色谱分析实验讲义
《色谱分析基础》课件
薄层色谱法：利用薄层色谱技术， 分离和分析液体和固体混合物
色谱分析的原理
色谱分析是一种分离和鉴定混合物的方法 原理：利用不同物质在固定相和流动相中的分配系数不同，实现分离 色谱分析包括气相色谱和液相色谱两种类型 气相色谱适用于分析挥发性物质，液相色谱适用于分析非挥发性物质
色谱柱的选择和使用
色谱柱类型： 填充柱、毛细 管柱、微板柱
法
样品保存：选 择合适的保存 方法和保存条
件
样品预处理： 包括样品的粉 碎、研磨、过
筛等
样品提取：选 择合适的提取 方法和提取条
件
样品净化：去 除样品中的杂 质和干扰物质
样品浓缩：将 提取液浓缩至 适宜的浓度进
行色谱分析
进样技术
进样方式：手动进样、自动进样 进样量：根据样品浓度和检测需求确定 进样时间：根据仪器性能和样品性质确定 进样温度：根据样品性质和检测需求确定
检测：选择合适的检 测器，如紫外检测器、 荧光检测器等，检测 样品的响应信号
添加标题
数据处理：对检测信 号进行数据处理，如 峰面积、保留时间等， 得到样品的定性和定 量结果
实验结果和数据分析
实验结果：色谱图中的峰高、峰面积、保留时间等参数 数据分析：通过峰高、峰面积、保留时间等参数进行定性和定量分析 结果解释：根据分析结果，对样品进行定性和定量分析 数据处理：对实验数据进行处理，如平滑、基线校正等 结果报告：撰写实验报告，包括实验方法、结果、讨论和结论等
施
实验结束后， 及时清理实验 现场，确保实
验室整洁
仪器设备安全防范措施
确保仪器设备接地良好，避免静电 干扰
操作仪器设备时，应佩戴防护眼镜 和手套等防护用品
添加标题
添加标题
气相色谱分析讲义02
质量型：检测的是载气中组分进入检测器中速度变化，即响应值与单位时间 进入检测器的质量成正比。如FID、FPD。
根据应用范围，分为通用型检测器和选择型检测器
通用型：对所有物质有响应，如TCD、FID。 选择型：对特定物质有高灵敏响应，如ECD、FPD、NPD。
1）在只有载气通过时，四个臂的温度都保持不变，电阻值 也不变。此时，调节电路电阻使电桥平衡，
即R2*R测=R3*R参，ab两端无电压信号输出，记录仪走基
线。
2）当有样品随载气进入样品臂时，使测量臂的温度
改变，引起电阻的变化，参考臂流过的仍是纯载气，测量 臂和参考臂的电阻值不等，产生电阻差，R参≠R测， 则：R参·R3≠R测·R2。这时电桥失去平衡，a、b两端存在 着电位差，有电压信号输出。信号与组分浓度相关。记录 仪记录下组分浓度随时间变化的峰状图形。
过去是填充柱占主要，但现在，除了一些特定的分析之外， 填充柱将会被更高效、更快速的开管柱所取代！
柱温：是影响分离的最重要的因素。其变化应小±0.xoC。 选择柱温主要考虑样品待测物沸点和对分离的要求 柱温通常要等于或略高于样品的平均沸点 (分析时间20-30min)； 对宽沸程的样品，应使用程序升温方法。
3）载气种类： 载气与试样的热导系数相差越大，在检测器两臂中产生的温差和电阻
差也就越大，检测灵敏度越高。载气的热导系数大，通过的桥路电流 也可适当加大，则检测灵敏度进一步提高。
液-固色谱：固体吸附剂 液-液色谱：担体+固定液 柱制备对柱效有较大影响，填料装填太紧，柱前压力大，流速 慢或将柱堵死，反之空隙体积大，柱效低。
填充柱：多为U 形或螺旋形，内径2~4 mm，长1~10m，常用
《色谱法分析法 》课件
THANK YOU
汇报人：
色谱法分析法的优 缺点
优点
分离效果好：能够 将复杂混合物中的 组分分离出来
灵敏度高：能够检 测到微量的组分
应用广泛：适用于 各种样品的分析， 包括气体、液体和 固体
自动化程度高：可 以实现自动化操作 ，提高工作效率
缺点
样品处理复杂，需要专业的技术人员进行操作 分析时间长，需要等待较长时间才能得到结果 仪器设备昂贵，需要投入较大的资金进行购买和维护 操作环境要求高，需要保持实验室的洁净和温度稳定
评估指标：分离度、分辨率、 峰形、保留时间等
分离度：衡量两个相邻峰的 分离程度，越高越好
分辨率：衡量色谱图中两个 相邻谱峰的形状， 越尖锐越好
