单个核细胞分离
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的采集、分离和保存是在医学研究和临床诊断中非常重要的步骤。
PBMCs是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，能够在机体的免疫应答中发挥重要作用。
为了保证试验结果的准确性和可靠性，对PBMCs的采集、分离和保存必须按照相应的标准进行操作。
一、采集1. 选择合适的采集方法：一般常用的采集方法包括静脉抽血和手指取血等，静脉抽血常用于采集较多血液量的情况，手指取血则适用于采集少量血液的情况。
2. 确保采集操作标准化：在采集PBMCs的过程中，应该遵守严格的消毒和无菌操作规程，以防止细菌和病毒的污染。
3. 采集完整的血液样本：为了确保PBMCs的纯度和稳定性，应该尽量避免气泡和血细胞破损导致的RNA降解等情况。
二、分离1. 使用适当的分离方法：一般常用的PBMCs分离方法包括密度梯度离心和磁珠分选等，密度梯度离心适用于分离较大量的PBMCs，磁珠分选则适用于分离特定类型的细胞。
2. 选择合适的分离液：密度梯度离心中一般使用的分离液包括Ficoll和Percoll等，磁珠分选中则需要选择特定的磁珠标记物。
3. 保证分离效率和纯度：在PBMCs的分离过程中，应该确保细胞的分离效率和纯度，避免细胞的损失和杂质的混入。
三、保存1. 选择合适的保存条件：PBMCs的保存条件包括温度、储存液和容器等要素，应该选择适合PBMCs存活的条件进行保存。
2. 快速冻存PBMCs：为了避免细胞的降解和失活，应该在采集和分离PBMCs后尽快将其冻存。
3. 定期监测保存效果：在存储PBMCs的过程中，应该定期监测PBMCs的存活率和纯度，以确保PBMCs的质量和稳定性。
对于人外周血单个核细胞的采集、分离和保存，在操作的过程中应该严格按照相应的标准进行，以确保PBMCs的质量和稳定性，为后续的研究和临床应用提供可靠的基础。
单个核细胞的分离
单个核细胞的分离：（密度离心法）（一）外周血中的单个核细胞的分离：1. 眼眶静脉丛采血：（无菌条件下操作）采血者的左手拇食两指从背部较紧地握住小鼠或大鼠的颈部(大鼠采血需带上纱手套)，应防止动物窒息。
当取血时左手拇指及食指轻轻压迫动物的颈部两侧，使眶后静脉丛充血。
右手持续接7号针头的1ml注射器或长颈(3～4cm)硬质玻璃滴管(毛细管内径0.5-1.0mm)，使采血器与鼠面成45℃的夹角，由眼内角刺入，针头斜面先向眼球，刺入后再转180度使斜面对着眼眶后界。
刺入浓度，小鼠约2～3mm。
当感到有阻力时即停止推进，同时，将针退出约0.1-0.5mm，边退边抽。
若穿刺适当血液能自然流入毛细管中，当得到所需的血量后，即除去加于颈部的压力，同时，将采血器拔出，以防止术后穿刺孔出血。
若技术熟练，用本法短期内可重复采血均无多大困难。
左右两眼轮换更好。
体重20-25g的小鼠每次可采血 0.2-0.3ml。
摘除眼球取血：左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。
用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。
采血完毕立即用纱布压迫止血。
每次采血量0.6-1mL。
2. 分离PBMC操作步骤：1）用抗凝管（内含抗凝液0.2ml）收集血液，摇匀，加入的Hank’s液或PBS等体积（1:1）稀释血液。
或用肝素溶液：生理盐水将肝素配成125-250U/mL的无菌液，4度保存。
每1mL全血加0.1mL 肝素溶液。
2）取淋巴细胞分层液2ml，放入15ml的离心管。
3）将离心管倾斜45°角，用吸管吸取稀释血液，在离分层液面上1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液量叠于分层液上，保持两者界面清晰。
（稀释血液与分层液体积比例约为2:1）。
（或：将吸管嘴插入离心管底部，将分层液缓慢加入稀释血液的底部。
）4）18-20度，水平离心机以2000r/min离心20min，离心后其中的内容物分为四层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分层液，底层为红细胞和粒细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层（薄）。
外周血单个核细胞分离实验报告
外周血单个核细胞分离实验报告引言外周血单个核细胞是指在外周血中富含的一类细胞，其细胞核不与胞质分离，与常见的多核细胞不同。
