腺病毒质量检定方法
一、无菌检查 (2)
（一）薄膜过滤法 (3)
（二）直接接种法 (3)
二、支原体检查 (4)
第一法细胞培养法 (4)
第二法指示细胞培养法（DNA染色法） (5)
三、细胞内、外源病毒因子检查 (7)
1 细胞形态观察及红细胞吸附试验（简称血吸附试验） (7)
2 不同细胞传代培养法检测病毒因子 (7)
3 接种动物和鸡胚法检测病毒因子 (8)
4 逆转录病毒及其他内源性病毒或病毒核酸的检测 (8)
1）逆转录酶活性测定 (8)
2）透射电镜检查 (11)
3）感染性试验 (11)
5 特殊外源病毒因子的检测 (11)
四、致瘤性检查 (11)
五、感染效率和病毒的产量等的测定 (12)
六、细胞鉴别（染色体检查） (12)
七、病毒敏感性检查 (13)
八、细胞功能检查 (13)
九、重组腺病毒滴度的测定 (14)
十、病毒比滴度（比活性IU）测定 (16)
十一、E1A区、E2B区、AA V及插入基因的检测 (16)
一）E1A区的检测 (16)
二）E2B区的检测 (17)
三）AA V的检测 (18)
四）插入基因的检测 (18)
十二、病毒外源因子检查 (19)
十三、内毒素测定 (19)
供试品溶液的制备 (19)
确定最大有效稀释倍数（MVD） (20)
方法1 凝胶法 (20)
鲎试剂灵敏度复核试验 (21)
干扰试验 (21)
检查法 (23)
十四效力试验插入基因表达活性测定，插入基因的生物学活性测定 (24)
十五复制型病毒（RCA）检测A549细胞检测法 (24)
十六腺相关病毒的检测采用PCR法 (26)
十七残留量测定应根据生产工艺及成品的添加成份，对有潜在危险性的成份进行残留量检测： (27)
1残余宿主DNA含量测定 (27)
2残余牛血清白蛋白含量测定 (27)
3残余核酸酶含量测定 (28)
十八重组病毒制品的稳定性试验 (28)
一、无菌检查
《药典》（2010版第三部）附录ⅫA无菌检查法
①试验材料
1、细胞培养上清液
2、硫乙醇酸盐流体培养基
酪胨（胰酶水解）15.0g 酵母浸出粉 5.0g 葡萄糖 5.0g
氯化钠 2.5g L-胱氨酸0.5g 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0ml
硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸）0.5g (0.3ml）
琼脂0.75g 水1000ml
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调pH值使灭菌后为7.1±0.2。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2，灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟）后，迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。
3、改良马丁培养基
胨 5.0g 磷酸氢二钾 1.0g 酵母浸出粉 2.0g 硫酸镁0.5g 葡萄糖20.0g 水1000ml 除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值约为6.8，煮沸；加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。
4、营养琼脂培养基
琼脂14.0g 胨10.0g 氯化钠 5.0g 牛肉浸出粉 3.0g 水1000ml
取上述成分混合，微温溶解，调pH值为弱碱性，煮沸，滤清，调pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。
5、改良马丁琼脂培养基
按改良马丁培养基的处方和制法，加入14.0g琼脂，调pH值使灭菌后为6.4
±0.2，分装，灭菌。
6、封闭式薄膜过滤器，滤膜孔径应不大于0.45um，直径约为50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。
②试验步骤
（一）薄膜过滤法：
1、将少量的冲洗液过滤，以润湿滤膜。
2、取规定量，每支（瓶）供试品装量为5ml或以下者，全部转移至含适宜稀释液100ml的无菌容器内，混匀，立即过滤；每支（瓶）供试品装量为5ml以上者直接过滤。或全部转移至含适宜稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于3次，冲洗量100ml、总冲洗量不超过1000ml。冲洗后，2个滤器中加入硫乙醇酸盐流体培养基各100ml，另一滤器中加入改良马丁培养基100ml。
3、细菌置30-35℃、真菌置20-25℃培养14天，培养期间逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无菌生长，可取该培养基适量转接种同种新鲜培养基中及营养琼脂斜面和改良马丁琼脂斜面培养基上，细菌培养2天，真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基中及营养琼脂和改良马丁琼脂斜面培养基上是否有菌生长；或取培养液（物）涂片，染色，镜检，判断是否有菌，必要时做菌种鉴定。（二）直接接种法：
1、取规定量供试品，等量分别接种至硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中（2种培养基的接种支数或瓶数之比为2:1）。除有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积，不得大于培养基体积的10%，同时硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，改良马丁培养基每管装量不少于10ml。
2、将上述接种后的硫乙醇酸盐流体培养基平均分成两份，一份置30-35℃培养14天；另一份与接种后的改良马丁培养基置20-25℃培养14天，培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无菌生长，可取该培养液适量接种至同种新鲜培养基中及营养琼脂斜面和改良马丁琼脂斜面培养基上，细菌培养2天，真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基及营养琼脂和改良马丁琼脂斜面
培养基上是否有菌生长；或取培养液（物）涂片，染色，镜检，判断是否有菌，必要时做菌种鉴定。
③结果判定
阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。
若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判断供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判断供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少1个条件时方可判试验无效：
1、无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。
2、回顾无菌检查过程，发现有可能引起微生物污染的因素。
3、供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。
试验若经确认无效，应重试。重试前，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判断供试品不符合规定。
二、支原体检查
《药典》（2010版第三部）附录ⅫB支原体检查法
第一法细胞培养法
①试验材料
1、支原体肉汤培养基
猪胃消化液500ml 氯化钠 2.5g 牛肉浸液（1:2）500ml
葡萄糖 5.0g 酵母浸粉 5.0g 酚红0.02g
pH值为7.6±0.2，于121℃灭菌15分钟。
2、精氨酸支原体肉汤培养基
猪胃消化液500ml 氯化钠 2.5g 牛肉浸液（1:2）500ml
L-精氨酸 2.0g 葡萄糖 1.0g 酵母浸粉 5.0g 酚红0.02g
pH值为7.1±0.2，于121℃灭菌15分钟。
3、支原体半流体培养基
按1项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂2.5-3.0g。
4、支原体琼脂培养基
按1项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂13.0-15.0g。
②试验步骤
1、供试品如在分装后24小时以内进行支原体检查可贮存于2-8℃；超过24小时应置于-20℃一下贮存。
2、检查支原体采用支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基（或支原体琼脂培养基）。支原体半流体培养基（琼脂培养基）在使用前应煮沸10-15分钟，冷却至56℃左右，然后加入灭能新生牛血清（培养基与血清体积比8:2），并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补上述成分。