保留时间：衡量物质在色谱 柱中的保留时间，越短越好
色谱法分析法的应 用
在食品分析中的应用
检测食品中的添加 剂和污染物
鉴别食品中的营养 成分和功能成分
分离原理
色谱法分析法是 一种分离混合物 的方法
原理：利用不同物 质在固定相和流动 相中的分配系数不 同，实现分离
色谱法分析法可 以分为气相色谱 法和液相色谱法
气相色谱法适用 于挥发性物质， 液相色谱法适用 于非挥发性物质
检测原理
色谱法分析法是一种分离和检测混合物的方法 原理：利用不同组分在固定相和流动相中的分配系数不同，实现分离 检测方法：通过检测器检测出各组分的信号，进行定性和定量分析 应用：广泛应用于化学、生物、医药等领域
和杂质
生物技术：检 测生物样品中 的蛋白质、核 酸等生物大分
子
法医学：检测 生物样品中的 毒品、毒物等
色谱法分析法的实 验操作
实验前的准备
样品准备：样品处理、样品 稀释等
气相色谱试验讲义
热导检测器的结构
– 池体（一般用不锈钢制成）、热敏元件（钨丝） – 参考臂：仅允许纯载气通过，通常连接在进样装置
之前。 – 测量臂：需要携带被分离组分的载气流过，则连接
在紧靠近分离柱出口处。
影响TCD灵敏度的因素
? 桥路电流I ：I ? ，钨丝的温度 ? ，钨丝与池体之 间的温差 ? ，有利于热传导，检测器灵敏度提高 。检测器的响应值 S ∝ I 3，但稳定性下降，基 线不稳。桥路电流太高，还可能造成钨丝烧坏 。
? 池体温度：池体温度与钨丝温度相差越大，越 有利于热传导，检测器的灵敏度也就越高，但 池体温度不能低于分离柱温度，以防止试样组 分在检测器中冷凝。
影响TCD灵敏度的因素
? 载气种类：载气与试样的热导系数相差越大， 在检测器两臂中产生的温差和电阻差也就越大， 检测灵敏度越高。载气的热导系数大，传热好， 通过的桥路电流也可适当加大，则检测灵敏度 进一步提高。氦气也具有较大的热导系数，但 价格较高。
?TCD是基于物质的热导系数而设 计的检测器。用来测量气体热导 的热导池一般是由热的良导体不 锈钢制成。当流经热导池的气体 的热导率发生?? 变化时，热导池 池体发生? Q的热量变化，引起 热敏元件? T的温度变化，从而 使热敏丝的阻值变化? R，这种 变化由惠斯顿电桥测定，最后反 映出组分的浓度变化? C。
? 生物化学分析：脂肪酸和脂肪胺 ? 石油化工分析：用 200 m的毛细管一次可以分析
200个化合物 ? 环境分析：如水中有机物分析 ? 食品分析：如粮食中残留农药的分析、白酒分析 ? 药物临床分析：氨基酸、兴奋剂的分析 ? 军工分析：如火药、炸药分析等
气相色谱组成
检测器 +控制系统
进样系统
气路系统
色谱分析法专业知识讲座
12/30/2023
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§19—5 定性和定量分析
一、定性分析 色谱定性分析旳任务是拟定色谱图上每一
种峰所代表旳物质。在色谱条件一定时，任 何一种物质都有拟定旳保存时间。所以，在 相同色谱条件下，经过比较已知物和未知物 旳保存值，即可拟定未知物是何种物质。但 是，一般来说，色谱法是分离复杂混合物旳 有效工具，假如将色谱与质谱或其他光谱法 联用，则是目前处理复杂混合物中未知物定 性分析旳最有效旳技术。
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§19—2 线性洗脱色谱及有关术语
在洗脱色谱法中，假如将试样注入色谱柱
头，试样本身不久Байду номын сангаас会在固定相和流动相之间
到达分配平衡。当流动相流过时，试样将在流
动相和新旳固定相上又到达分配平衡。同步，
原来仍在固定相中旳试样与新旳流动相之间也
会形成新旳分配平衡。伴随流动相不断旳流过，
它们就会携带发生分配平衡后而存在于流动相
物质作为内标物，然后进行色谱分析，再由被
测物和内标物在色谱图上相应旳峰面积(或峰高) 和相对校正因子，求出某组分旳含量。
(3)调整保存时间t’R 某组分旳保存时间扣 除死时间后称为该组分旳调整保存时间，即
