农杆菌介导Ds转座因子的黄瓜遗传转化

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黄瓜高效遗传转化体系的建立和嫩果白皮基因w的图位克隆与功能分析

一、植物基因图位克隆的技术原理和应用
植物基因图位克隆是一种基于基因组图谱的基因克隆技术，其基本原理是在基因组图谱中找到与目标基因相关的DNA片段，然后通过分子生物学方法克隆出该基因。该技术在植物基因功能研究中的应用主要体现在以下几个方面：
一、植物基因图位克隆的技术原理和应用
1、揭示基因与表型特征之间的关系：通过图位克隆技术，科学家们可以克隆出与特定表型特征相关的基因，进而研究其功能和作用机制。
一、引言
与功能分析将有助于我们深入理解黄瓜的生长发育机制，为进一步的遗传改良提供理论依据。
二、黄瓜高效遗传转化体系的建立
二、黄瓜高效遗传转化体系的建立
1、种子处理：选择健康、无病的黄瓜种子进行消毒处理，以减少细菌和真菌的污染。
2、胚胎培养：在无菌环境下，将消毒后的种子植入含有适当营养物质的培养基中，进行胚胎培养。
3、数据分析：采用合适的数据分析方法和软件进行数据分析。例如，使用聚类分析方法对不同样本间的基因表达谱进行聚类；使用差异表达分析方法筛选出差异表达的基因；使用网络分析方法分析基因之间的相互作用关系。
6、临床应用：根据候选基因的研究结果，开发针对该疾病的诊断试剂、药物等临床应用方案。
4、结果解释：对数据分析结果进行解释，将分析结果与实验目的进行关联，得出有关疾病机制或候选基因功能的结论。
图位克隆基因是一种基于基因组图谱的基因克隆技术。它首先利用物理作图和DNA测序技术构建基因组图谱，然后根据图谱信息定位疾病相关基因。图位克隆基因技术具有定位准确、克隆效率高、可重复性强等优点，为科研人员在基因克隆领域提供了新的解决方案。
图位克隆基因的方法
1、实验设计
1、实验设计
图位克隆基因实验的第一步是实验设计。科研人员首先需要确定研究的疾病类型和目标基因，然后制定实验方案，包括样本收集、DNA提取、基因组图谱构建等步骤。

农杆菌介导的黄瓜未受精子房培养遗传转化体系的建立

农杆菌介导的黄瓜未受精子房培养遗传转化体系的建立作者：魏爱民杜胜利韩毅科刘楠来源：《中国瓜菜》2014年第05期摘要：为了建立一种直接获得转基因纯系的转化方法，首次开展了农杆菌介导的黄瓜未受精子房培养遗传转化体系研究。

试验以除草剂草胺膦为选择标记，胚胎发生阶段，最适除草剂质量浓度为0.5～1.0 mg·L-1，幼苗生根阶段除草剂质量浓度为2.0 mg·L-1；以羧苄青霉素为抑菌剂，最适抑菌质量为450 mg·L-1；最佳浸染方法为OD600=0.3农杆菌工程菌，浸染10 min；共培养时间为3 d；在浸染菌液和共培养基中加入0.01% 的silwet-77，有利于获得较多抗性胚胎及抗性植株。

该遗传转化体系的建立，为黄瓜转基因方法研究开辟了新途径。

关键词：黄瓜；未受精子房；农杆菌；转化体系黄瓜是我国人民喜食的蔬菜之一，消费量大，种植面积广。

近年，随着人民生活水平的提高，对黄瓜新品种提出了更高要求。

由于黄瓜遗传基础狭窄，依靠现有材料很难选育出商品性、抗病性、品质性状等方面均具有突破性的新品种。

基因工程方法可以创造性地获得新材料，特别是通过常规育种方法不能获得的育种新材料。

基因工程技术在水稻品种改良上得到了广泛的应用，我国已成功选育了抗虫、抗除草剂、抗病、养分高效、耐盐和高产等一系列转基因水稻品系/组合[1]。

黄瓜转基因研究开始于上世纪90年代，研究者对遗传转化体系进行了大量研究，应用较多的转化方法主要为：以体细胞再生体系为基础的农杆菌介导法[2-4]、花粉管通道法[5-6]，研究者已对黄瓜抗病[7]、抗虫[8]、抗逆[9]、品质[10]、产量[4]等相关性状基因进行目的基因转化研究。