取每支装量为10ml的支原体半流体培养基（已冷却至36℃±1℃）和支原体肉汤培养基各4支，每支培养基接种供试品0.5-1.0ml，置36℃±1℃培养21天。于接种后的第7天从4支中取2支进行次代培养，每1支培养基转种支原体半流体培养基及支原体肉汤培养基各2支，置36℃±1℃培养21天，每隔3天观察1次。
③结果判定
培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为合格；如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判为合格，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。
第二法指示细胞培养法（DNA染色法）
①试验材料
1、试剂：（1）二苯甲酰胺荧光染料浓缩液称取二苯甲酰胺荧光染料5mg，加入100ml不含酚红和碳酸氢钠的Hank’s平衡盐溶液中，室温下用磁力搅拌器搅拌30-40分钟，使完全溶解，-20℃避光保存。
（2）二苯甲酰胺荧光染料工作液无酚红和碳酸氢钠的Hank’s溶液100ml中加
入二苯甲酰胺荧光染料浓缩液1ml，混匀。
（3）固定液醋酸：甲醇（体积比1:3）混合溶液。
（4）封片液量取0.1mol/L枸橼酸溶液22.2ml、0.2mol/L磷酸氢二钠溶液27.8ml、甘油50.0ml，混匀，调pH值至5.5。
2、培养基及指示细胞：（1）DMEM完全培养基。
（2）DMEM无抗生素培养基。
（3）指示细胞（已证明无支原体污染的Vero细胞或其他传代细胞）取培养的Vero细胞经消化后，制成每1ml含105的细胞悬液，以每孔0.5ml接种6孔细胞培养板或其他容器，每孔再加无抗生素培养基3ml，于36℃±1℃、5%二氧化碳条件下培养过夜，备用。
供试品处理：（1）细胞培养物将供试品经无抗生素培养液至少传1代，然后取细胞已长满的且3天未换液的细胞培养上清液待检。
（2）毒种悬液如该毒种对指示细胞可形成病变并影响结果判定时，应用对支原体无抑制作用的特异抗血清中和病毒后或用不产生细胞病变的另一种指示细胞进行检查。
（3）其他供试品检查时所选用的指示细胞应为该供试品对其生长无影响的细胞。
②试验步骤
1、备好的指示细胞培养板中加入供试品（细胞培养上清液）2ml（毒种或其他供试品至少1ml），于36℃±1℃、5%二氧化碳条件下培养3-5天。指示细胞培养物至少传代1次，末次传代培养用含盖玻片的6孔培养板培养3-5天后，吸出培养孔中的培养液，加入固定液5ml，放置5分钟，吸出固定液，再加5ml固定液固定10分钟，吸出固定液，使盖玻片在空气中干燥，加二苯甲酰胺荧光染料（或其他DNA染料）工作液5ml，加盖，室温放置30分钟，吸出染液，每孔用水5ml，冲洗3次，吸出水，盖玻片于空气中干燥，取洁净载玻片加封片液1滴，分别将盖玻片面朝下盖在封片液上制成封片。用荧光显微镜观察。
2、用无抗生素培养基2ml替代供试品，同法操作，作为阴性对照。
3、用已知阳性的供试品标准菌株2ml替代供试品，同法操作，作为阳对照。
③结果判定
（1）阴性对照仅见指示细胞的细胞核呈现黄绿色荧光。
（2）阳性对照荧光显微镜下除细胞外，可见大小不等、不规则的荧光着色颗粒。
当阴性及阳性对照结果均成立时，试验有效。
如供试品为阴性，则供试品判为合格；如供试品为阳性或可疑时，应进行重试；如供试品仍为阳性时，供试品判为不合格。
三、细胞内、外源病毒因子检查：应根据细胞的种属来源、组织来源及细胞特性决定
1 细胞形态观察及红细胞吸附试验（简称血吸附试验）
取混合瓶细胞样品，接种至少6个细胞培养瓶或培养皿，待细胞长成单层后换维持液，持续培养2周。如有必要，可适当换液逐日镜检细胞，细胞应保持正常形态特征。
如为贴壁细胞或半贴壁细胞，细胞至少培养14天后，分别取1/3细胞培养瓶或培养皿，用0.2%-0.5%豚鼠红细胞和鸡红细胞混合悬液进行血吸附试验。加入红细胞后置2-8℃作用30分钟，然后置20-25℃作用30分钟，分别进行镜检，观察红细胞吸附情况，结果应为阴性。（新鲜红细胞在2-8℃保存不得超过7天，且溶液中不应含有钙和镁离子。）
2 不同细胞传代培养法检测病毒因子
将待检细胞分别接种下列三种单层细胞，包括猴源细胞、人二倍体细胞和同种属同组织类型来源但不同批的细胞。每种单层细胞接种至少含107个活细胞或含原细胞培养液的细胞裂解物，接种量应占维持液的1/4以上，每种细胞至少接种2瓶，取培养7天的细胞各一瓶，取上清液分别接种于同种细胞培养，盲传一代，与初次接种的另一瓶细胞继续培养7天，观察细胞病变并进行细胞形态观察及血吸附试验。每种接种的细胞不得出现细胞病变，血吸附试验均应为阴性。试验应设立病毒阴性对照，包括可观察细胞病变的病毒阴性对照及血吸附阳性对照。如细胞裂解物对单层细胞有干扰，则应排
除干扰因素。
若待检细胞已知可支持人巨细胞病毒（CMV）的生长，则应在接种人二倍体细胞后至少观察28天，应无细胞病变。同时，应进行血吸附病毒检测，应为阴性。
3 接种动物和鸡胚法检测病毒因子
MCB或WCB细胞以及增殖到或超过生产用限定代次的细胞，须采用动物体内接种法进行外源病毒因子检测，须采用动物体内接种法进行外源病毒因子检测。选用乳鼠、成鼠和鸡胚（两组不同日龄）共计4组，按表所列方法进行试验和观察。观察期间，如被接种动物出现异常或疾病应进行原因分析。观察到期时，应至少有80%以上接种动物或鸡胚健存，视为试验有效。接种动物未显示有外源病毒感染，则细胞判定为合格。
对于新建细胞系/株，还应接种豚鼠和家兔（表2）。豚鼠主要用于检查细胞内结核分枝杆菌，在注射前观察4周，结核菌素试验为阴性者方可用于试验。家兔主要用于检测猴来源细胞中是否存在B病毒污染，也可用兔肾细胞培养法代替。
4 逆转录病毒及其他内源性病毒或病毒核酸的检测
可采用下列方法对MCB细胞或WCB细胞以及增殖到或超过生产用限定代次的细胞进行逆转录病毒的检测。
1）逆转录酶活性测定：采用敏感的方法，如产物增强的逆转录酶活性测定法
①试验材料
1、试剂
（1）供试品稀释液（A液）每1L A液含三烃基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl，pH7.5）25mmol，四甲基乙二胺（EDTA）0.25mmol，TritonX-100 25ml，甘油500ml。（2）供试品保存液（B液）每1L A液含1mg亮抑蛋白酶肽、0.7mg抑胃肽及1mg抑蛋白酶肽。
（3）引物及探针序列
上游引物：
5`-Biotin-CGTGGTTGACACGCAGACCTCTTAC-3`
下游引物：
5`-TCAACACTGTACGGCACCCGCATTC-3`
探针：
5`-NH2ATTATCTGGCCTTTGAGAGTTACTCTTTG-3`
（4）模板雀麦草花叶病毒RNA（BMV RNA）
（5）反转录缓冲液每1L反转录缓冲液含Tris-HCl（pH8.3）50mmol，氯化钾40mmol，氯化镁6mmol，DTT10mmol，脱氧核糖核苷酸200umol,下游引物0.8×10-3mmol。
（6）扩增缓冲液每1L扩增缓冲液含Tris-HCl（pH8.8）25mmol，氯化钾40mmol，氯化镁2mmol，脱氧腺嘌呤核糖核苷酸200umol，脱氧胞嘧啶核糖核苷酸200umol，脱氧鸟嘌呤核糖核苷酸200umol及脱氧尿嘧啶核糖核苷酸200umol，上、下游引物各0.4×10-3mmol，核糖核酸酶A 0.8g，Taq DNA聚合酶6×104U，尿嘧啶N-糖基化酶（UNG）4×104U。
（7）封闭液含3%牛血清白蛋白或0.5%酪蛋白的包被液。
（8）变性缓冲液含5mmol/L EDTA的0.2mol/L氢氧化钠溶液。
（9）包被液0.05mmol/L磷酸氢二钠溶液-1mmol/L EDTA（pH8.5）。
2、供试品、阳性对照及灵敏度供试品的制备
（1）取供试品200ul，每分钟5000转离心5分钟，取上清液100ul，加入B液100ul和焦炭酸二乙醇（DEPC）处理的5% TritonX-100 2ul，混匀后，置冰浴15分钟后，置-70℃保存备用。
（2）阳性对照用SP2/0细胞培养上清液作阳性对照，同上处理后，按单次使用量分装，-70℃保存备用。
（3）灵敏度供试品取鼠源白血病病毒逆转录酶（MMLV）用A液进行系列稀释至10-8U/ul，充分混匀，按单次使用量分装，-70℃保存备用。
②试验步骤
1、反转录
将已处理的供试品及阳性对照用A液10稀释。
反转录反应管中加入反转录缓冲液20.8ul，500mg/L BMV-RNA 0.2ul，混匀后，标记，70℃放置10分钟，置冰浴。
在相应的反转录反应管中分别加入4ul一稀释的供试品、阳性对照及灵敏度供试品，以A液作阴性对照。反转录反应体系为25ul。37℃反应90分钟。2、PCR扩增
取反转录产物5ul加至PCR扩增缓冲液20ul中，PCR扩增反应体系为25ul。混匀后，按下列条件进行扩增：37℃30分钟，预变性94℃5分钟，94℃45秒，56℃45秒，72℃45秒，进行35个循环，72℃延伸5分钟。
3、杂交检测
