鸡胚细胞原代培养
实验三、鸡胚细胞的原代培养
3.接种与培养
• A.植块培养 定义：——将组织切割成一定大小的 植块，接种到培养器皿中，加入 培养液进行培养。 目的：——观察植块的组织学生长行为， ——使植块细胞迁移并在植块外 分裂增殖，取出植块后得 到细胞培养物。
植块培养接种方法
1.用湿润的吸管将植块小心吸取并轻轻吹 出到培养瓶中，按照一定的形式或者间 隔将植块排列好；
作业
• 实验报告 包括今天实验的步骤，要对今天的实验过程和 结果进行分析。
预习下节课内容：标本观察 1、组织块法培养细胞的观察 培养24h后，倒置
显微镜下可观察到少量的细胞从组织块边沿游 离出来;48h后，可见大量的细胞放射状排列与 组织块周围，这些细胞细胞核较大，细胞质内 含物少，透明度高，彼此间排列紧密。
(大镊子夹瓶塞，用吸管取溶液) 5. 小镊剥内膜，挑出鸡胚于培养皿A。
6. 于A中漂洗后转入B，再漂洗一遍，除去血块, 至清洗液澄清。
7. 左手中镊按住鸡胚，右手小镊剥取鸡胚皮肤。 8. 转入10ml的小烧杯，用小剪剪碎组织，
0.5~1mm3。 9. 用吸管小心吸取组织碎块，接种于培养瓶生长
面（6个点）。
生长面
10.翻转培养瓶，用另外一支吸管吸取1640 液4ml加于培养瓶。
11.盖塞子，平放拿出超净台。 12.培养瓶侧面标记。清洗用具，交回。 13. 37℃培养，第二天小心翻转培养瓶。培
养一周。
24h
含鸡胚鸡蛋示意图
操作示意图
标记气室示意图
培养中的人成纤维细胞
注意事项
• 1. 自取材开始，保持所有组织细胞处于无 菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。
• C悬浮细胞培养
某些白血病细胞、腹水瘤细胞等。 对培养基不断搅拌或者对培养器皿进行 振荡、旋转而维持细胞的悬浮状态。
鸡胚原代细胞的培养
鸡胚原代细胞的培养{能力目标}·了解鸡胚的发育过程。
·掌握鸡胚原代细胞制备及培养技术。
{实验器材}(1)Hank's液、含10%~20%血清的细胞培养液、碘酊棉、酒精棉、0.25%胰酶。
(2)超净工作台或生物安全柜、细胞培养瓶、吸尔球、灭菌吸管、平皿、毛吸管、离心管、剪刀、小镊子、培养箱、倒置显微镜。
{实验内容及操作步骤}一、鸡胚的孵育受精鸡胚放在蛋托上，大头朝上，人温箱培养。
在温箱底部放上一盘水，将温度调至37.8℃即可。
二、鸡胚的发育过程(1)观察方法：将9~12日龄的鸡胚取出，放人平皿中进行观察。
(2)鸡胚的发育：要采用鸡胚进行细胞培养时，应对鸡胚的发育有一个初步了解。
鸡胚的发育是由受精卵开始的，它在通过输卵管时，已开始分裂，当产卵时已在卵黄上部形成一层细胞，名为胚盘，在适宜的条件下胚盘继续分裂生长。
在发育过程中由卵黄和卵白中获取养料和水分，由于胚体与卵黄分开的缘故，胚胎只通过卵黄带与卵黄相连。
发育的早期形成三个胚层，即外胚层、中胚层和内胚层，由此形成胚胎的各个器官和组织。
一般孵育至第3d出现尿囊，为直肠腹侧部分的膨出物，尿囊膜是由内胚层和中胚层构成的。
至第4~5d胚体为羊膜、尿囊膜及绒毛膜层包被。
羊膜系由外胚层和中胚层组成，开始时紧贴于胚体上，后来腔内逐渐充满羊水。
尿膜在生长发育的过程中，与绒毛膜相连而成绒毛尿囊膜，此膜为三层细胞组成。
外层为外胚层，内层为内胚层，中间为中胚层细胞，其中血管甚多有两条主动脉自卵黄囊延伸到此膜中，与此并行有两条主静脉，汇流成一较大的尿囊静脉。
绒毛尿囊膜系鸡胚的呼吸器官，位于壳膜之内。
此膜生长发育很快，第10d己包围了整个鸡胚，此时鸡胚己出现羽毛，呼吸道的发育在第12~15d之间出现。
'胚胎体积逐渐增大时，胚胎腔外体液亦日趋减少，孵出小鸡时已无胚胎腔外体液。
在发育早期，尿囊液及羊水的成分与生理盐水溶液相差无几，12d后羊水的蛋白含量及黏稠度增加，尿囊腔积累了肾脏的排泄物，因此，在12d或13d 后，尿囊液由于尿酸盐的存在，使原来透明的液体呈现混浊。
鸡胚细胞的原代培养
2.塑料篮子内：无菌袖套
操
1. 2. 3. 4. 5. 6.
