引物合成订购表-Oligo(dT)15
引物保护碱基列表格
11月13日引物合成的详解需要什么级其余引物？答：引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。
依据实验需要，确立订购引物的纯度级别。
应用引物长度要求纯度级别要求一般PCR扩增<45base OPC一般PCR扩增>45base PAGE诊疗PCR扩增<40base OPC,PAGE DNA测序20base左右OPC亚克隆，点突变等依据实验要求定OPC,PAGE，HPLC基因建立（全基因合成）依据实验要求定PAGE反义核酸依据实验要求定PAGE修饰引物依据实验要求定PAGE,HPLC怎样计算引物的浓度？答：引物保留在高浓度的状况下比较稳固。
引物一般配制成10-50pmol/ul。
一般状况下，建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按以下方式计算：V(微升)=OD数*（乘）33*（乘）（乘）20000/(除)引物的分子量。
引物的分子量能够从合成报告单上获取。
假如需要配制成其余浓度，按上述公式换算。
注意：1OD260=33ug/ml.怎样计算引物的Tm值？答：引物设计软件都能够给出Tm，与引物长度、碱基构成、引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)关于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm=+xLog10[Na+]+(%GC)–600/size公式中，Size=引物长度。
怎样溶解引物？答：干燥后的引物质地特别松散，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末采集到管底。
依据计算出的体积加入去离子无菌水或10mMTris缓冲液，室温搁置几分钟，振荡助溶，离心将溶液采集到管底。
溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这类条件下不稳固。
怎样保留引物？答：引物合成后，经过一系列办理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。
引物在溶解前，室温状态下能够长久保留。
反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求
反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求1）随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA 分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2）Oligo(dT)：是一种仅对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。
由于Poly(A+)RNA只占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
特别适合检测多个基因的表达，这样可以节约反转录的试剂，cDNA可以多次使用，可用于检测稀有基因是否表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平。
3）特异性引物：最特异的反转录方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。
用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。
做Real Time PCR时，用于SYBR Green I/Eva Green 法时的一对引物与一般PCR的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。
引物设计的要求：①Tm=55-65℃②GC=30-80%③PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-300bp之间都可。
④引物的退火温度要高，一般要在60℃以上。
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。
而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。
至于设计软件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS都应该可以的。
华大引物合成订购单
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物订购邮箱：order@
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捷瑞引物订单合同模板
标准兼并碱基代码 M:(A/C) R:(A/G) W:(A/T) S:(C/G) Y:(C/T) K:(G/T) V:(A/C/G) H:(A/C/T) D:(A/G/T) B:(C/G/T) N:(A/G/C/T)
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上海捷瑞生物工程有限公司引物合成订购表
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上海捷瑞生物工程有限公
张富 中科院上海药物所 中科院上海药物所 上海市浦东新区松涛路646号四楼 13521856279 zhangfu678@
温馨提示: 为防止漏单而耽搁您的实验,若您在一天内没有收到本公司的确认回复邮件,请电话查询:021捷瑞 ID Primer名称 序列(5'to3') 207 GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNGTAA 208 T GGCCACGCGTCGACTAGTAC 碱基数
RT-PCR原理与实验操作步骤讲解
RT-PCR原理与实验操作步骤讲解RT-PCR原理与实验操作步骤关键词：RT-PCR 逆转录酶reversetranscriptase 聚合酶链式反应引物设计DNA 聚合酶一、知识背景：1、基因表达：DNA RNA Protein单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白）共合成109个丝心蛋白。
因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。
2、PCR技术(olymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。
在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA 聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。
反应分三步：A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。
C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5' 3'方向延伸。
以上三步为一个循环，如此反复。
3、逆转录酶和RT-PCR逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA 第一条链；2、Rnase水解活性：水解RNANA杂合体中的RNA；3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.二、RT-PCR的准备：1、引物的设计及其原则：1）引物的特异性决定PCR反应特异性。
因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。
在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。
尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。