研究外周血单个核细胞的分离方法对于深入了解这一类特殊细胞的结构和功能具有重要意义。
本实验旨在探究一种高效、可靠的外周血单个核细胞分离方法。
材料与方法实验材料•鲜活外周血样本•离心管•PBS缓冲液•Ficoll介质实验步骤1.将外周血样本收集于离心管中。
2.加入相应体积的PBS缓冲液至离心管中，使样本与缓冲液的比例为1:1。
3.用低速离心的方法，离心管在1000g条件下离心10分钟，以分离外周血细胞。
4.将上清液转移至新的离心管中，避免携带红细胞。
5.加入相应体积的PBS缓冲液至离心管中，重新悬浮外周血细胞。
6.向离心管中加入Ficoll介质，使样本与介质的比例为1:2。
7.用高速离心的方法，离心管在2500g条件下离心15分钟，以分离外周血单个核细胞。
8.转移到新的离心管中，获取纯化的外周血单个核细胞。
结果与讨论实验结果通过以上实验步骤，我们成功地分离出了纯化的外周血单个核细胞。
经过染色处理后，我们观察到这些细胞的细胞核形态正常，大小均一，未出现明显的核碎片。
这表明我们采用的分离方法在维持细胞完整性的同时有效地分离了外周血单个核细胞。
结果分析外周血单个核细胞的分离方法是一个关键的环节，本实验中采用的离心和Ficoll介质的组合分离方法是一种经典的操作流程。
离心的低速步骤旨在分离外周血中的核细胞和血小板，而高速离心则能够有效分离核细胞和红细胞等细胞成分。
Ficoll 介质则起到了调节比重、减缓细胞沉降速度的作用，从而实现了外周血单个核细胞的高效分离。
通过优化分离方法，我们能够获得更纯的外周血单个核细胞样本，为后续的实验研究提供可靠的基础。
同时，我们也可以通过进一步的实验，探究这些细胞的特性和功能，为相关疾病的研究提供重要的支持。
结论本实验采用离心和Ficoll介质的组合分离方法，成功地分离出了纯化的外周血单个核细胞。
外周血单个核细胞的分离
实验二十四外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。
外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。
此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。
【实验原理】血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。
市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。
将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。
【主要试剂和器材】1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。
2.5g/L台盼蓝。
3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。
4.Hank,s液。
5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。
6.水平离心机、显微镜。
【操作方法】1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。
再加入等量Hank,s液混匀。
2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。
稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。
3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。
4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。
单细胞测序的细胞核的分离和纯化方法
单细胞测序的细胞核的分离和纯化方法
单细胞测序的细胞核的分离和纯化方法包括以下步骤：
1. 酶解：使用胶原酶和胰蛋白酶等酶将组织样本消化，将细胞间的连接分解，使细胞分散成单个细胞。
2. 离心：通过离心将单个细胞收集到管底部，形成细胞沉淀。
3. 洗涤：去除细胞沉淀中的组织残留物和杂质。
4. 重悬浮：将单个细胞重新悬浮在适量的缓冲液中，以便后续处理。
5. 过滤：通过过滤膜或滤器将细胞核与其他细胞成分分离，收集细胞核。
6. 纯化：利用不同细胞核的特征差异，使用离心、磁珠、荧光染色等方法将细胞核进行分离和纯化。
7. 计数：对纯化后的细胞核进行计数，确保数量足够进行后续的单细胞测序。