作
照egg, 画气室线。 戴无菌袖套。点燃酒精灯，手部消毒。 台面消毒; 将egg置于蛋座（气室朝上），外表消毒。 中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。 小镊撕内膜，挑出鸡胚→培养皿A中清洗。
标记气室示意图
操
• • • • • •
作
照egg, 画气室线。 戴无菌袖套。点燃酒精灯，手部消毒。 台面消毒; 将egg置于蛋座（气室朝上），外表消毒。 中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。 小镊撕内膜，挑出鸡胚→培养皿A中用 Hank’s液清洗。
鉴定各种细胞产物的程序。
无血清培养液中补加物具有独特性：适用于某
种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞 株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需 补加物也不同。
无血清培养基的目前使用情况：尚处于研究阶
段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养 基使用时还需添加血清
人间充质干细胞无血清培养基:上海依科赛公司 CHO无血清培养基：维森特公司 树突状细胞无血清培养基：达优公司
肺
肝
腿部 肌肉
肾脏
摘自 《细胞培养基本知识》-Invitrogen
注 意
清理台面,用品洗净,交回。酒பைடு நூலகம்灯和酒精棉球瓶要补 加酒精。 实验报告：这次的原代培养与细胞传代和冻存的实验 一起写一份细胞报告。 重点：要对实验结果进行分析和讨论。 实验考核：本次实验的实验结果记入一次实验课成绩 考核内容。无菌实验操作记入实验考核。
鸡胚细胞的原代培养
摘自 《细胞培养基本知识》-Invitrogen
细胞培养的用途
照片来自 《动物细胞培养-基本技术指南》
提
纲
1.培养基的类型及配制 2.原代培养的过程 3.原代培养的注意事项 4. 本次实验操作要点 5.实践操作
鸡胚培养和细胞培养
第一节鸡胚接种一、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。
目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。
可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。
虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。
鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。
当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非 SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。
因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。
原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用 SPF 鸡胚。
一般说来，孵育至 8-14 天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒， 14 天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。
在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。
孵育至 21 天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。
鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。
如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。
气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。
鸡胚原代细胞培养
鸡胚原代细胞培养鸡胚原代细胞培养细胞是一微小而完整的生命单位，它组成各种生物体并生长、繁殖。
在生命体外，如果提供类似生物体内的环境条件，细胞也能生长繁殖。
要使每个细胞都能从人造环境中获得营养物质，必须将组织块分散成单个细胞。
组织培养法是目前培养病毒应用最广的一种方法，其优点是：一般没有隐性感染，没有免疫抵抗力，便于选择易感细胞，实验条件易于控制，成本便宜，经济适用。
组织培养法多应用于病毒的分离、鉴定、病毒感染细胞的机制、生产疫苗和抗原等。
很多组织，包括鸡胚，各种动物的肾脏组织，人胎羊膜细胞或流产胎儿组织等均可作组织培养的来源。
细胞来源的选择，主要是根据细胞对病毒的敏感性而定。
组织培养的方法中以单层细胞培养是最常用的方法，它又有原代和次代细胞培养、二倍体细胞株和传代细胞系三种类型。
原代培养是指将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。
本试验介绍原代细胞的鸡胚成纤维细胞培养方法。
（一）实验目的了解单层细胞培养方法（二）实验材料1、10日龄鸡胚。
2、1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒。
3、无菌组织培养瓶、吸管、滴管、剪子、镊子、超净工作台、CO2培养箱、蒸水器、纯水器（生物级）、滤器、真空泵、高压灭菌锅、培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）。
（三）实验方法1、用碘酒消毒鸡卵气室端外壳，并将鸡胚直立于卵架上。
以镊子将小鸡取出放在无菌培养皿内，去头，爪、内脏和骨骼，用Hanks氏溶液洗2-3次。
2、用小剪在小烧瓶内将鸡胚剪成小块（1～２mm3），加Hankr 氏溶液（约１０ml）冲洗2-3次，静置１～２分钟，用毛细吸管吸去液体，依同法再洗涤２次，将血球充分洗去。
鸡胚细胞的原代培养共28页
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6、黄金时代是在我们的前面，而不在 我们的 后面。
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7、心急吃不了热汤圆。
•
8、你可以很有个性，但某些时候收 敛。
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9、只为成功找方法，不为失败找借口 (蹩脚 的工人 总是说 工具不 好)。
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10、只要下定决心克服恐惧，便几乎 能克服 任何恐 惧。因 为，请 记住， 除了在 脑海中 ，恐惧 无处藏 身。-- 戴尔． 卡耐基 。
31、只有永远躺在泥坑里的人，才不会再掉进坑里。——黑格尔 32、希望的灯一旦熄灭，生活刹那间变成了一片黑暗。——普列姆昌德 33、希望是人生的乳母。——科策布 34、形成天才的决定因素应该是勤奋。——郭沫若 35、学到很多东西的诀窍，就是一下子不要学很多。——洛克
鸡胚培养和细胞培养
第一节鸡胚接种一、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。
目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。
可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。
虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。
鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。
当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非 SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。
因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。
原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用 SPF 鸡胚。
一般说来，孵育至 8-14 天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒， 14 天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。
在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。
孵育至 21 天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。
鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。
如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。
气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。
鸡胚培养和细胞培养
第一节鸡胚接种一、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。
目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。
可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。
虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。
鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。
当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非 SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。
因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。
原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用 SPF 鸡胚。
一般说来，孵育至 8-14 天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒， 14 天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。
在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。
孵育至 21 天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。
鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。
如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。
气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。