但上述转基因研究中存在转化率低、基因型差异明显、转化体多为嵌合体、多代筛选才能获得抗性纯合株系、重复性差等问题。

目前，黄瓜的转基因研究尚未应用于育种实践。

黄瓜未受精子房培养技术已获得成功，并进行育种应用[11]。

黄瓜‘新津春四号’遗传转化体系的建立

Ａｂｔａｔ：Ｔｈｅｅｅｉｔａｆｒｔｎｙｔｍｏｕｃｍｂｅ ‘ ｗＪｎｈｎ４ ’ ｍｅｉｔｄｙｓｒｃｇｎｔｃｒｎｓｍａｉｓｓｅｏｏｆｃｕｒＮｅｉｃｕｄａｅｂＡｇｒａｅｉｍｏｂｃｔｒｕ
ｔｆｃｎｒｓｄｅ．ｈｕｕｅａｅＳｘｌｔｗｒｐｅｃｌｒｄｏＳ＋１６Ｂ０５ｍｕａｉｓｗｅｔｉＴｅｃｃｍｂｒｅｖｓｐｎｅｅｒ－ｔｅｎＭｍｅｅｅｕｄｌａｅａｓｕｕ．ｍｇ０－Ａ＋．ｇ１
基因的瞬时表达检测及ＰＲ检测证明ｆ因已成功转化。Ｃ基关键词：根癌农杆菌；瓜；传转化黄遗中图分类号：９３１Ｑ４．文献标识￣：ｉＡ５－文章编号：０５３９（１）６０７ — ６１０ — ３５２００ — ６９００
Ｃｒ＋４ｇＬ‘ｙｏａｓＴｅｈｔｅｅｗｅｅｔｎｆｒｄｓｃｅｓｕｙｔｅｅｅｔｌｔｔｂｕａｂ０ｍｇｆｒｄｙ．ｈｐｎｒａｓｍｅｕｃｓｆｌｒｇｎｒｅｐｎｌｓｙｇｓＨ２ｇｒｏｌｏａｄａｅ
（徽科技学院生命科学学院，安安徽风阳２３０）３１０
摘要：对根癌农杆菌介导 ‘ 新津春四号 ’ 黄瓜（ｕｕｉｓｔｕ．ＣｃｍｂａｖｓＬ）ｓｉ遗传转化的影响因素进行了研究。结果表明，黄
瓜叶片适宜的潮霉素（ｙｒｍｙｉｇ筛选浓度为４５０ｍｇＬ羧苄青霉素（ａｅｉｌ，ａｂ可有效抑Ｈｇｏｃ，）ｎ０ｍｇＬ；０ＣｒｎｉＣｒ）ｂｃｔｉｎ

黄瓜高效遗传转化体系的建立及银杏抗菌肽转化_田花丽

西北农业学报2011,20(2):134-139A cta A gr icultur ae Bor eali-occidental is Sinica黄瓜高效遗传转化体系的建立及银杏抗菌肽转化田花丽,刘缙,张彦锋,刘君,郭蔼光(西北农林科技大学生命科学学院,陕西省农业分子生物学重点实验室,陕西杨凌712100)摘要:建立黄瓜的高效再生和遗传转化体系,并进行银杏抗菌肽GK-2的遗传转化。

研究结果表明,M S6 (M S+0.005mg/L T D Z+0.20mg/L I AA)培养基适于黄瓜愈伤组织的形成和不定芽分化,7d即可分化出不定芽,出愈率和分化率分别高达100%和86.67%。