用经包被液适当稀释的探针100ul包被DNA结合板，4℃过夜；次日，用封闭液200ul于37℃封闭60分钟，用洗涤液洗涤3次，备用；扩增结束后，每个反应管中加入变性缓冲液25ul，混匀；在封闭洗涤后的包被板上每孔加入供试品25ul，再加入杂交液100ul，混匀后，37℃反应60分钟，用洗涤液洗涤5次；每孔中加入链亲和素标记的辣根过氧化物酶100ul，37℃反应30分钟；同上洗涤5次；每孔加入显色液100ul，37℃显色10分钟；每孔加入终止液100ul终止反应。以630nm为参考波长，在波长492nm处测定吸光度。
③结果判定
Cutoff值为阴性对照的吸光度值加0.2。
阴性对照吸光度值应不高于0.2，如小于0.05按0.05计。
阳性对照应为阳性，且吸光度值应不低于1.5。
灵敏度供试品应为阳性，且吸光度值应不低于0.8。
供试品吸光度值大于Cutoff值者为阳性。
注意事项
（1）如供试品为培养细胞，则将细胞传代后，培养3-4天长成单层，取上清液检测，取供试品前不得换液。
（2）试验中所有试剂及吸头均需灭菌。与RNA操作有关的试剂及材料均需经过DEPC处理。
（3）加供试品区、扩增区及PCR产物检测区及其所用加样枪及服装应严格区分。（4）定期对各区进行消毒，PCR产物及其加供试品吸头应及时进行有效处理。
2）透射电镜检查：取至少1×107个活细胞进行透射电镜观察。
3）感染性试验：将待检细胞感染逆转录病毒敏感细胞，培养后检测。根据待检细胞的种属来源，须使用不同的敏感细胞进行感染性试验。
上述三种方法具有不同的检测特性，因此应采用不同的方法联合检测。若逆转录酶活性检测阳性，应进行透射电镜检查及感染性试验，以确证是否有感染性逆转录病毒颗粒存在。
5 特殊外源病毒因子的检测
应对MCB或WCB的细胞进行特殊病毒的检测。检测病毒的种类根据细胞系/株种属、组织来源等确定。
人源的细胞株、系，应检测如人鼻咽喉癌病毒、人巨细胞病毒、人逆转录病毒、人乙型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒。在某些情况下，也可能进行转化病毒的检测，如人乳头瘤病毒、腺病毒、及人单纯疱疹病毒，这些病毒的检测可采用适当的体外检测技术。
四、致瘤性检查：人上皮细胞系、人二倍体细胞株及所有用于活病毒产品生产的细胞系、株应进行致瘤性检查。
下面两种肿瘤性试验方法可任选其一：
（1）裸鼠至少10只，用适量无血清培养基制备浓度每1ml含5×107个细胞的待检细胞悬液，每只裸鼠皮下或肌内注射0.2ml；同时用Hela或Hep-2细胞设立阳性对照，阳性对照组至少10只，每只注射0.2ml含106个细胞；可用人二倍体细胞作为阴性对照，阴性对照组至少10只，每只注射0.2ml含107个细胞.
（2）新生小鼠（3-5日龄），8-10g小鼠10只，在出生后0天、2天、7天和14天，分别用0.1ml抗胸腺血清（ATS）或球蛋白处理，然后同上每只皮下接种107个细胞。并设立阳性对照组，对照组至少接种10只。
结果判定：
①定期观察并触摸注射部位有无结节形成，且形成的任何结节均应进行双
向测量并记录。
②阳性对照组应至少有9只进行性肿瘤生长时，试验视为有效。
③如试验组动物有进行性肿瘤生长的结节或可疑病灶，应继续观察至少1-2
周；若出现的结节在观察期内开始消退，则应在结节完全消退前，处死
动物并进行解剖，做病理及组织学检查。
④未发生结节的动物，半数应观察21天，剖检，另外半数应观察12周，
进行病理检查，剖检接种部位，观察各淋巴结合各器官有无结节形成，
如有怀疑，进行病理组织检查，不应有转移瘤形成。
除上述体内法外，也可采用软琼脂克隆形成试验或器官培养试验等体外法检测，特别适用于低代次时动物体内无致瘤性的传代细胞系。
五、感染效率和病毒的产量等的测定
[11]
重组腺病毒Ad-F、Ad-P和Ad-FP的HPLC纯度分析
pH 用Waters Biosuite Q 10μm AXC柱(1ml)，流动相A（50mMTris·Cl 1mMMgCL
2
，pH 8.0)）梯度洗脱，检测波长为260nm。
8.0)；B(50mMTris·Cl，1M NaCl，1mM MgCl
2
取本品溶液400μl，用A稀释至500μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算其纯度。
六、细胞鉴别（染色体检查）
1、染色体检查
新细胞建株过程中，每8-12世代应做一次染色体检查，一株细胞整个生命期内连续培养过程中，至少应有4次染色体检查结果。
每次染色体检查，应至少随机取1000个分裂中期细胞，进行染色体数目、
形态和结构检查，并做记录以备复查。其中至少选择50个分裂中期细胞进行显微照相，做出核型分析，并应粗数500个分裂中期细胞，检查多倍体的发生率。
每次染色体检查，应从同一世代的不同培养瓶中取细胞，混合后进行再培养，制备染色体标本片。染色体片应长期保存，以备复查。
可用G分带或Q分带技术检查50个中期细胞染色体带型，应用照相图片做出带型分析。
2、判定标准
对1000个和500个中期细胞标本异常率进行检查，合格的上限（可信限90%Poison法）
①亚二倍体如超过上限，可能因制片过程人为丢失染色体，应选同批号标本重
新计数。
②一个中期细胞内超过53条染色体，即为一个多倍体。
七、病毒敏感性检查
八、细胞功能检查
九、重组腺病毒滴度的测定
滴度代表具有感染能力的病毒颗粒数，它更为直观地反映能进入细胞表达目的蛋白的病毒颗粒，即有效剂量，是衡量腺病毒特性更为重要的指标。
我们选择SFDA和FDA推荐的TCID50法测定病毒滴度。这一方法的原理基于最高稀释度下293细胞中病变效应(CPE)的形成。该方法只需10天就可获得结果，而且人为因素对结果的影响较小，结果的重复性更高。
方法1、经典的TCID50测定方法
1.1 试验材料
所用试剂均需分析纯或与指定产品相当，DMEM低糖型干粉培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均购自GIBCO。
1.1.1 DMEM培养液
每1L DMEM培养基(低糖)添加1.8克碳酸氢钠，无菌过滤后4℃保存。1.1.2 DMEM 2%
DMEM培养液添加2%胎牛血清(FBS，v/v)，4℃保存。
1.1.3 0.25%胰蛋白酶-EDTA细胞消化液
每0.25克胰蛋白酶和0.02克EDTA·4Na溶解于100ml无钙镁离子的PBS 溶液中，无菌过滤后4℃保存。
1.2 试验步骤
以下各步骤应于无菌条件下进行。
1.2.1 试验准备
将试验所用溶液预温至37℃。
1.2.2 细胞制备
培养足够的293细胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA液消化，收集细胞，重悬于DMEM2%培养液，配成1×105个细胞/毫升的细胞悬液，共30ml。
96孔板中每孔加入100 l细胞悬液，共3块96孔板，置37℃，5%CO2孵箱中培养2小时。
1.2.3 样品制备
以DMEM2%为样品稀释液稀释样品，以10倍稀释度做梯度稀释，稀释至10-13。分别做3份稀释。
具体操作如下：取13支2.5ml 的离心管，分别加入1.8ml DMEM2%，取200μl 待测样品加入10-1稀释度的离心管，反复吹打5次，混匀。
更换枪头，取200μl 10-1稀释度的样品加入10-2稀释度的离心管，反复吹打5次，混匀。
重复以上操作，直至样品稀释至10-13。
1.2.4 测定过程
按稀释度从高到低(从10-13至10-6)依次在每行中分别加入同一稀释度的100μl 样品，每个稀释度的样品各做10个复孔(即加在96孔板的每一行1～10孔内)。其中每一行的11～12孔内分别加入100μl DMEM2%作为空白对照。做三块复板。置于37℃，5%CO 2孵箱中培养10天。
1.2.5 结果判定
96孔板中的阴性对照的细胞形态正常，没有出现任何致细胞病变效应；96孔板上的最低稀释浓度应该100%出现致细胞病变效应，而最高稀释浓度应该0%出现致细胞病变效应。该次试验结果有效。
观察96孔板的每一孔的致细胞病变效应(CPE)，统计每一个稀释度出现CPE 效应的比率(100%出现CPE 效应为1，以此类推)。
TCID50测定的典型结果如下图所示： 1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × × ×
阴性对照
1.3 结果计算 试验数据采用K?RBER 法进行处理。按下列公式计算结果：
100μl 样品的病毒滴度=101+(s-0.5)
S 为每个稀释度出现CPE 效应的比率之和(从10-1开始)
10-13
10-12
10-11
10-10
10-9
10-8
10-7
10-6
那么，1ml样品的病毒滴度=10×101+(s-0.5)=102+(s-0.5)(IU/ml)
十、病毒比滴度（比活性IU）测定，病毒感染滴度/病毒颗粒数（IU ／VP）应高于3．3％
腺病毒比滴度= 滴度/颗粒数×100%
十一、E1A区、E2B区、AAV及插入基因的检测
一）E1A区的检测