需要注意的是，具体的分离和纯化方法会根据不同的组织和细胞类型而有所差异，可以查阅相关的实验指南或与专业的实验室研究人员咨询了解更多详细的信息。
单个核细胞分离试验
1.单个核细胞分离
1.采集静脉血用EDTA-K2抗凝管无菌采集静脉血2ml，立即轻轻摇匀，使血液抗凝。
2.稀释抗凝血用无菌吸管加入2ml等体积的Hanks液或磷酸缓冲盐溶液PBS 充分，使血液等倍稀释，降低红细胞的凝集，提高分离效果。
（此步骤可省去）
3.分离PBMC
（1）取淋巴细胞分离液3ml于灭菌离心管中，然后将离心管倾斜45度，将稀释的血液缓慢叠加于淋巴细胞分离液上，注意勿使血液混入淋巴细胞分离液中。
（2）平衡后，于离心机中室温2000r/min离心20分钟。
离心后，最上层为血浆层，第二层即为单个核细胞层。
（3）用毛细吸管吸取最上层的血浆、血小板后弃去。
再用另一毛细血管吸取单个核细胞于新的无菌离心管中。
4.洗涤PBMC预估转移的单个核细胞的体积，加入3~5倍体积的磷酸缓冲盐溶液PBS，用吸管轻柔重悬细胞，离心，1500r/min离心10分钟，可去掉大部分混杂的血小板。
之后去掉上清，继续加入3~5倍的平衡盐溶液，用吸管轻柔重悬细胞，离心，1500r/min 离心10分钟，去上清后备用。
单个核细胞分离
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Ficoll密度梯度离心法
常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077左右的 聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin）分 层液。
红细胞、粒细胞比重大(1.092)，离心后沉于管底；淋巴 细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重(1.070)， 离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细胞， 就可从外周血中分离到单个核细胞。
密度梯度离心法分离原理
PBMC的比重——1.075
Ficoll淋巴细胞分层液
比重——1.077
红细胞 多核白细胞
平均比重——1.092
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离心前示意图
稀释的抗凝血 Ficoll分离液
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离心后示意图
血浆
PBMC（白膜状）1.075 Ficoll分离液 1.077 红细胞、多核白细胞 1.092
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E花环分离法
人成熟T细胞表面的CD2分子是绵羊红细胞受体（E受 体），能结合绵羊红细胞形成E花环，经淋巴细胞分离液 分离后，因E花环形成细胞比重大而沉降于管底，再以低 渗法裂解T细胞周围的绵羊红细胞，即获得了纯化的T细 胞。
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（三）小鼠腹腔巨噬细胞的分离
原理及方法：利用巨噬细胞可黏附在玻璃或 塑料上的原理，吸取小鼠腹腔液体，离心洗 涤，用培养液悬浮，冲洗三次，去除非黏附 细胞，用橡皮棒轻轻刮取、解离贴壁细胞， 即为巨噬细胞。
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（二）T、B 淋巴细胞的分离
1、单核细胞的去除：
（1）黏附去除法 * 原理：单核细胞可黏附在塑料或玻璃表面而淋巴细胞不能。 （2）L—亮氨酸甲酯去除法 （3）羰基铁吞噬离心法
外周血单个核细胞的分离方法
外周血单个核细胞的分离方法1. 引言大家好，今天咱们聊聊一个有点“高大上”的话题——外周血单个核细胞的分离方法。
别担心，听起来复杂，但其实就像是把水果分开一样，方法有点多，但都不是很难。
首先，单个核细胞是什么呢？简单来说，它们是血液里的小战士，负责咱们身体的免疫系统工作。
而把这些小战士从血液中分离出来，是为了让我们能更好地研究它们，或者用于治疗各种病症。
现在，让我们一起来看看，这个过程到底怎么做吧！2. 准备工作2.1 收集血液样本首先，得从患者或志愿者那里收集血液。
想象一下，这就像是收集原材料一样。
我们一般用专门的血液收集管，这些管子里有点抗凝剂，防止血液在管子里凝固。
这个步骤就像是给血液穿上“防寒衣”，确保它们不会在实验室里冻住。
血液收集后，我们需要立即将其送到实验室，因为血液可不像冰淇淋那样能在冰箱里存放很久。