进一步用带有银杏抗菌肽GK-2目的基因的农杆菌转化黄瓜,筛选出了侵染时间20min、共培养时间3d以及卡那霉素抗性筛选质量浓度为100mg/L的最佳转化体系。

利用该体系转化黄瓜,获得的转化植株阳性率高达17.9%,并对黄瓜枯萎病表现出明显的抗性。

关键词:黄瓜;遗传转化;银杏抗菌肽中图分类号:S642.2;Q78文献标志码:A文章编号:1004-1389(2011)02-0134-06Establishment of an Efficient Genetic Transformation System of Cucumber and Transformation of Ginkgo Ant-i fungal Peptide GeneT IA N Huali,LIU Jin,ZHAN G Yanfeng,LIU Jun and GU O Aig uang (College of Life Scien ces,Sh aanxi Key Lab oratory of M olecular Biology for Agriculture,Northw estA&F Univer sity,Yangling Shaanxi712100,C hina)Abstract:A fast regeneratio n system and a hig hly efficient g enetic transfo rmatio n system of cucumber w ere established,and the transform ation of Ginkgo ant-i fungal peptide GK-2gene w as also done.The result show ed that M S6(MS+0.005m g/L TDZ+0.20m g/L IAA)m edium w as suitable for cucum-ber callus formation and adventitious bud differentiation,w hich ex hibited100%callus rate and 86.67%differentiatio n rate w ithin7days.T ransferring Ginkgo ant-i fungal peptide GK-2g ene into cucumber by Agr obacter ium-mediated,w e obtained the optimized genetic transfo rmation system o f20 min infection time and3day s co-culture as w ell as100m g/L kanamy cin resistance screening concen-tration.U sing this sy stem,the positive rate w as17.9%,and transgenic plants exhibited a high re-sistance to Fusarium w ilt.Key words:Cucumber;Genetic transformation;Ginkg o ant-i fungal peptide枯萎病是黄瓜的主要病害之一,由黄瓜镰刀胞菌侵害引起,病原菌主要从植株根部或茎部侵入,在维管束内寄生,导致植株严重生长不良而整株枯死,给黄瓜生产造成较大的经济损失[1-2]。

生物学中的植物遗传转化与基因编辑技术

生物学中的植物遗传转化与基因编辑技术植物遗传转化与基因编辑技术在生物学中的应用植物遗传转化与基因编辑技术是生物学领域中的重要研究方向，它们可以用于改良植物品种、提高农作物产量和抵抗力、开发新型植物药物等。