293细胞含有复制缺陷型腺病毒复制所必需的E1A基因，在重组腺病毒生产过程中可能发生同源重组，导致复制型腺病毒（RCA）的出现。为确保重组腺病毒产品中没有RCA的出现，我们采用PCR方法检测是否有E1A区的存在。一．试验材料
1 扩增引物
PA1：5’ATTACCGAAGAAATGGCCGC 3’
PA2：5’CCCATTTAACACGCCATGCA 3’
均用无菌水配制成10 M的溶液。
2 DNA分子量标准
1kb DNA Ladder购自GIBCO/Invitrogen。
3 对照品
纯化后野生型腺病毒DNA。
二．试验步骤
1 293细胞总DNA的抽提
培养293细胞，按《现代医学试验方法》所述提取细胞DNA。
2 PCR扩增
取抽提好的DNA或阳性对照1μl为模板，依次加入H2O 28μl；10×扩增缓冲液5μl；2.5mM dNTP 4μl；10μM引物各5μl；1U/μl Ta q DNA聚合酶2μl。同时设置阴性对照，不加模板DNA。
于94℃预变性5分钟后，做30次循环：94℃ 30秒；55℃ 30秒；72℃ 45秒。最后72℃延伸10分钟。
3 电泳
将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，60V，1小时后，凝胶成像系统测定样品的分子量大小。
三．结果判定
阳性对照应为1.07kb±10%，样品应为阴性。
二）E2B区的检测
设计E2B区的特异引物，PCR扩增腺病毒载体特征基因E2B区，并通过1%琼脂糖凝胶电泳测定PCR产物的分子量，DNA分子量标准为GIBCO/Invitrogen的100bp DNA Ladder。
1 试验材料
1.1 扩增引物
PB1：5’TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG 3’
PB2：5’CATCTGAACTCAAAGGGTGG 3’
均用无菌水配制成10 M的溶液。
1.2 DNA分子量标准
100bp DNA Ladder购自GIBCO/Invitrogen。
1.3 对照品
阳性对照质粒—pAdE-2。
2. 试验步骤
2.1 PCR扩增
取抽提好的DNA或阳性对照1μl为模板，依次加入H2O 28μl；10×扩增缓冲液5μl；2.5mM dNTP 4μl；10μM引物各5μl；1U /ul Taq酶2μl。同时设置阴性对照，不加入模板DNA。
于94℃预变性5分钟后，做30次循环：94℃ 30秒；55℃ 30秒；72℃ 45秒。最后72℃延伸10分钟。
2.2 电泳
将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，60V，1小时后，凝胶成像系统测定样品的分子量大小，应为0.86kb±10%。
三）AA V的检测
腺病毒与AA V常伴随发生，为保证制剂的单一性、纯粹性，对AA V的检测就相当重要。一般均采用特异引物通过PCR方法对AA V的特异条带进行扩增，结果应为阴性。
1 试验材料
1.1 扩增引物
Pan1：5’AACTGGACCAATGAAAACTTTCC3’
Pan2：5’ AAAAAGTCTTTGACTTCCTGCTT 3’
均用无菌水配制成10 M的溶液。
1.2 DNA分子量标准
100bp DNA Ladder购自GIBCO/Invitrogen。
1.3 对照品
AA V阳性对照DNA。
2. 试验步骤
2.1 PCR扩增
取抽提好的DNA或阳性对照1μl为模板，依次加入H2O 28μl；10×扩增缓冲液5μl；2.5mM dNTP 4μl；10μM引物各5μl；1U/μl Ta q DNA聚合酶2μl。同时设置阴性对照，不加模板DNA。
于94℃预变性5分钟后，做30次循环：94℃ 30秒；59℃ 30秒；72℃ 45秒。最后72℃延伸10分钟。
2.2 电泳
将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，60V，1小时后，凝胶成像系统测定，AA V 检测应为阴性。阳性产物扩增条带大小应为340bp。
四）插入基因的检测
1) 接种5×105
293细胞/2ml DMEM 10%/孔于6孔板，置于孵箱，37℃，5%CO
2
培养过夜；
2) 第二天，移去培养基，每孔加入500μl DMEM 5%，同时分别加入50μl的6.3
项制备的病毒种子液，做好标记，轻轻混匀，置于孵箱，37℃，5%CO
培养
2 90分钟；
3) 加入1.5ml DMEM 5%，小心混匀，继续培养48小时；
4) 收集培养上清液，按bFGF检测试剂盒和PDGF-BB检测试剂盒说明检测不同空
斑的表达情况，取100μl检测bFGF和PDGF-BB的表达。
十二、病毒外源因子检查：HPV、HCMV、HBV、HCV、HIV、HSV等根据相关试剂盒说明操作
十三、内毒素测定
《药典》（2010版第三部）附录ⅫE细菌内毒素检查法
本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
效价内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH值在6.0-8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，可
使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：
L=K/M
式中L为供试品的细菌内毒素限值一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；
K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表
示，注射剂K=5EU/（kg·h）,放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg·h），
鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg·h）；
M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）
或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62m2计
算。注射时间若不足1小时，按1小时计算。供试品每平方米体表面积
剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M）。
按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。
确定最大有效稀释倍数（MVD）最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数（1→MVD），在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD：
MVD=cL/λ
式中 L为供试品细菌内毒素限值；
c为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml，当L 以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小稀释浓度c=λ/ L；
λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。
方法1 凝胶法
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版 腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章 AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7 第五章常用技术 8 5.1 QBI-293A细胞培养 8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 10 5.4 腺病毒感染力测定 10
5.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定 14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 22 6.1 QBI-293A细胞培养 22 6.2 感染力测定 22 6.3 转移载体克隆 23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞 25 6.6 筛选和测定 25 6.7 在QBI-293A细胞中表达 26 6.8 重组腺病毒的扩增 26 6.9 纯化 26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒 AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素 β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶 bp Base Pair 碱基对
故障诊断基本原则、故障排查方法.