t’R = tR- tM
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因为组分在色谱柱中旳保存时间tR包括了 组分随流动相经过柱子所需旳时间和组分 在固定相中滞留所需旳时间，所以t’R实 际上是组分在固定相中停留旳总时间。保 存时间可用时间单位(如s)或距离单位(如cm) 表达。
保存时间是色谱法定性旳基本根据，但
同一组分旳保存时间常受到流动相流速旳
影响，在气相色谱中尤为如此，故色谱工 作者常用保存体积等参数进行定性鉴定。
色谱分析讲义(2020.11.27)
2020/11/28
色谱分析-1 22
分离因子 塔板数 塔板高度
2020/11/28
基本关系式
Байду номын сангаас
'
t V R(2)
2/1
'
t V R(1)
' R(2)
' R (1)
N
16
tR W
2
5.54
tR Wh
2
H L N
N和H都有理论值和有效 值两类,其差别在于用保 留时间和校正保留时间
色谱分析-1 23
基本关系式（死时间测定）
死时间的测定很难：
无合适样品（完全不保留并有足够强的紫外信号）
一般测定方法为（紫外检测器）：
1. 正向——四氟乙烯 反向——苯甲酸、硝酸等
2. 比流动相少一个C的同系物
3. 不具备条件时可用下式计算
空管柱体积 柱总空隙度
tM
流动相体积流量
tM tR2
(tR2 tR1) tR3 tR1 tR3 tR2 tR2 tR1
生素）
2020/11/28
色谱分析-1 7
化学研究
➢ 样品提纯—如合成产品的检验等
➢ 物质性质与其配比的相关性——色 谱法和化学计量学方法结合
2020/11/28
色谱分析-1 8
生命科学研究
➢ DNA测序—用CE、HPLC技术、 ➢ 生物工程下游技术—细胞的培养、分离、纯
化和分析检测
参见 刘国诠主编 《生物工程下游技术》 化学工业出 版社，1993年
GC-MS LC-MS GC-MS-MS GC-FTIR
2020/11/28
色谱分析-1 17
色谱基本理论
《色谱分析基础 》课件
分离效果相对较差，灵敏度较低。
04 色谱分析实验技术
实验设计
实验目的
明确实验的目标和意义，确保实验具有 实际应用价值。
实验步骤
详细列出实验操作步骤，包括样品处 理、色谱柱选择、进样、洗脱等，确
保实验过程规范、准确。
实验原理
阐述色谱分析的基本原理和实验操作 流程，确保实验的合理性和科学性。
实验安全
数据处理与分析
数据采集
记录实验过程中的各项数据，包 括色谱图、峰高、峰面积等，确 保数据的完整性和准确性。
数据处理
采用适当的数学方法对原始数据 进行处理，如平滑、基线校正、 归一化等，以提高数据的可靠性 和可比性。
结果分析
根据处理后的数据，进行结果分 析和解释，得出实验结论，为实 际应用提供科学依据。
优点
分离效果好、分析速度快、灵 敏度高。
缺点
对于高分子量和热稳定性差的 化合物不太适用。
液相色谱法
原理
利用液体作为流动相，将样品中的各 组分在固定相和流动相之间进行分离 ，再通过检测器进行检测。
应用范围
主要用于分析高分子量、热稳定性差 、不易挥发的有机化合物，如蛋白质 、核酸等生物大分子。
优点
分离效果好、分析速度快、灵敏度高 ，适用于复杂样品的分析。
色谱分析具有高效、高分辨率和高灵敏度等特点，广泛应用于化学、生物、医学 和环境等领域。
色谱分析的原理
分离原理
色谱分析基于不同组分在两相之间的吸附或溶解性能差异进行分离。在流动相 的带动下，各组分在固定相和流动相之间反复分配，最终达到分离。
检测原理
通过检测器对分离后的组分进行检测，将组分的浓度或质量转化为电信号，以 便进行定量和定性分析。常见的检测器有紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、质谱 等。
色谱分析法基础讲课文档
第5页，共34页。
• 1951年， Martin 和James采用气体作为流动相，以自动滴定仪作为 检测器分析脂肪酸 ——气相色谱法。建立形成色谱学理论中有着重 要地位的塔板理论和Van Deemter方程，以及保留时间、保留指数、峰 宽等概念。