一、植物遗传转化技术的原理和方法植物遗传转化是指将外源基因或DNA片段导入植物细胞，并使其稳定地遗传给后代。

常见的植物遗传转化方法包括农杆菌介导的遗传转化、基因枪法和凯南法等。

1. 农杆菌介导的遗传转化农杆菌介导的遗传转化是最常用的植物遗传转化方法之一。

该方法利用土壤中广泛存在的植物病原性农杆菌将外源基因导入目标植物细胞。

首先，将外源基因插入农杆菌质粒的T-DNA区域，然后将农杆菌通过注射或浸泡等方式导入植物细胞。

在遗传转化后，利用选择标记基因或报告基因进行筛选和检测。

2. 基因枪法基因枪法是将DNA载体以高速射击的方式直接导入植物细胞。

将外源基因负载在金粒等微粒表面，然后使用高压氦气或火药等加速器将其射入植物细胞。

在转化后，通过培养基中的选择性筛选剂来筛选转化的细胞。

3. 凯南法凯南法是一种基于物理和化学手段的遗传转化方法。

通过利用聚乙烯醇（PEG）或电击等方法，使DNA能够与植物细胞质融合，然后通过培养和筛选等步骤来获得转化的植物细胞。

二、基因编辑技术在植物遗传改良中的应用基因编辑技术是指通过精确地修改植物基因组中的特定位置，实现遗传改良的方法。

常见的基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALENs和ZFNs等。

1. CRISPR-Cas9系统CRISPR-Cas9系统是一种高效、快速和精确的基因编辑技术。

它利用CRISPR RNA（crRNA）和转录单元RNA（tracrRNA）组成的复合物与Cas9蛋白结合，以形成靶向特定基因序列的复合物。

在植物中，CRISPR-Cas9系统被广泛应用于基因敲除、基因敲入和基因修饰等方面。

通过将CRISPR-Cas9系统导入植物细胞，可以实现对植物基因组的精确编辑。

黄瓜(Cucumis sativus L.)果瘤基因Tu表达载体构建及遗传转化

黄瓜(Cucumis sativus L.)果瘤基因Tu表达载体构建及遗传转化任国良;杨绪勤;何欢乐;蔡润;潘俊松【摘要】为了进一步优化黄瓜遗传转化体系,提高遗传转化效率,构建含有自身启动子的黄瓜果瘤基因(T“)表达载体pCAMBIA2301-Tu,将表达载体通过电击法导入农杆菌菌株GV3101中,进行农杆菌介导的黄瓜遗传转化的研究.使用限制性内切酶K pnI和BamHI对质粒pCAMBIA2301和Tu基因PCR产物进行双酶切,回收目的片段,连接后成功构建Tu基因表达载体.通过优化遗传转化的生根条件以及抑制农杆菌生长条件,一定程度上提高了遗传转化的效率.580个外植体通过抗生素筛选获得的18株再生苗进行PCR检测和测序鉴定,最终获得8株阳性转化苗,转化效率为1.37％.【期刊名称】《上海交通大学学报（农业科学版）》【年(卷),期】2014(032)003【总页数】6页(P89-94)【关键词】黄瓜;果瘤基因;载体构建;遗传转化【作者】任国良;杨绪勤;何欢乐;蔡润;潘俊松【作者单位】上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海200240【正文语种】中文【中图分类】S642.2;Q786黄瓜是世界普遍栽培的经济作物,也是我国保护地生产的第一大作物[1],对保障蔬菜供应起着重要作用。

长期以来,对于黄瓜的育种研究主要围绕两个方面,一方面是提高黄瓜单位面积产量;另一方面是改良黄瓜的品质性状[2]。

果瘤是黄瓜果实表面的隆起部分,是黄瓜的特有性状。

果瘤是黄瓜十分重要的品质性状,与黄瓜的经济价值息息相关。

遗传转化是验证克隆基因功能最直接、最重要的方法之一,由于很多植物的遗传转化方法成熟,可重复性强,为基因功能验证提供了便利条件。

目前,像拟南芥[3-5]、番茄[6-8]等植物的遗传转化为克隆基因的功能验证提供了十分重要的手段,但是,由于葫芦科植物如黄瓜[9-15]、甜瓜[16-17]等遗传转化很难,且重复性差,给这些植物基因验证带来了很大困难,因此,我们迫切地需要转化效率高、重复性好的遗传转化方法,这将极大地推动黄瓜、甜瓜等植物的基因功能研究。

农杆菌介导的黄瓜炭疽菌遗传转化

体体系，包括农杆菌使用浓度、杆菌与炭疽茵孢子共培养时间、生素配合使用抑制农杆菌污染等、农抗所用的转化载体ｐＩＲＨＰ一ＵＳＧＦＢＧ２Ｈ２Ｇ－Ｐ除了抗生素选择标记外还携带有融合ＧＰＧＵＳ报告基因．Ｆ— 转化１个孢子平均可获得约１００Ｏ５￣２０个潮霉素抗性转化子．Ｃ检测表明，有潮霉素抗性转化子菌ＰＲ所株都能从其基因组ＤＮＡ中扩增到转化载体中的ＧＵＳ基因片段，且都能产生ＧＦ荧光或ＧＵ染色而ＰＳ阳性、化子菌株经过连续继代培养后保持稳定随机对３转６个转化子菌株进行致病性测定，现１个转发化子菌株对黄瓜致病性下降，丧失致病性，大多数表现为野生型致病性．杆菌介导转化瓜类炭１个而农疽茵体系的建立，为进一步构建大库容量的ＴＤＮ插入突变体库、病性突变体筛选以及致病性相关 — Ａ致
ｃｓｅｔｄｅｈｏｔｏｆｐｅｇｉｌｓｉｕａｓｔｐｐｏｔｒａｅｅｔｎｍａｋｒａｄａＧＦＰＧＵＳａｓｔｅｕｄｒｔｅｃｎｒｌｏＡｓｒｌｕｄｌｎｒＣｒｍｏｅｓａｓｌｃｉｒｅｎｎｏ－
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浙江大学学报（农业与生命科学版）３（）３０６，０６２４：６￣３６２０