故障诊断基本原则、故障排查方法、电路排查的方法及数据流读取分析 2015-02-01刘金深圳三羚汽车电脑诊断仪 目录导读： 一、故障诊断基本原则 二、故障排查方法 三、电路排查的方法 四、数据流读取分析 一、故障诊断基本原则 造成电喷发动机故障的原因可能是电子控制系统故障，可能是低压油路、进排气气路故障，也可能是燃喷高压零部件或者发动机各机械部件故障。为准确而迅速地找出故障所在， 在故障诊断过程中我们应该遵循一定的原则，基本原则可概括为以下几点： 1、先读代码 电喷发动机都有故障自诊断功能，当系统出现某种故障时，电控单元就会即刻监测到故障并通过故障灯向驾驶员报警，与此同时以代码的方式储存该故障的信息。通常我们有两种方式获取故障码： 1）按下检查开关，发动机故障指示灯会按顺序闪出闪码； 2）使用诊断仪读取故障码。 从而我们可根据读得的故障码排查故障。 2、由外而内 在发动机出现故障时，先对电子控制系统以外的可能故障部位予以检查。这样可避免本来是一个与电子控制系统无关的故障，却对系统的传感器、电脑、执行器及线路等进行复杂且又费时费力的检查。 当发动机发生故障时，首先观察系统的故障指示灯，如果指示灯没亮，则基本可以作为机械故障来进行处理。如果指示灯亮，必须先读取故障码，进而进行相应处理。 3、先简后繁 很多情况下，发动机的故障都是比较简单的故障，电气系统的故障也是如此。我们可以首先对电气系统进行初步的检查，比如检查电控系统线束的连接状况： 1）传感器或执行器的电连接器是否良好？ 2）线束间的连接器是否松动或断开？ 3）电线是否有磨破或线间短路现象？ 4）电连接器的插头和插座有无腐蚀现象？ 5）各传感器和执行器有无明显损伤？ 如果以上简单检查找不出故障，则需要借助于仪器仪表或其他专用工具来进行检查时， 也应对较容易检查的先予以检查。能检查的项目先进行检查。
生物制品质量控制
生物制品质量控制 生物制品是以微生物、细胞、动物或人源组织和体液等为原料，应用传统技术或现代生物技术制成，用于人类疾病的预防、治疗和诊断。人用生物制品包括：细菌类疫苗（含类毒素）、病毒类疫苗、抗毒素及抗血清、血液制品、细胞因子、生长因子、酶、体内及体外诊断制品，以及其他生物活性制剂，如毒素、抗原、变态反应原、单克隆抗体、抗原抗体复合物、免疫调节及微生态制剂等。根据生物制品的用途可分为预防用生物制品、治疗用生物制品和诊断用生物制品三大类。 其起始材料均为生物活性物质； 生物制品生产加工全过程是生物学过程，是无菌操作过程； 有些生物制品的生产过程是有毒或有菌的过程; 生物制品多为蛋白质或多肽类物质，分子量较大，并具有复杂的分子结构, 较不稳定，易失活，易被微生物污染，易被酶解破坏。 其质量控制和质量检定是采用生物学分析方法，其效价或生物活性检定有其变异性； 生物制品原材料、中间品、成品、运输、贮存、甚至使用保持在“冷链”系统中； 特别是预防制品使用对象不是病人，而是健康人群； 生物制品的质量控制实行生产全过程监控; 特点： 1、起步晚、发展速度快，前景美好； 2、有巨大的科研价值、重大的经济效益和巨大的社会效益：因为生物制品多涉及国民的健康、长寿,社会稳定和经济的快速发展。 3、研发的产品面广，具有高速的成长性和广阔的发展空间。 2、人源性生物制品的特点: 1.效价高、医疗可靠2安全性好、不易产生副作用3稳定性好4资源有限、研究意义重 “GMP”是英文Good Manufacturing Practice 的缩写，中文的意思是“良好作业规范”，或是“优良制造标准”，是一种特别注重在生产过程中实施对产品质量与卫生安全的自主性管理制度。它是一套适用于制药、食品等行业的强制性标准，要求企业从原料、人员、设施设备、生产过程、包装运输、质量控制等方面按国家有关法规达到卫生质量要求，形成一套可操作的作业规范帮助企业改善企业卫生环境，及时发现生产过程中存在的问题，加以改善。第一条为规范药品生产质量管理，根据《中华人民共和国药品管理法》、《中华人民共和国药品管理法实施条例》，制定本规范。第二条企业应当建立药品质量管理体系。该体系应当涵盖影响药品质量的所有因素，包括确保药品质量符合预定用途的有组织、有计划的全部活动。第三条本规范作为质量管理体系的一部分，是药品生产管理和质量控制的基本要求，旨在最大限度地降低药品生产过程中污染、交叉污染以及混淆、差错等风险，确保持续稳定地生产出符合预定用途和注册要求的药品。第四条企业应当严格执行本规范，坚持诚实守信，禁止任何虚假、欺骗行为。 GLP（Good laboratory practice of drug) 药品非临床研究质量管理规范。GLP是英文Good Laboratory Practice 的缩写，中文直译为优良实验室规范。GLP是就实验室实验研究从计划、实验、监督、记录到实验报告等一系列管理而制定的法规性文件，涉及到实验室工作的所有方面。它主要是针对医药、农药、食品添加剂、化妆品、兽药等进行的安全性评价实验而制定的规范。制定GLP的主要目的是严格控制化学品安全性评价试验的各个环节，即严格控制可能影响实验结果准确性的各种主客观因素，降低试验误差，确保实验结果的真实性。1999年11月1日起国家食品药品监督管理局发布施行《药品非临床研究质量管理规范》。系指对从事实验研究的规划设计、执行实施、管理监督和记录报告的实验室的组织管理、工
图像质量评价标准
图像质量评价标准图像质量评价标准 文件编号 : 秘密等级：发出部门 : 颁发日期 : 版本号 : 发送至： 抄送： 总页数： 附件： 主题词：图像质量评价 编制 : 审核 : 批准 : 文件分发清单 分发部门/人数量签收人签收日期分发部门/人数量签收人签收日期 文件更改历史 更改日期版本号更改原因
图像质量评价标准 目录 1.目的及适用范围 (3) 2.规范性参考文件 (3) 3.术语与定义： (3) 3.1 主观评价 (3) 3.2 测试图像 (3) 4.一般要求 (3) 4.1测试样品 (3) 4.2测试环境 (3) 4.3 图片的选择 (4) 4.4测试项目 (4) 4.4.1静态图片测试项目： (4) 4.4.2 动态视频测试项目： (4) 4.5 评价方法及等级等级 (5) 4.5.1评价方法描述 (5) 4.5.2 数据处理 (6) 5.测试项目及评价方法 (6) 5.1 完整性及几何失真测试图 (6) 5.2 清晰度测试 (7) 5.3 图像层次、灰阶测试 (9) 5.4 色彩饱和度测试 (10) 5.6 抖动及噪点测试 (14) 5.7图像暗场特性 (17) 5.8图像亮场特性 (18) 5.9 图像完整性及失真测试 (19) 5.10 RGB重合性测试 (19) 5.11 移动字幕处理能力测试 (20) 5.11视频显示流畅性测试： (21) 5.12运动图像帧速度测试 (21) 5.13运动图像同步性测试 (21) 5.14运动图像更新程度测试 (21) 6.附件：评价项目及表格 (22) 第2页共22页
1.目的及适用范围 标准规定了公司显示产品图像质量测试的静态图片及动态视频。 标准的目的是给出图像质量的评价、判断标准及方法。 标准适用于公司所有显示产品（DLP、LCD、IDB等）的设计、生产、调试评价的依据。 2.规范性参考文件 GB/T 9379-1988 电视广播接收机主观试验评价方法 GY/T 228 -2007 标准清晰度数字电视主观评价 3.术语与定义： 3.1 主观评价 subjective assessment 直接利用观察者对被测系统质量的主观反应来确定被测系统性能的一种方法 3.2 测试图像 test materials 用于公司显示产品图像质量评价的、在图像内容上有特定要求的静止图像或动态视频。 4.一般要求 4.1测试样品 测试样品（以下简称“样品”）应是在逐批检查的合格产品批次中随机抽取的合格品。 4.2测试环境 本标准的测试环境应使用经过确认的标准测试设备，标准测试设备是指正常工作状态下的显示单元及显示系统（显示系统需确认颜色一致、机械位置、光学性能参数等均已达到系统要求或客户使用要求）；标准的DVD播放机；标准的信号源；标准连接线缆。
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介1 第二章应用重组腺病毒的优点2 第三章AdEasyTM技术3 3.1技术概况3 3.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程4 4.1将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 缩写英文全称中文全称 AdAdenovirus腺病毒 Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒AdVAdenoviralVector腺病毒载体 AmpAmpicillin氨苄青霉素 β-Galβ-Galactosidaseβ-半乳糖苷酶 bpBasePair碱基对 BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白cDNAComplementaryDNA互补DNA cccDNAClosedCircularCoiledDNA闭环螺旋DNA CPECytopathicEffect细胞病理效应CsClCesiumChloride氯化铯 DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸EtBrEthidiumBromide溴化乙锭FBSFetalBovineSerum胎牛血清 HrHour小时 ITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复KanKanamycin卡那霉素 kbKilobases千碱基对 KDaKiloDaltons千道尔顿LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite多克隆位点 MinMinute分钟 MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell)感染复数mRNAMessengerRNA信使RNA MWCOMOIecularWeightCut-off PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PFUPlaqueFormingUnit空斑形成单位 piPostInfection感染后RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸 TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%组织培养感染剂量 TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白 TETris/EDTATE溶液 wtWildType野生型 X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 第一章简介 当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。 1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，FrankGraham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广