混合组份最终形成各个单组份的“带(band)”或“区(zone)”，
对依次流出的各个单组份物质可分别进行定性、定量分析。
第15页，共34页。
2、色谱流出曲线
由检测器输出的信号强度对时间作图，所得曲线即色谱流出曲线， 也称色谱图 。
第16页，共34页。
二、色谱相关术语
1、色谱峰（peak）：当某组分从色谱柱中流出时，检测器对该组分
明无法实现分离。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。因 此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。
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塔板理论（Plate theory)
1. 塔板理论的假设 2. 理论塔板高度和理论塔板数 3. 有效塔板高度和有效塔板数 4. 塔板理论的不足
第29页，共34页。
1952年，Martin 和Synge提出。
分配色谱法 partition chromatography
不同组份在固定相上的溶解能力不同
离子交换色谱法 ion exchange chromatography
不同组份在固定相（离子交换剂）上的亲和力不同
空间排阻色谱法 steric exclusion chromatography
不同尺寸分子在固定相上的渗透作用
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实验一气相色谱的基本操作及进样练习一、实验目的(1) 了解气相色谱仪的主要结构组成和应用。
(2) 掌握仪器基本操作和调试程序，熟悉气路运行过程。
(3) 明确热导池检测器的操作注意事项。
(4) 掌握气相色谱进样操作要领，练习微量注射器的使用方法。
二、实验原理通过实验了解气相色谱仪的结构与原理。
气相色谱仪是实现气相色谱过程的仪器，按其使用目的可分为分析型、制备型和工艺过程控制型。
但无论气相色谱仪的类型如何变化，构成色谱仪的5个基本组成部分皆是相同的，它们是载气系统、进样系统、分离系统(色谱柱)、检测系统及数据处理系统。
载气系统：载气是构成气相色谱过程中的重要一相——流动相，一般由高压钢瓶供气。
进样系统：汽化室是进样系统中不可缺少的组成部分，它的作用是把液体样品瞬间加热变成蒸汽，然后由载气带人色谱柱。
分离系统：色谱柱比作气相色谱仪的“心脏”，样品就是在此根据其性质的不同进行分离的。
检测系统：检测器是气相色谱仪的关键部件。
它的作用是将经色谱柱分离后顺序流出的化学组分的信息转变为便于记录的电信号，然后对被分离物质的组成和含量进行鉴定和测量。
数据处理系统：数据处理系统目前多采用微机型色谱数据处理机和配备操作软件包的工作站，既可对色谱数据进行自动处理，又可对色谱系统的参数进行自动控制。
三、仪器与试剂1．仪器气相色谱仪(GC9790型)；检测器(热导池TCD)；色谱柱(邻苯二甲酸二壬酯DNP)；微量进样器(1 μL)。
2．试剂环己烷(AR)；载气(氮气或氢气，含量99.99%以上)。
四、实验内容1．开机操作步骤(1)通气：首先连接好色谱柱，在检查气路密封良好的情况下，先逆时针旋转钢瓶总阀，调整减压阀输出压力0.4 ~ 0.5 Mpa，调节气相色谱仪上的载气稳压阀(总压)，使其输出压力为0.3Mpa，调节柱前压1和2的稳流阀2~3圈，载气流量氮气约为30mL·min-1，氢气约为40 mL·min-1。
(2) 通电：检查仪器开关都应处于“关闭”位置后，开启气相色谱仪右侧的电源开关，仪器接通电源以后计算机首先进入仪器的自检程序，其状态显示为指示灯全部打开，直到屏幕出现“OK！”字样后表示仪器自检通过，可以进入正常操作程序，并且显示器自动切换到屏幕显示状态，等待用户输入操作信息，此时若不进行任何信息输入，仪器保持此状态15秒后，将执行上一次关机前所设定的储存参数。