遗传转化的方法和技术

遗传转化的方法和技术常见的遗传转化方法和技术包括农杆菌介导法、基因枪转化法和聚乙二醇-介导法等。

其中，农杆菌介导法是植物基因转化中使用最普遍的一种方法。

其Ti质粒具有将DNA整合到植物染色体上，并使之与植物内源基因同步表达的能力。

农杆菌介导法的具体步骤如下：1. Ti质粒的构建：利用农杆菌进行遗传转化前，必须对Ti质粒进行改造。

改造的目的有以下几点：去除T-DNA区的激素基因，因为激素基因的产物会导致转化细胞激素水平的不平衡而引起细胞的无限分裂，阻碍正常植株的再生。

保留T-DNA区的左右边界，尤其是左边界，以保证T-DNA的正常转化。

在去除的T-DNA区，增加至少一个可以在植物体内表达的选择基因，以使转化细胞易于被检测出来。

在T-DNA区外加一个可以克隆外源目的基因的多聚接口。

在T-DNA区外加一个抗菌素基因标记质粒，该基因只能在细菌中表达，而不能在植物中表达。

2. 外源基因的转化：除Ti质粒外，发根农杆菌的Ri质粒也已成为植物基因工程载体家庭中的新成员。

发根农杆菌感染植物伤口，向目的植物转入Ri质粒中的T-DNA，经一段时间后被感染的植物会在不定的部位生出发状根。

发状根没有向地性，可在无激素的培养基上培养生长，生长迅速并产生许多分枝，其增长速度一个月可增殖数倍到数百倍。

发根农杆菌对植物的这种作用主要依赖于其菌体中的Ri质粒。

例如通过发状根培养来生产只有在高度的根趋向分化细胞中才能产生的有用次生代谢物质等。

3. 外源基因的转化：一般而言，农杆菌只感染双子叶植物；但利用Ti质粒作载体已将外源基因导入了水稻、玉米、吊兰、石刁柏、香蕉等某些单子叶植物中。

农杆菌介导的遗传转化技术简单，易于掌握，对植物受体要求不严，绝大多数双子叶植物和少数单子叶植物的组织或器官均可，且转化频率较高，转化周期较短，是目前应用最广的一种植物遗传转化方法。