图像与镜头质量测试规范
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药品生产质量管理规范年修订附录生物制品
药品生产质量管理规范年修订附录生物制品 文件管理序列号：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]
附录3： 生物制品 第一章范围 第一条生物制品的制备方法是控制产品质量的关键因素。采用下列制备方法的生物制品属本附录适用的范围： （一）微生物和细胞培养，包括DNA重组或杂交瘤技术； （二）生物组织提取； （三）通过胚胎或动物体内的活生物体繁殖。 第二条本附录所指生物制品包括：细菌类疫苗（含类毒素）、病毒类疫苗、抗毒素及抗血清、血液制品、细胞因子、生长因子、酶、按药品管理的体内及体外诊断制品，以及其它生物活性制剂，如毒素、抗原、变态反应当原、单克隆抗体、抗原抗体复合物、免疫调节剂及微生态制剂等。 第三条生物制品的生产和质量控制应当符合本附录要求和国家相关规定。 第二章原则 第四条生物制品具有以下特殊性，应当对生物制品的生产过程和中间产品的检验进行特殊控制： （一）生物制品的生产涉及生物过程和生物材料，如细胞培养、活生物体材料提取等。这些生产过程存在固有的可变性，因而其副产物的范围和特性也存在可变性，甚至培养过程中所用的物料也是污染微生物生长的良好培养基。
（二）生物制品质量控制所使用的生物学分析技术通常比理化测定具有更大的可变性。 （三）为提高产品效价（免疫原性）或维持生物活性，常需在成品中加入佐剂或保护剂，致使部分检验项目不能在制成成品后进行。 第三章人员 第五条从事生物制品生产、质量保证、质量控制及其他相关人员（包括清洁、维修人员）均应根据其生产的制品和所从事的生产操作进行专业知识和安全防护要求的培训。 第六条生产管理负责人、质量管理负责人和质量受权人应当具有相应的专业知识（微生物学、生物学、免疫学、生物化学、生物制品学等），并能够在生产、质量管理中履行职责。 第七条应当对所生产品种的生物安全进行评估，根据评估结果，对生产、维修、检验、动物饲养的操作人员、管理人员接种相应的疫苗，并定期体检。 第八条患有传染病、皮肤病以及皮肤有伤口者、对产品质量和安全性有潜在不利影响的人员，均不得进入生产区进行操作或质量检验。 未经批准的人员不得进入生产操作区。 第九条从事卡介苗或结核菌素生产的人员应当定期进行肺部X光透视或其它相关项目健康状况检查。 第十条生产期间，未采用规定的去污染措施，员工不得从接触活有机体或动物体的区域穿越到生产其它产品或处理不同有机体的区域中去。 第十一条从事生产操作的人员应当与动物饲养人员分开，不得兼任。
腺病毒中文操作手册
腺病毒中文操作手 册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术8 5.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞9 5.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定10
5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定14 5.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答22 6.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清
pAAV-CMV-iRFP腺病毒载体说明(图)
pAAV--‐CMV--‐iRFP 编号 载体名称 北京华越洋VECT10016 pAAV--‐CMV--‐iRFP pAAV--‐CMV--‐iRFP载体基本信息 载体名称: pAAV--‐CMV--‐iRFP 质粒类型: 腺病毒载体；荧光蛋白报告载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点 启动子: CMV 载体大小: 5603 b p 5' 测序引物及序列: pCAX--‐F (CAGCTCCTGGGCAACGTGC) 3' 测序引物及序列: C--‐CMV--‐24 (TATTAGGACAAGGCTGGTGGGCAC) 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: 红外荧光蛋白iRFP 克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble 宿主细胞（系）: 常规哺乳动物细胞系 备注: --‐--‐ 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 组成型 病毒/非病毒: 腺病毒 pAAV--‐CMV--‐iRFP载体质粒图谱和多克隆位点信息
pAAV--‐CMV--‐iRFP载体序列: ORIGIN 1 C CTGCAGGCA G CTGCGCGCT C GCTCGCTCA C TGAGGCCGC C CGGGCGTCG G GCGACCTTT 61 G GTCGCCCGG C CTCAGTGAG C GAGCGAGCG C GCAGAGAGG G AGTGGCCAA C TCCATCACT 121 A GGGGTTCCT G CGGCCGCAC G CGTGGAGCT A GTTATTAAT A GTAATCAAT T ACGGGGTCA 181 T TAGTTCATA G CCCATATAT G GAGTTCCGC G TTACATAAC T TACGGTAAA T GGCCCGCCT 241 G GCTGACCGC C CAACGACCC C CGCCCATTG A CGTCAATAA T GACGTATGT T CCCATAGTA 301 A CGTCAATAG G GACTTTCCA T TGACGTCAA T GGGTGGAGT A TTTACGGTA A ACTGCCCAC 361 T TGGCAGTAC A TCAAGTGTA T CATATGCCA A GTACGCCCC C TATTGACGT C AATGACGGT 421 A AATGGCCCG C CTGGCATTA T GCCCAGTAC A TGACCTTAT G GGACTTTCC T ACTTGGCAG 481 T ACATCTACG T ATTAGTCAT C GCTATTACC A TGGTGATGC G GTTTTGGCA G TACATCAAT 541 G GGCGTGGAT A GCGGTTTGA C TCACGGGGA T TTCCAAGTC T CCACCCCAT T GACGTCAAT 601 G GGAGTTTGT T TTGCACCAA A ATCAACGGG A CTTTCCAAA A TGTCGTAAC A ACTCCGCCC 661 C ATTGACGCA A ATGGGCGGT A GGCGTGTAC G GTGGGAGGT C TATATAAGC A GAGCTCGTT 721 T AGTGAACCG T CAGATCGCC T GGAGACGCC A TCCACGCTG T TTTGACCTC C ATAGAAGAC 781 A CCGGGACCG A TCCAGCCTC C GCGGATTCG A ATCCCGGCC G GGAACGGTG C ATTGGAACG 841 C GGATTCCCC G TGCCAAGAG T GACGTAAGT A CCGCCTATA G AGTCTATAG G CCCACAAAA 901 A ATGCTTTCT T CTTTTAATA T ACTTTTTTG T TTATCTTAT T TCTAATACT T TCCCTAATC 961 T CTTTCTTTC A GGGCAATAA T GATACAATG T ATCATGCCT C TTTGCACCA T TCTAAAGAA 1021 T AACAGTGAT A ATTTCTGGG T TAAGGCAAT A GCAATATTT C TGCATATAA A TATTTCTGC 1081 A TATAAATTG T AACTGATGT A AGAGGTTTC A TATTGCTAA T AGCAGCTAC A ATCCAGCTA 1141 C CATTCTGCT T TTATTTTAT G GTTGGGATA A GGCTGGATT A TTCTGAGTC C AAGCTAGGC 1201 C CTTTTGCTA A TCATGTTCA T ACCTCTTAT C TTCCTCCCA C AGCTCCTGG