，然后从小鼠脾内获得相应的B淋巴细胞（2）获得杂交瘤细胞①将鼠的骨髓瘤细胞与脾细胞中形成的B淋巴细胞融合；②用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞，该杂种细胞既能够增殖又能产生抗体。
（3）克隆化培养和抗体检测（4）将杂交瘤细胞在体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖（5）提取单克隆抗体：从细胞培养液或小鼠的腹水中提取3、单克隆抗体的应用(1)作为诊断试剂，具有准确、高效、简易、快速的优点。
(2)用于治疗疾病和运载药物。
血清抗体与单克隆抗体的比较：名称产生特点血清抗体由B淋巴一般从血清中分离，产量低、纯度低、特异性差单克隆抗体由杂交瘤细胞分泌特异性强，灵敏度高，能大量制备知识点拨：1、融合的结果是有很多不符合要求的；如有2个B淋巴细胞融合的细胞等，所以要进行筛选。
2、筛选出能够分泌所需抗体的杂种细胞。
3、杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。
4、单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。
5、单克隆抗体的作用：作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。
用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。
知识拓展：制备单克隆抗体过程中的筛选：筛选是将未融合的B淋巴细胞、骨髓瘤细胞以及BB融合、瘤瘤融合的细胞通过选择培养基淘汰，筛选出B瘤融合的细胞。
筛选是将产生特定抗体的B瘤细胞通过细胞培养用相应抗原检测的办法筛选出来。
因为从体内取免疫过的B淋巴细胞时取出很多种，形成的杂交瘤细胞有很多种，所以需筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞。
相关高中生物知识点：植物体细胞杂交技术植物体细胞杂交技术：1、植物体细胞杂交技术：就是将不同种的植物体细胞原生质体在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成完整植物体的技术。
单克隆抗体的制备及特点
单克隆抗体的制备及特点单克隆抗体一、单克性抗体的制备1、免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生效应B淋巴细胞的过程。
2、将准备好的骨髓瘤细胞与效应B淋巴细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇或灭活的病毒。
在聚乙二醇或灭活的病毒作用下，各种效应B淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
3、选择性培养选择性培养的目的是筛杂交瘤细胞。
在选择性培养基上未融合的骨髓瘤细胞、未融合的淋巴细胞，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。
只有融合的杂交瘤细胞才能在选择性培养基存活，杂交瘤细胞既能无限增殖，又能分泌特异性抗体4、杂交瘤细胞的克隆化培养和抗体阳性检测。
选择性培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。
5、单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内培养法和体外培养法。
(1)体内培养法；用注射器抽取腹水，从中可获得大量单克隆抗体。
(2)体外培养法将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。
从培养液中获取所需要的单克隆抗体。
二、单克性抗体的特点特异性强、灵敏度高、能大量制备三、杂交瘤细胞的特点杂交瘤细胞既能无限增殖，又能分泌特异性抗体四、单克隆抗体制备过程中有三个筛选过程1、从脾脏中筛选出多种效应B细胞。
2、在特定的培养基中筛选杂交瘤细胞3、进行克隆化培养和抗体阳性检测，筛选出能产生特定抗体并能无限增殖的杂交瘤细胞。
五、单克隆抗体应用的基本原理是：抗原——抗体的的特异性结合。
六、单克隆抗体的主要应用1、作为诊断试剂：单克隆抗体最广泛的应用就是作为诊断试剂。
由于单克隆抗体纯度高、特异强，能准确地识别抗原物质的细微差别，并能与一定抗原特异性结合。
2、用于治疗疾病和运载药物。
把抗癌细胞的单克隆抗体放射性同位素、化学药物或细胞毒素结合制成生物导弹。
利用抗原——抗体的的特异性结合，借助单克隆抗体的导向作用，能将药物定向带到癌细胞所在部位，在原位杀死癌细胞，不损伤正常细胞、药剂量少、疗效高、毒副作用小。
单克隆抗体的制备
（二）单克隆抗体在水产养殖中的应用
1.用于细菌感染性疾病的诊断 2.用于病毒感染性疾病的诊断 3.在水产激素方面的应用 4.在水产基础方面的应用 5.在水产品药物残留中方面的应用
谢谢
瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成
细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤 作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。利用 培养或小鼠腹腔接种法，便能得到大量的、高滴度的 、非常均一的抗体。
二.单克隆抗体原 通过细胞融合技术将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合， 理
所产生的融合细胞既具有亲本骨髓瘤细胞的无限繁殖 的生物学特性，又具有另一亲本B淋巴细胞合成、分 泌特异性抗体的能力。应用此技术从一个抗体分泌性
五.单克隆抗体的应用
（一）单克隆抗体在农业和医学上的应用
1.检测微生物 （1）检测特异的病毒 （2）鉴定细菌种类及亚型，或其测耐药性. （3）检测寄生虫或其他病原体 2.检测微量成分 （1）检测机体内微量成分 （2）检测药物残留 3.确定免疫机制、分析抗原结构、定位病原组织. 4.在肿瘤症疗中的应用 5.用于蛋白质的提纯
单克隆抗体的制备
目录
一.单克隆抗体的基本概括
二.单克隆抗体原理
三.单克隆抗体制备的步骤