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安徽农业科学．ｕａｏＡｈｉｇ．ｃ２０，５２）７４ —０８ＪｒｌｆｎｕＡｒＳｉ０７３（３：０７７４ｏｎｉ．
责任编辑姜丽责任校对王森
农杆菌介导Ｄ转座因子的黄瓜遗传转化ｓ
ＬＩＡｉｎｌ（ｏｌｇｆｅｔ，ｎｎＵｎｖｒｉｆｃｅｃｎｅｈｎｌｇ，ｕｙｎ，ｎｎ４０）Ｕ￣ｏｇｅａＣｌｅｏｒｓｌＨｅａｉｅｓｔｏｉｎｅａｄＴｃｏｏｏｙＬｏａｇＨｅａ７１３ｔｅＦＴｙＳ０
ＡｂｔａｔＴｈｃｉａｉｎｔｇｉｇｐＢａｓｔａｓｏｍｅｉｔｃｃｔｂｒｖａＡｇｏａｔｒｕ－ｍｅａｅｗｉｈｓｒｃｅａｔｖｔａｇｎＤｓｒｗａｒｎｆｒｄｎｏｕｕｌｅｉｒｂ￣ｅｉｍｏｌｄｉｔｄｔＧＦＰｓｒｐ￣ｅｅｅ．Ｔｈａｅｏｒｇｎｓｅｔａｓｏｍｅｕｃｒｎｆｒｄｃｕｍｂｒｐｐｕａｉｎｗａａｎｄｅｏｌｔｓｇｉｅ．ＧＦＰｇｎｃｉａｉｎａｄｍｏｅｕａｅｅｔｎｗｅｅｃｎｄｃｅｔｈｒｎｆｒｄｐａｔ．ＴｈｏｅｅａｔｖｔｏｎｌｃｌｒｄｔｃｉｒｏｕｔｄｗｉｈｔｅｔａｓｏｍｅｌｎｓｏｅｒｓｌｓｓｏｄｔａｅｕｔｈｗｅｈｔＧＦＰｇｎｓｉｔｒｉｅｎｏｔｍａｏｇｎｍｅｈｅｐｏｉｖａｅｗａ２．％ｂｅｅｗａｎｅｋｎｔｄｉｔｏｔｅｏ．Ｔｓｔｅｒｔｓ７３ｔｉｙＰＣＲｅｅｔｏ．Ａｎｌｚｄｗｉｈｓｕｈｒｄｔｃｉｎａｙｅｔｏｔｅｎｂｏｔｎ，ｂｕ６０％ａｎｏｕａｉｎｗｉｈｏｅｉｅｔｄｓｔｎ．％ｗｉｈｔｎｓｒｅｉｅｒｅｅｔｄ．ｅａｅａｅｉｅｔｄＴ－ｌｔｉｇａｏｔ２．ｍｏｇＴＩｐｌｔｏｔｎｎｓｒｅｉｅａｄ５１０ｐｔｗｏｉｅｔｄｓｔｓｗｅｅｄｔｃｅＴｈｖｒｇｎｓｒｅＤＮＡ
关键词黄瓜；活标签；色荧光蛋白基因；激绿遗传转化
中图分类号
Ｑ８７
文献标识码
Ａ文章编号
Ｏ１— ６１２０）３００７０５７６１（０７２— ７４— ２
Ａｇｒｂｔｒｕ－ｅｉｔｄａｎｐｏｏａｆｒａｉＣｕｃｍｂｅｏａｃｅｉｍｍｄａｅＤｓＴｒｓｓｎＴｒｎｓｏｍｔｏｎｉｎｕｒ
１材料与方法
图１表达载体ｐＢｒ图谱Ｄｓａ
刘爱荣１陈双臣１（河科大林院河洛７０２汀学业生技学，汀州３０）．２，１南技学学，南阳４０；大农与物术院浙杭１２．１３．浙０９
摘要以黄瓜品种“ 中农１” 叶外植体为试料，色荧光蛋白ＧＰ基因为报告基因，用农杆菌介导的遗传转化法将构建的激活５子绿Ｆ利表达标签Ｄｓａ导入黄瓜，ＤＢｒ获得转基因黄瓜群体，对转化群体进行ＧＰ基因活性及分子检测。结果表明，ＦＦＧＰ已经整合到黄瓜基因组中：Ｂｒ因设计引物进行ＰＲ检测表明，以ａ基Ｃ阳性率为７＿％；２３通过Ｓｕｈｒ交分析，ｏｔｎ杂ｅ发现２．％为１６Ｏ个插入位点，１％为２个５．Ｏ插入位点，－ＮＴＤＡ在基因组中的平均拷贝数为２２。．个
笔者利用农杆菌介导法，以黄瓜子叶为外植体进行遗传转化，将转座子Ａ／ｓ人黄瓜，ｃ导Ｄ获得含Ａ／ｓ入的黄ｃ插Ｄ
瓜群体，分析插入位点两端的侧翼序列及插入特点，为建立
黄瓜ＴＤＡ插人侧翼序列数据库提供数据；转化株进行－Ｎ对突变体筛选，并对获得与农艺性状密切相关的部分重要功能基因的突变体特别是功能获得性突变体进行序列分析，旨在为将来克隆和研究相关性状基因奠定基础。
因的分离和鉴定 … 激活标签法目前主要应用于对拟南芥的。
研究，可能是因为ＴＤＡ对于基因组很大的植物很难得这－Ｎ
到足够多的插入突变体，且在ＴＤＡ插入突变中，大并－Ｎ很
一
部分突变体的ＴＤＡ和突变表型不能共分离的缘故［－Ｎ２ｔ。