分子生物学常用试剂配制表
LB 培养基PBS 缓冲液1x 10x 胰蛋白胨Tryptone 10g/L液体Na2HPO4（8mM/L ）1.14g/L11.36g/L酵母提取物Yeast extract 5g/L Nacl(136mM/L)7.95g/L 79.56g/L氯化钠Nacl10g/L KH2PO4(2mM/L)0.27g/L 2.72g/L 琼脂20g/L固体Kcl(2.6mM/L)0.2g/L 1.94g/L ddWater 至1L 至1LSDS-PAGE 电泳缓冲液5X NaOH 调节pH 至7.4-7.6Tris 15.1g 用前稀释TBS 缓冲液1X 10X甘氨酸94g Tris 2.42g/L 24.2g/L SDS 5g氯化钠Nacl 8g/L 80g/L ddWater 至1L ddWater 至1L 至1LHcl 调节pH 至7.4-7.6WB 湿转转膜液10X 加500ul Tween-20/L 得PBST/TBST Tris 30.3g/用前稀释甘氨酸144g/L细胞破碎缓冲液ddWater 至1L Kcl(300mM)22.37g/L WB 湿转转膜液使用KH2PO4(50mM) 6.81g/L 10X Trans Buffer 100mlEDTA(1mM)0.292g/L 甲醇200ml ddWater 至1L pH8.0ddWater 700ml 10%SDS 50℃加热可促溶解IPTG （1mM/L ）1ul+1ml 菌液SDS 10g IPTG 2.38g10XddWater 至100ml 灭菌ddWater 至10ml稀释10倍后10ul+1ml 菌液10%过硫酸铵APS3周内使用过硫酸铵APS0.2g Amp （50-100ug/ml ）10X1ul+1ml 菌液ddWater 2ml Amp 1g 灭菌ddWater至10ml1.5MTris-Hcl pH 8.8Hcl 调至8.8稀释10倍后10ul+1ml 菌液Tris 18.8g ddWater 至100ml考马斯亮蓝染色液过滤后可循环使用1M Tris-Hcl pH6.8Hcl 调至6.8甲醇500ml Tris 12.12g 乙酸100ml ddWater 至100ml R-250考马斯亮蓝0.5gddWater 至1L考马斯亮蓝脱色液乙醇比例越高脱色越快3705ZZL甲醇/乙醇100-500ml 乙酸50ml ddWater 至1LTAE 50X ELISA 包被液Tris 242g 先溶解再加乙酸后定容Na2CO3 1.59g pH9.6Na2EDTA·2H2O 37.2g NaHCO3 2.93g ddWater 800ml灭菌ddWater 至1L 乙酸57.1ml ddWater 至1L 生理盐水0.9%氯化钠Nacl 9g 灭菌使用SDS 分离胶浓度分离范围ddWater 1L6%50-150kd 8%30-90kd 鲜血培养基10%20-80kd 培养基100ml 约37℃加血12%12-60kd 鲜血5ml 15%10-40kd巧克力培养基同样5%鲜血于≥90℃时加入琼脂糖凝胶琼脂糖1XTAE 1%核酸染料透析袋处理0.2g 20ml 6/8/11孔1ul 2%(W/V)碳酸氢钠+1mmol/L ED TA(pH 8.0)煮沸10min 0.3g 30ml 13孔 1.5ul 0.4g 40ml 18/25孔2ul 0.3g 20ml 1.5%1ul ddWater 清洗0.4g20ml2%1ul1mmol/LEDTA(pH 8.0)煮沸10min包涵体溶解液包涵体洗涤液磷酸钠（20mm ） 3.27g Hcl 调至pH 7.4EDTA （0.5mM ）0.146g Hcl 调至pH8.0氯化钠(300mM)17.53g Nacl （100mM ） 5.844g 咪唑（10mM ）0.68g Tris （50mM ） 6.06g 尿素（8M ）484.8g TritonX-100（1%）10mlddWater 至1L ddWater 至1L 加入后超声10min ，离心20min 0.1M 氯化钙CaCl2感受态用蛋白复性缓冲液CaCl2 1.1g 照紫外灭菌Nacl （100mM ） 5.85g Hcl调至pH8.灭菌ddWater 10mlTris （50mM ） 6.06g甘油（5-10%）50ml枸橼酸钠抗凝剂109mM/LGSH （2mM)0.6gNa3C6H5O7·2H2O 32.05g 灭菌后用，以实际分子量计算用量GSSG(0.2mM)0.1gddWater 至1L 尿素(6/4/2/0M)计算1：9血使用ddWater 至1L尿素6-4-2-0梯度分别1LELISA 终止液（2mM/L ）H2SO43705ZZL浓硫酸（98%）21.7ml酸入水中！ddWater 178.3ml。
RT-PCR实验过程及需要试剂耗材
RT-PCR实验过程及需要试剂耗材RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
试验前注意：1. 做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug2. RT按要求做，一般不会出太大问题。
3. PCR如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
试验过程：实验器具：1、 移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl2、 吸头：1ml、200μl、20μl3、 匀浆管：5ml4、 吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个5、 EP管：1.5ml、0.2ml、100μl6、 试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇7、 量筒：50ml、250ml、500ml8、 容量瓶：250ml、500ml、1000ml9、 试管架：5ml、1.5ml、20μl10、 盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水11、 铝制饭盒：4个12、 塑料小饭盒：1个13、 大瓷缸：2个14、 锡泊纸：一卷15、 卷纸：2卷16、 三角烧瓶：带盖，稍大实验器具的处理与准备：1、 塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP 管）。
2、 玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）。
3、 匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC试验试剂：1、 DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
2、 75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压）。
金唯智客户引物合成订购附表
2.因此订单是电脑自动处理 接收2小时后将不能再更改
3.引物收单Email：oligo.
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引物合成订购表
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苏州金唯智
引物合成部：051
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Primer 名称
序列(5'to3')
碱基数分装管
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提拱量(O.D)纯化方式
单价修饰
Oligo(dT)15
TTTTTTTTTTTTTTT
1555HAP
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80797311月结
周双海
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