2.2 准备离心机接下来，我们用离心机来分离这些细胞。
离心机是一种可以快速旋转的机器，通过离心力把血液中的不同成分分开。
这个过程就像是在一个大旋转舞台上，血液里的各种“演员”根据他们的“舞姿”被分到不同的区域。
大家可以把离心机想象成一个超级有力的“旋转木马”，它能把血液中的细胞按类型分类开来。
3. 分离过程3.1 使用密度梯度离心法密度梯度离心法是我们分离单个核细胞的绝招之一。
我们在试管里加入一个特殊的液体，这个液体的密度不同层次逐渐增加，形成一个梯度。
然后把血液样本倒进去，接着用离心机旋转。
这就像是给试管里制造了一条“滑梯”，细胞们就沿着这个“滑梯”滑到它们各自的位置。
单个核细胞会在某一层次上停下来，其他细胞则会分布在不同的层次上。
3.2 清洗与收集当我们分离好细胞后，下一步就是清洗和收集。
用生理盐水或者其他洗涤液把细胞洗干净，去掉多余的杂质。
这个过程就像是给细胞洗个澡，确保它们干干净净，然后我们把这些清洗好的细胞取出来。
然后就可以把这些细胞用于各种研究或治疗了。
4. 结束语好了，今天的分享就到这里。
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（三）小鼠腹腔巨噬细胞的分离
原理及方法：利用巨噬细胞可黏附在玻璃或 塑料上的原理，吸取小鼠腹腔液体，离心洗 涤，用培养液悬浮，冲洗三次，去除非黏附 细胞，用橡皮棒轻轻刮取、解离贴壁细胞， 即为巨噬细胞。
免疫细胞的功能检测
——功能检测的原理及方法
免疫细胞功能检测的意义
免疫系统或其他系统的疾病，免疫接 种，某些临床措施或外界环境的影响，均 可使免疫细胞的数量和功能发生变化。 因此，免疫细胞数量，功能检测，对 于疾病的诊断、发病机制研究、免疫治疗、 预防接种的效果评估及环境因素对机体免 疫功能影响的判定，都具有重要意义。
根据实验目的不同，采用不同方法，主要需考
虑(1)细胞纯度；(2)细胞获得量；(3)细胞活力；
Ficoll密度梯度离心法
常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077左右的 聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin）分 层液。
红细胞、粒细胞比重大(1.092)，离心后沉于管底；淋巴
2007级五年制本科生
免疫学实验课
杨 巍
第四次实验课
人外周血单个核细胞分离
实验内容
人外周血单个核细胞的分离（实验） 淋巴细胞分离与检测技术（讲解）
实验目的
掌握单个核细胞分离及淋转的原理及方法
熟悉淋巴细胞的检测技术
细胞分离纯化的目的
测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或
组织中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细 胞、粒细胞等。
1ml刻度吸管 1支/4人 加样器(tip) 1把/4人 显微镜 1台/2人
实验步骤
1. 加样：吸取1ml稀释的血液沿试管壁缓慢加至分层液顶部(距1cm处)
NOTE：不要打破血液与分层液的界面；
2. 分离：2,000r/min离心17min，离心后管内液体可分为四层; 3. 回收：将吸管直接插入灰白层，沿管壁轻轻吸出灰白层单个核细胞， 放入EP管中(NOTE：尽量少吸分层液);加入PBS至1ml，洗涤1次， 4,000rpm/min，离心5分钟，弃上清； 4. 计数：用500ul PBS重悬细胞，取10ul加到计数板内，计数。
淋巴细胞分离及检测技术
巨噬细胞
淋巴细胞
DC细胞
免疫细胞的分离
——免疫细胞的分离原理及方法
免疫细胞：直接参与免疫应答及与免疫应答相关 的所有细胞的总称。
— Mononuclear phagocyte system
Monocyte Macrophage Dendritic Cells
—
Granulocytes
原理:绵羊红细胞→T细胞→形如花环，比重变大，离心 沉淀
B细胞膜免疫球蛋白检测
原理：荧光素→抗Ig特异性抗体→B细胞表面膜 免疫球蛋白(mIg)
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二. 免疫细胞的功能检测
淋巴细胞转化实验是淋巴细胞功能检测最基本方法。
非特异性:有丝分裂原 PHA、ConA…
微生物及其代谢产物
刺激物 蛋白物质 抗体 淋巴因子 特异性：特异性抗原物质
葡萄球菌…
胃蛋白酶… 抗CD3、CD4抗体…
淋巴细胞转化试验的检测方法
(一)形态学方法
淋巴细胞→淋巴母细胞→染色镜检
(二) 3H﹣TdR掺入法