G CAACGTGCT 1261 G GTCTGTGTG C TGGCCCATC A CTTTGGCAA A GAATTGGGA T TCGAACATC G ATTGAATTC 1321 C CCGGGGATC T GCCGCCACC A TGGCGGAAG G ATCCGTCGC C AGGCAGCCT G ACCTCTTGA 1381 C CTGCGACGA T GAGCCGATC C ATATCCCCG G TGCCATCCA A CCGCATGGA C TGCTGCTCG 1441 C CCTCGCCGC C GACATGACG A TCGTTGCCG G CAGCGACAA C CTTCCCGAA C TCACCGGAC 1501 T GGCGATCGG C GCCCTGATC G GCCGCTCTG C GGCCGATGT C TTCGACTCG G AGACGCACA 1561 A CCGTCTGAC G ATCGCCTTG G CCGAGCCCG G GGCGGCCGT C GGAGCACCG A TCACTGTCG 1621 G CTtCACGAT G CGAAAGgAC G CAGGCTTCA T CGGCTCCTG G CATCGCCAT G ATCAGCTCA 1681 T CTtccTCGA G CTCGAGCCT C CCCAGCGGG A CGTCgccga g ccgcaggcg t tcttccgcc 1741 g caCCAACAG C GCCATCCGC C GCCTGCAGG C CGCCGAAAC C TTGGAAAGC G CCTGCGCCG 1801 C CGCGGCGCA A GAGGTGCGG A AGATTACCG G CTTCGATCG G GTGATGATC T ATCGCTTCG 1861 C CTCCGACTT C AGCGGCGAA G TGATCGCAG A GGATCGGTG C GCCGAGGTC G AGTCAAAAC 1921 T AGGCCTGCA C TATCCTGCC T CAACCGTGC C GGCGCAGGC C CGTCGGCTC T ATACCATCA 1981 A CCCGGTACG G ATCATTCCC G ATATCAATT A TCGGCCGGT G CCGGTCACC C CAGACCTCA 2041 A TCCGGTCAC C GGGCGGCCG A TTGATCTTA G CTTCGCCAT C CTGCGCAGC G TCTCGCCCG 2101 T CCATCTGGA A TTCATGCGC A ACATAGGCA T GCACGGCAC G ATGTCGATC T CGATTTTGC 2161 G CGGCGAGCG A CTGTGGGGA T TGATCGTTT G CCATCACCG A ACGCCGTAC T ACGTCGATC 2221 T CGATGGCCG C CAAGCCTGC G AGCTAGTCG C CCAGGTTCT G GCCTGGCAG A TCGGCGTGA 2281 T GGAAGAGTG A GTCGACGCG G CCGCTCGAG C CTAAGCTTG C CTCGAGCAG C GCTGCTCGA 2341 G AGATCTACG G GTGGCATCC C TGTGACCCC T CCCCAGTGC C TCTCCTGGC C CTGGAAGTT
故障诊断理论方法综述
故障诊断理论方法综述 故障诊断的主要任务有：故障检测、故障类型判断、故障定位及故障恢复等。其中：故障检测是指与系统建立连接后，周期性地向下位机发送检测信号，通过接收的响应数据帧，判断系统是否产生故障；故障类型判断就是系统在检测出故障之后，通过分析原因，判断出系统故障的类型；故障定位是在前两部的基础之上，细化故障种类，诊断出系统具体故障部位和故障原因，为故障恢复做准备；故障恢复是整个故障诊断过程中最后也是最重要的一个环节，需要根据故障原因，采取不同的措施，对系统故障进行恢复一、基于解析模型的方法 基于解析模型的故障诊断方法主要是通过构造观测器估计系统输出，然后将它与输出的测量值作比较从中取得故障信息。它还可进一步分为基于状态估计的方法和基于参数估计的方法，前者从真实系统的输出与状态观测器或者卡尔曼滤波器的输出比较形成残差，然后从残差中提取故障特征进而实行故障诊断；后者由机理分析确定系统的模型参数和物理元器件之间的关系方程，由实时辨识求得系统的实际模型参数，然后求解实际的物理元器件参数，与标称值比较而确定系统是否发生故障及故障的程度。基于解析模型的故障诊断方法都要求建立系统精确的数学模型，但随着现代设备的不断大型化、复杂化和非线性化，往往很难或者无法建立系统精确的数学模型，从而大大限制了基于解析模型的故障诊断方法的推广和应用。 二、基于信号处理的方法 当可以得到被控测对象的输入输出信号，但很难建立被控对象的解析数学模型时，可采用基于信号处理的方法。基于信号处理的方法是一种传统的故障诊断技术，通常利用信号模型，如相关函数、频谱、自回归滑动平均、小波变换等，直接分析可测信号，提取诸如方差、幅值、频率等特征值，识别和评价机械设备所处的状态。基于信号处理的方法又分为基于可测值或其变化趋势值检查的方法和基于可测信号处理的故障诊断方法等。基于可测值或其变化趋势值检查的方法根据系统的直接可测的输入输出信号及其变化趋势来进行故障诊断，当系统的输入输出信号或者变化超出允许的范围时，即认为系统发生了故障，根据异常的信号来判定故障的性质和发生的部位。基于可测信号处理的故障诊断方法利用系统的输出信号状态与一定故障源之间的相关性来判定和定位故障，具体有频谱分析方法等。 三、基于知识的方法 在解决实际的故障诊断问题时，经验丰富的专家进行故障诊断并不都是采用严格的数学算法从一串串计算结果中来查找问题。对于一个结构复杂的系统，当其运行过程发生故障时，人们容易获得的往往是一些涉及故障征兆的描述性知识以及各故障源与故障征兆之间关联性的知识。尽管这些知识大多是定性的而非定量的，但对准确分析故障能起到重要的作用。经验丰富的专家就是使用长期积累起来的这类经验知识，快速直接实现对系统故障的诊断。利用知识，通过符号推理的方法进行故障诊断，这是故障诊断技术的又一个分支——基于知识的故障诊断。基于知识的故障诊断是目前研究和应用的热点，国内外学者提出了很多方法。由于领域专家在基于知识的故障诊断中扮演重要角色，因此基于知识的故障诊断系统又称为故障诊断专家系统。如图1.1
图像与镜头质量测试规范标准
图像与镜头质量测试规
目录 一、图像质量理论测试 (3) 1、色板区域介绍 (3) 2、解析度 (3) 3、锐度 (4) 4、色散 (5) 5、色彩还原性 (6) 6、肤色还原 (7) 7、白平衡 (7) 8、低照度 (8) 9、逆光补偿 (9) 10、灰阶、动态围、对比度 (10) 11、镜头畸变 (11) 12、暗角 (12) 13、噪点 (13) 14、散光 (15) 15、紫边 (16) 二、实际景物拍摄 (16) 16、实际静景拍摄 (16) 注： 1、对比测试时需保障码流、帧率、分辨率、光圈最大等一致性。 2、若后续需要增加测试项会持续更新。
一、图像质量理论测试 1、色板区域介绍 备注 2、解析度 用摄像机拍摄的影音信号需要在电视上播放时，需要换算成与电视画质相同的单位。而电视的画面清晰度是以水平清晰度作为单位。通俗地说，我们可以把电视上的画面以水平方向分割成很多很多“条”，分得越细，这些画面就越清楚，而水平线数的数码就越多。这个单位是“电视行（TVLine）”也称线。解析度一般与镜头、CCD、CMOS 成像有关。 解析度16:9测试样
1、根据摄像机的画面比例在白色光源下拍摄一组色板样，并使用照度计读出测试环境亮 度。 2、打开HYRes 软件，依次点击“File”-->“Trimming mode”进入测试界面。 3、点击“File”-->“Open”选择一个待测试文件。 4、使用鼠标左键选择如上图红色区域部分。 5、点击Execute 读取当前区域的解析度值并记录数据。 6、测试实例： ISO12233标板在画面中过满，画面中拍摄到的这部分标板实际高度是168mm，而这标板 的实际高度是250mm，利用HYRes软件读数为1300LW/PH，因此根据： 所以最终结果应该就是： 3、锐度 锐度，有时也叫“清晰度”，它是反映图像平面清晰度和图像边缘锐利程度的一个指标。如果将锐度调高，图像平面上的细节对比度也更高，看起来更清楚。比如，在高锐度的情况下，不但画面上人脸的皱纹、斑点更清楚，而且脸部肌肉的鼓起或凹下也可表现得栩栩如生。在另一种情况下，即垂直方向的深色或黑色线条，或黑白图像突变的地方，在较高锐度的情况下，线条或黑白图像突变的交接处，其边缘更加锐利，整体画面显得更加清楚。因此，提高锐度，实际上也就是提高了清晰度，这是人们需要的、好的一面。但是，并不是将锐度调得越高越好。如果将锐度调得过高，则会在黑线两边出现白色线条的镶边，图像看起来失真而且刺眼。这种情况如果出现在块面图像上，图像就会显得严重失真，不堪入目。
生物制品质量管理制度
一、目的 确保生物制品的经营安全，加强经营过程中的监控管理措施，达到安全、合法经营的管理目标。 二、依据 《药品管理法》、《关于进一步加强生物制品管理的通知》（国食药监办[2008]613号）和《药品经营质量管理规范》及实施条例等相关法律法规。 三、适用范围 适用于公司生物制品的经营管理。 四、内容 生物制品是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。 1、生物制品的经营管理、药品质量以及安全管理中，企业法人是第一责任人。 2、凡购进生物制品，均应按规定配备专门的管理人员。 3、建立生物制品的专用账册及购进、入库验收、在库养护、出库复
4、生物制品购销业务中应票账货款相符。 5、生物制品账册及记录的保存期限应当自药品有效期期满之日起不少于5年。 6、生物制品的管理人员和直接业务人员应相对稳定，其管理人员和直接业务人员、储存和运输等人员每年接受相关业务培训，经考核合格后方可上岗。 7、严格执行药品电子监管码赋码和出入库“见码必扫”操作，确保正确核注核销，及时处理系统预警信息。加强对下游企业销售的管理，电子监管预警信息提示收货企业核注信息有误的必须立即暂停供货、进行调查，发现销售数量和流向等情况异常应及时报告。