(3) 升温：系统自检完毕后，通过按[热导]、[注样器]、[柱箱]键，设定热导检测器的温度、注样器的温度和色谱柱的温度，各温度设定值检查无误后，按[输入] 键，仪器进入加热升温状态。
当实际温度达到设定温度后，恒温后仪器已进入稳定状态。
(4) 热导池电流调整：通过按[参数]键，设定热导检测器控制器参数，选择极性为1，桥电流120mA(氢气作载气)。
(5) 打开计算机和色谱工作站，双击桌面上图标，进入色谱工作站操作界面，把此界面中的信号通道改为B，选择“操作”菜单中的“谱图采集”命令或单击工具条上的“谱图采集”绿色按钮，这时文档窗口谱图区内开始有谱线走动，按下色谱仪上的通桥电流的红色按键，通上桥电流，观察基线是否稳定。
基线稳定后，通过[调零]旋钮调整基线位置。
基线位置调整好以后，即可进样分析。
2．液体进样操作练习(1) 每人选用一支1μL微量进样器，在实验老师的指导下，取0.5 μL的环己烷进样，进样的同时按下绿色遥控开关或单击工具条上的谱图采集绿色按钮，进行谱图采集，文档窗口内开始有谱图走动。
如果要调节谱图在横向和纵向上的缩放，请分别调节“谱图参数”表中“满屏时间”和“满屏量程”两个谱图显示参数，也可分别单击这两个参数旁的“满屏”按钮，使当前已采集到的谱图分别在横向和纵向上满屏。
如果谱图严重闪烁，可以通过加大满屏时间值来降低闪烁的程度。
(2) 待色谱峰出完后，选择“操作”菜单中“手动终止”命令或工具条上的手动停止红色按钮，这时将终止程序对谱图信号数据的实时采集和处理。
实际上，当谱图采集时间到达谱图参数表中的“采集时间”参数所指定的值时不用手动下达这个命令，程序也会自动结束谱图信号数据的实时采集和处理。
(3) 在谱图采集结束时程序会弹出一保存对话框，提示将整个文档窗口中的内容存到哪个磁盘文件中，这时可将程序推荐的文件名改为更有意义的文件名进行保存，然后记录色谱峰的峰面积，峰面积记录完毕后，执行下一次的进样操作，这样的操作总共进行8次，最后以8次进样的峰面积，求出极差和相对标准偏差。
(4) 微量进样器的使用方法及注意事项老师会进行讲解，每次实验后，要用适当溶剂清洗进样器。
3．关机实验结束后，首先按起桥电流的红色按钮，断掉桥电流。
然后将[柱箱]、[检测器]、[注样器]的温度都设定为50℃，待各温度降至设定温度后，关闭主机上的加热电源开关和总的电源开关，最后关闭载气。
五、注意事项(1) 取好样后应立即进样，进样时整个动作应稳定、连贯、迅速。
(2) 硅橡胶密封垫圈在几十次进样后，容易漏气，须及时更换。
(3) 先通载气，确保载气通过热导检测器后，再打开热导桥流。
(4) 当使用双气路色谱仪时，两路的载气流速应保持相同。
(5) 热导池系统使用氢气作载气时，必须置毛细管系统稳压阀处于关闭状态。
六、问题与讨论(1) 为什么有时同一样品同一进样量时色谱峰形(如峰高)不同？(2) 为什么有时进样后不出峰？实验二 内标法定量分析正己烷中的环己烷一、实验目的(1) 了解内标法的定量原理以及选择内标物的原则。
(2) 学会用内标法进行定量分析的实验技术。
(3) 熟悉氢火焰检测器的特点和使用方法。
二、实验原理内标法也是常用的一种比较准确的定量方法。
当样品中的所有组分因各种原因不能全部流出色谱柱，或检测器不能对各组分都有响应，或只需测定样品中某几个组分时，可用内标法定量。
内标法的原理是，准确称取一定量样品，加入一定量的内标物，根据被测物和内标物的质量及其在色谱图上的峰面积比，求出被测组分的含量，计算公式如下：%100⨯=ms s s i i i W f A W f A P 式中，P i 是组分i 的百分含量；W m ，W s 分别是样品和内标物的质量；A i ，A s 分别是被测组分和内标物的峰面积；f i ，f s 分别是被测组分和内标物的重量校正因子。
为了方便起见，常以内标物本身作为标准物，其f s =1.00。
内标法要求选择一个适宜的内标物，它在样品中不存在，当加入内标物进行色谱分离时，在色谱图上它应与被测组分靠近并与其他组分完全分离，内标物的量也应与被测组分的量相当，以提高定量分析的准确度。