有丝裂原或抗原→淋巴细胞→染色体复制 →3H﹣TdR掺入 →淋巴细胞摄取→测定放射量
(三) MTT比色法
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淋巴细胞亚群检测的方法
（T细胞和B细胞检测方法相同,现以T细胞为例进行讲解.）
Neutrophils Basophils Eosinophils T lymphocyte B lymphocyte NK (Natural killer cells)
—
Lymphocytes
直接参与免疫应答的细胞主要为：T细胞、B细胞、巨噬细胞
免疫细胞的分离
一. 外周血单个核细胞（PMBC）分离
细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重(1.070)， 离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细胞， 就可从外周血中分离到单个核细胞。
Ficoll密度梯度离心法
比重：1.070
比重：1.077
Ficoll
比重：1.092
实验材料
分组：两人一组 器材 滴管 EP管 计数板 数量 2支/2人 1个/2人 1块/2人 试剂 分层液 血液 PBS 计数液 数量 0.5ml /2人 1ml /2人 1瓶/4人 1管/4人
（一）外周血单个核细胞（PBMC）的分离
• 单个核 —— PBMC 血中的细胞
• 无核 —— 红细胞 • 多核 —— 多核白细胞来自密度梯度离心法分离原理
PBMC的比重——1.075
Ficoll淋巴细胞分层液 比重——1.077
红细胞 多核白细胞
平均比重——1.092
离心前示意图
稀释的抗凝血
Ficoll分离液
APAAP法: APAAP复合物
兔抗鼠IgG
T细胞 McAb
(三)荧光激活细胞分类仪(FACS)检测T细 胞亚群
FACS是应用流式细胞技术的先进的自动分析仪器,其操作程 序在无菌条件下进行,不影响细胞活性,所以分离、收集的细胞可 继续其他细胞功能的研究。
离心后示意图
血浆
PBMC（白膜状）1.075 Ficoll分离液 1.077 红细胞、多核白细胞 1.092
（二）T、B 淋巴细胞的分离
1、单核细胞的去除：
（1）黏附去除法 * 原理：单核细胞可黏附在塑料或玻璃表面而淋巴细胞不能。 （2）L—亮氨酸甲酯去除法 （3）羰基铁吞噬离心法
2、T、B淋巴细胞的分离纯化
免疫细胞检测的分类
一、免疫细胞的数量检测
二、免疫细胞的功能检测
免疫细胞自发增殖活性测定
免疫细胞增殖检测
淋巴细胞增殖检测
一. 免疫细胞的数量检测
检查的项目有：血中T细胞与B细胞的分类计数
血液白细胞的计数 血液中白细胞的分类计数
实验方法
｛
E玫瑰花环实验(检测T细胞)
B细胞膜免疫球蛋白检测
E玫瑰花环实验
二. 淋巴细胞亚群的分离及鉴定（表面标志选择性 纯化淋巴细胞亚群）
E花环分离法 尼龙纤维分离法 免疫荧光法 流式细胞术(flow cytometry, FCM) 磁珠分离术
免疫细胞分离的依据
1. 2. 3. 4. 细胞膜脆性：低渗液分离 细胞密度：密度梯度离心法 细胞表面标志：流式细胞术，磁珠分离术 细胞黏附性：黏附玻璃，塑料，尼龙毛
（NOTE：如细胞数较多，用白细胞计数液做适当稀释，再计数）
5. 调细胞浓度：细胞终浓度为：1×106/ml 。
（NOTE：一般每ml健康成人血可分离1~2×106个单个核细胞，其中90%以 上为淋巴细胞，部分是单核细胞）
示意图
细胞计数方法
4
查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y ×104×稀释倍数(50)
（1）尼龙毛柱法 ** 原理：B细胞易黏附在尼龙纤维上，洗脱的为非黏 附性的T细胞。 （2）E花环分离法 * 原理：人成熟T细胞表面的CD2分子为绵羊红细胞受 体（E受体），可结合绵羊红细胞形成E花环，比重 增大，沉于管底。 （3）其它：免疫荧光法、流式细胞术、磁珠分离法
E花环分离法
人成熟T细胞表面的CD2分子是绵羊红细胞受体（E受 体），能结合绵羊红细胞形成E花环，经淋巴细胞分离液 分离后，因E花环形成细胞比重大而沉降于管底，再以低 渗法裂解T细胞周围的绵羊红细胞，即获得了纯化的T细胞。
(一)免疫荧光法
(二)免疫酶标法
(三)荧光激活细胞分类仪检测T细胞亚群
(一)免疫荧光法
直接法:荧光素→单克窿抗体→淋巴细胞
间接法:荧光素→第二抗体(羊或兔的抗鼠IgG) →McAb介导→淋巴细胞
(二)免疫酶标法
ABC法:亲和素＋酶标生物素→复合物→生物素化的二抗→McAb介 导和酶催化底物作用→T细胞着色