四.单克隆抗体的优缺点 五.单克隆抗体的应用
一.单克隆抗体的基本概括
1975年分子生物学家G.J.F.keler和C. Milstein在细胞杂交技术的基础上，创建杂交瘤技术 ，把体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原 免疫后的小鼠脾细胞融合，成为杂交细胞系，既具有
B细胞杂交瘤分裂增殖，形成一个大的细胞克隆。由B
细胞杂交瘤细胞克隆产生的只识别抗原分子上某一个 抗原决定簇的纯抗体，即单克隆抗体。单克隆抗体具 有纯度高、特异性强、利于实验标准化即可大量生产 供应等特点。
单克隆抗体制备讲义
调整细胞数1×10５／ml ↓
加入96孔板，100μl／孔 ↓
放入37℃CO2孵箱培养
常用骨髓瘤细胞系有：
NS1 SP2／0 X63 Ag8.653
骨髓瘤细胞系选择要点：
动物品系相同 不产生免疫球蛋白重链和轻链 对HAT敏感 融合后产生稳定性高的杂交瘤细胞
脾细胞悬液的制备：
在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液 洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器 针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾 脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数 为２×10８左右。
细胞融合，选择杂交瘤 1. 细胞融合
2. HAT选择杂交瘤
抗体初筛与克隆化
以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。 常用的方法有:
(Hypoxanthine, H)
DNA
HAT培养基
H（Hypoxanthine, H）次黄嘌呤
A（Aminopterin）氨基喋呤 叶酸的拮抗物，阻断DNA合成的主要途
径
T (Thymidine, T) 胸腺。
（二）细胞融合前准备
1. 免疫方案
颗粒性抗原
可溶性抗原
2. 饲养细胞 3. 骨髓瘤细胞 4. 免疫脾细胞
小鼠腹腔巨噬细胞的制备
常用BaLb／c小鼠6～10周龄
↓ 拉颈处死 浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟
↓ 用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜
↓ 用无菌注射器注入6～8ml培养液
↓ 反复冲洗，吸出冲洗液
↓ 放入10ml离心管，1200转／分离心5～6分钟
多价抗原
单克隆 （致敏的B细胞）
单克隆抗体
2 单克隆抗体
基本原理
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单克隆抗体制备过程中经过两次筛选
单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。
第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。
普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。
其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D 途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。
在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D 途径”。
另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。
因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D 途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。
对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。
惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S 途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。
第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。
通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。
因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。
单克隆抗体制备的基本原理与过程
原理：
B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。
B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。
将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。
这种技术即称为单克隆抗体技术。
过程
1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系 Balb/c 小鼠。
免疫的方法取决于所用抗原的性质。
免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。
2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG 的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。
骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。
3）细胞融合的关键:
1技术上的误差常常导致融合的失败。
例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。
这必然要失败的。
2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。