一、目的 严格把好生物制品的购进业务质量关，确保依法经营并保证经营质量安全。 二、依据 《药品管理法》、《生物制品批签发管理办法》、《关于进一步实施生物制品批签发工作的通知》和《药品经营质量管理规范》及实施条例等。 三、适用范围 适用于公司生物制品购进环节的质量管理。 四、内容 1、药品配置中心指定专人负责生物制品的采购工作。 2、公司必须从生物制品生产企业或具有生物制品经营资格的批发企业购进生物制品，不得从不具有生物制品经营资格的单位或个人购进。 3、采购活动应当符合以下要求： 3.1确定供货单位的合法资格； 3.2确定所购入药品的合法性； 3.3核实供货单位销售人员的合法资格； 3.4与供货单位签订质量保证协议。 采购中涉及的首营企业、首营品种，按《供货单位及销售人员资质审
pAAV-CAG-GFP腺病毒载体说明(图)
pAAV--‐CAG--‐GFP 编号 载体名称 北京华越洋VECT10004 pAAV--‐CAG--‐GFP pAAV--‐CAG--‐GFP载体基本信息 载体名称: pAAV--‐CAG--‐GFP 质粒类型: 腺病毒载体；荧光蛋白报告载体 高拷贝/低拷贝: 低拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点 启动子: CAG (CMV e nhancer/chicken β--‐actin p romoter) 载体大小: 5439 b p 5' 测序引物及序列: pCAG f wd p rimer 5’CAACGTGCTGGTTATTGTG 3’ 3' 测序引物及序列: cggcttctggcgtgtgac 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: EGFP 克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble 宿主细胞（系）: 常规哺乳动物细胞系 备注: --‐--‐ 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 组成型 病毒/非病毒: 腺病毒 pAAV--‐CAG--‐GFP载体质粒图谱和多克隆位点信息
pAAV--‐CAG--‐GFP载体序列: ORIGIN 1 C TTCCGCTTC C TCGCTCACT G ACTCGCTGC G CTCGGTCGT T CGGCTGCGG C GAGCGGTAT 61 C AGCTCACTC A AAGGCGGTA A TACGGTTAT C CACAGAATC A GGGGATAAC G CAGGAAAGA 121 A CATGTGAGC A AAAGGCCAG C AAAAGGCCA G GAACCGTAA A AAGGCCGCG T TGCTGGCGT 181 T TTTCCATAG G CTCCGCCCC C CTGACGAGC A TCACAAAAA T CGACGCTCA A GTCAGAGGT 241 G GCGAAACCC G ACAGGACTA T AAAGATACC A GGCGTTTCC C CCTGGAAGC T CCCTCGTGC 301 G CTCTCCTGT T CCGACCCTG C CGCTTACCG G ATACCTGTC C GCCTTTCTC C CTTCGGGAA 361 G CGTGGCGCT T TCTCATAGC T CACGCTGTA G GTATCTCAG T TCGGTGTAG G TCGTTCGCT 421 C CAAGCTGGG C TGTGTGCAC G AACCCCCCG T TCAGCCCGA C CGCTGCGCC T TATCCGGTA 481 A CTATCGTCT T GAGTCCAAC C CGGTAAGAC A CGACTTATC G CCACTGGCA G CAGCCACTG 541 G TAACAGGAT T AGCAGAGCG A GGTATGTAG G CGGTGCTAC A GAGTTCTTG A AGTGGTGGC 601 C TAACTACGG C TACACTAGA A GAACAGTAT T TGGTATCTG C GCTCTGCTG A AGCCAGTTA 661 C CTTCGGAAA A AGAGTTGGT A GCTCTTGAT C CGGCAAACA A ACCACCGCT G GTAGCGGTG 721 G TTTTTTTGT T TGCAAGCAG C AGATTACGC G CAGAAAAAA A GGATCTCAA G AAGATCCTT 781 T GATCTTTTC T ACGGGGTCT G ACGCTCAGT G GAACGAAAA C TCACGTTAA G GGATTTTGG 841 T CATGAGATT A TCAAAAAGG A TCTTCACCT A GATCCTTTT A AATTAAAAA T GAAGTTTTA 901 A ATCAATCTA A AGTATATAT G AGTAAACTT G GTCTGACAG T TACCAATGC T TAATCAGTG 961 A GGCACCTAT C TCAGCGATC T GTCTATTTC G TTCATCCAT A GTTGCCTGA C TCCCCGTCG 1021 T GTAGATAAC T ACGATACGG G AGGGCTTAC C ATCTGGCCC C AGTGCTGCA A TGATACCGC 1081 G AGACCCACG C TCACCGGCT C CAGATTTAT C AGCAATAAA C CAGCCAGCC G GAAGGGCCG 1141 A GCGCAGAAG T GGTCCTGCA A CTTTATCCG C CTCCATCCA G TCTATTAAT T GTTGCCGGG 1201 A AGCTAGAGT A AGTAGTTCG C CAGTTAATA G TTTGCGCAA C GTTGTTGCC A TTGCTACAG 1261 G CATCGTGGT G TCACGCTCG T CGTTTGGTA T GGCTTCATT C AGCTCCGGT T CCCAACGAT 1321 C AAGGCGAGT T ACATGATCC C CCATGTTGT G CAAAAAAGC G GTTAGCTCC T TCGGTCCTC 1381 C GATCGTTGT C AGAAGTAAG T TGGCCGCAG T GTTATCACT C ATGGTTATG G CAGCACTGC 1441 A TAATTCTCT T ACTGTCATG C CATCCGTAA G ATGCTTTTC T GTGACTGGT G AGTACTCAA 1501 C CAAGTCATT C TGAGAATAG T GTATGCGGC G ACCGAGTTG C TCTTGCCCG G CGTCAATAC 1561 G GGATAATAC C GCGCCACAT A GCAGAACTT T AAAAGTGCT C ATCATTGGA A AACGTTCTT 1621 C GGGGCGAAA A CTCTCAAGG A TCTTACCGC T GTTGAGATC C AGTTCGATG T AACCCACTC 1681 G TGCACCCAA C TGATCTTCA G CATCTTTTA C TTTCACCAG C GTTTCTGGG T GAGCAAAAA 1741 C AGGAAGGCA A AATGCCGCA A AAAAGGGAA T AAGGGCGAC A CGGAAATGT T GAATACTCA 1801 T ACTCTTCCT T TTTCAATAT T ATTGAAGCA T TTATCAGGG T TATTGTCTC A TGAGCGGAT 1861 A CATATTTGA A TGTATTTAG A AAAATAAAC A AATAGGGGT T CCGCGCACA T TTCCCCGAA 1921 A AGTGCCACC T AAATTGTAA G CGTTAATAT T TTGTTAAAA T TCGCGTTAA A TTTTTGTTA 1981 A ATCAGCTCA T TTTTTAACC A ATAGGCCGA A ATCGGCAAA A TCCCTTATA A ATCAAAAGA 2041 A TAGACCGAG A TAGGGTTGA G TGTTGTTCC A GTTTGGAAC A AGAGTCCAC T ATTAAAGAA 2101 C GTGGACTCC A ACGTCAAAG G GCGAAAAAC C GTCTATCAG G GCGATGGCC C ACTACGTGA 2161 A CCATCACCC T AATCAAGTT T TTTGGGGTC G AGGTGCCGT A AAGCACTAA A TCGGAACCC 2221 T AAAGGGAGC C CCCGATTTA G AGCTTGACG G GGAAAGCCG G CGAACGTGG C GAGAAAGGA 2281 A GGGAAGAAA G CGAAAGGAG C GGGCGCTAG G GCGCTGGCA A GTGTAGCGG T CACGCTGCG 2341 C GTAACCACC A CACCCGCCG C GCTTAATGC G CCGCTACAG G GCGCGTCCC A TTCGCCATT 2401 C AGGCTGCGC A ACTGTTGGG A AGGGCGATC G GTGCGGGCC T CTTCGCTAT T ACGCCAGCT 2461 G CGCGCTCGC T CGCTCACTG A GGCCGCCCG G GCAAAGCCC G GGCGTCGGG C GACCTTTGG