内标法的定量分析方法中还有一种内标工作曲线法。
首先配制一系列的标准溶液，测得相应的A i /A s 值，绘制A i /A s ~m i /m s 标准曲线，如下图所示。
这样可在无需预先测定f i 的情况下，称取固定量的试样和内标物质，混合均匀后即可进样，根据A i/A s 之值求得样品的含量。
内标法定量结果准确，对于进样量及操作条件不需严格控制，内标工作曲线法更适合用于工厂的控制分析。
内标工作曲线示意图三、仪器与试剂1．仪器气相色谱仪(GC9790型，福立分析仪器有限公司)；热导检测器(TCD)；色谱柱(7%DNP)；微量进样器(1 μL，5 μL)。
2．试剂氢气；正己烷(AR)；环己烷(AR)；苯(AR)；未知样品。
四、实验内容(1) 打开载气，确保载气流经热导检测器，并调整流速大约为30 mL·min-1。
(2) 打开色谱仪的电源开关，待自检结束后，打开加热电源开关，在操作面板上通过按[注样器]、[柱箱]、[热导]键将汽化室、柱箱、检测器的温度分别设定为为100℃、60℃、80℃。
(3) 打开计算机和色谱工作站，点击计算机桌面上HW-2000色谱工作站图标，进入色谱工作站操作界面，选择色谱通道B，点击快捷菜单上的绿色按钮进入谱图采集状态。
(4) 当实际温度达到设定值后，通过仪器上的控制面板设定热导检测器桥电流为100mA，然后打开热导检测器开关，通上桥电流，观察基线是否稳定，通过调零旋钮调整基线位置。
(5) 待色谱仪稳定后，用微量注射器注入2 μL按质量法配置的已知浓度的环己烷、苯标准溶液，记录保留时间和峰面积。
重复操作三次(计算组分的校正因子)。
(6) 将0.5 μL正己烷、环己烷、苯分别注人色谱柱，记下各自的保留时间(目的是利用保留时间定性未知组分)。
(7) 称量一定量的未知物W m。
(8) 称量一定量的内标物W s，将其加入上述未知物中，并混合均匀。
(9) 取2 μL含有内标物的未知样品注入色谱仪，记录保留时间和峰面积。
此步骤重复三次。
(10) 实验结束后，首先按起桥电流的红色按钮，断掉桥电流。
然后将柱温、检测器、注样器的温度设定为50℃，待温度降至设定温度后，关闭各部分电源开关，最后关闭载气。
五、数据处理(1) 列表整理保留值及峰面积的数据。
(2) 以苯为标准物质计算环己烷的校正因子。
(3) 以苯为内标物利用内标法计算环己烷的含量。
六、注意事项(1) 先通载气，确保载气通过热导检测器后，再打开热导桥流。
(2) 当使用双气路色谱仪时，两路的载气流速应保持相同。
(3) 热导池系统使用氢气作载气时，必须置毛细管系统稳压阀处于关闭状态。
七、问题与讨论(1) 你认为实验中选取苯为内标物是否合适？为什么？(2) 内标法定量有什么优点？它对内标物有何要求？(3) 实验中是否需要严格控制进样量，实验条件若有变化是否会影响测定结果？为什么？(4) 在内标工作曲线法中，是否需要应用校正因子，为什么？实验三 载气流速及柱温变化对分离度的影响一、实验目的(1) 进一步理解分离度的概念及其影响因素。
(2) 掌握分离度的计算方法。
(3) 了解实验条件的选择对色谱分析的重要性。
二、实验原理理论塔板数(n )或有效理论塔板数(n 有效)是衡量柱效的重要指标，从理论上，理论板数越多，柱效越高。
但理论塔板数多到什么程度才能满足实际分离的要求，一般很难给出确切的定量指标，然而，分离度(Rs )可以作为色谱柱总分离效能的量化指标，因为它从本质上反映了热力学和动力学两方面的因素。
分离度主要是针对两个相邻色谱峰而言，在混合物中一般指“难分离物质对”的相邻两峰之间的保留时间差别越大，越有利于分离，两峰的峰宽越窄，越有利于分离，因此，按定义，分离度Rs 正比于相邻两峰保留值之差，反比于两峰宽之和的一半：()212112Y Y t t R R R s +-=(1)或 )(2,21211221y y t t R R R s +-= (2) 式中，t R 2，t R 1分别为组分1和2的保留时间；Y 1，Y 2分别为组分1和2峰的基线宽度；y 1/2，y 1/2，2分别为组分1和2的半峰宽。