4）阳性克隆的筛选应尽早进行。
通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。
检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。
具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。
常用的方法有 RIA法、 ELISA法和免疫荧光法等。
其中ELISA法最简便，RIA法最准确。
阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。
5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。
克隆化应尽早进行并反复筛选。
这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。
反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。
克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。
（1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。
这种方法操作复杂，效率低，故不常用。
（2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。
第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。
由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克
隆才成。
应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都应冷冻保存，以便重复检查，避免丢失有意义的细胞。
（3）软琼脂法：将杂交瘤细胞稀释到一定密度，然后与琼脂混悬。
在琼脂中的细胞不能自由移动，彼此互不相混，从而达到单细胞培养的目的。
但此法不如有限稀释法好。
（4）荧光激光细胞分类法：用抗原包被的荧光乳胶微球标记杂交瘤细胞，然后根据抗原与杂交瘤细胞结合的特异性选出细胞，并进行单细胞培养。
6）细胞的冻存与复苏
7）大规模单克隆抗体的制备选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。
抗体制备有两种方法。
一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。
该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。
最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。
选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。
通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。
该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。
此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。
摘要在单克隆抗体制备中两次提到筛选问题，对于两次筛选的方法和目的始终是一些人的困惑，那么两次筛选的目的和方法到底是什么。
单克隆抗体制备过程中两次提到了筛选，对于两次筛选中的目的和方法许多人也存在疑惑，那么到底是如何筛选的呢？现总结如下：第一次筛选: 首先在（效应）B淋巴细胞和骨髓瘤细胞进行杂交时可能出现的情况应该先弄清楚，
（一）可能的情况有：
1 （效应）B淋巴细胞和（效应）B淋巴细胞的融合
2 （效应）B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合（即杂交瘤细胞）
3 骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞的融合（即瘤瘤细胞）
4 单个骨髓瘤细胞
5 单个（效应）B淋巴细胞
（二）筛选的目的————获得杂交瘤细胞
（三）筛选的方法
用选择性培养基来完成，即HAT培养基。
含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶，其中氨基喋呤可阻断DNA合成的主要途径。
主要途径阻断后，依靠应急途径即在HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）和TK （胸苷激酶）作用下，利用胸腺嘧啶和次黄嘌呤合成DNA，缺少其中一
种，DNA合成不能发生。
用于杂交的骨髓瘤细胞系均由经有毒药物诱导而成选择产生的代谢缺陷型细胞，细胞内均无TK或HGPRT，所以单个或融合骨髓瘤细胞在HAT培养液中将死亡。
B细胞虽然有HGPRT和TK，但在体外通常培养条件下，尤其是在单个细胞环境下难于长期存活和增殖传代。
因此只有杂交瘤细胞才能在HAT培养液中生长繁殖。
所以通过以上方法可以选择出杂交瘤细胞，但虽然都是杂交瘤细胞，但可能是同一抗原的不同抗原决定基刺激产生的。
所以产生抗体是不纯的。
如果不进一步提纯，这样得到的是多克隆抗体。
所以就有了第二次筛选。
第二次筛选要想获得单克隆抗体，所以必须得到由一个细胞分裂而成的一个细胞群，由这样的细胞群产生的抗体才是真正意义的单克隆抗体。
（一）筛选的目的
筛选只针对某一种特定的抗原决定簇产生抗体的杂交瘤细胞，即得到由一个细胞分裂而成的一个细胞群并且能产生所需抗体
（二）筛选的方法
1、分离单个细胞置入多孔培养板的每个孔中培养
2、检测每孔细胞是否产生所注射抗原的抗体（即教材插图中提到的选出能产生特定抗体的细胞群）所以筛选的条件是两层意思：单个细胞单孔培养保证每个孔中的细胞在产生抗体时是针对同一抗原的同一抗原决定簇产生的的，但每个孔中细胞却不一定都能产生抗体，把那些不产生抗体的细胞淘汰，对能分泌针对抗原某一决定簇抗体的阳性细胞选择下来继续克隆，从而保证大量的生产所需抗体。
3、对选择下来的细胞进行克隆方法有两种：一种可以在体外培养；一种可以一直到小鼠腹腔中增殖,即可从中提取所需要的单克隆抗体。