5-RACE经验
5'race具体方法和实验流程
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5’ Race protocol (standard rxn)
5’ Race protocol 5’ Race流程：5’ Race步骤：一、RNA提取：1.收集细胞：1500rpm常温离心10min收集杂交瘤细胞，细胞状态好，细胞数量为5-10×106。
2.裂解细胞：生理盐水洗涤一次，1500rpm离心10min将废液丢弃，按照5-10×106/ml的细胞加1ml Trizol混匀后，室温静止5min至细胞完全溶解。
3.萃取RNA：将上述液体移至经DEPC处理的Eppendorf管中，按照200µl/ml Trizol加入氯仿，充分振荡15s，室温放置2min。
4.分离水相：12000rpm低温4℃离心15min，吸取水相(上层无色液体)移入另一个DEPC 处理过的Eppendorf管中。
5沉淀RNA：加入等体积的异丙醇(约500µl/mlTrizol)沉淀10min，或-20℃过夜。
6.洗涤残留的异丙醇：将废液吸取丢弃，加入预冷的75%乙醇，洗涤5min。
7.计测浓度：7500rpm低温4℃离心5min，吸出水相，留沉淀晾干(5-10min)，用20-30µl DEPC水重悬，55℃-60℃孵育10min(取出1µl用电泳法粗检是,应有三条目的带)，测紫外分光光度计A260/280(比值在1.8-2.0为正常范围)每管3µg分装-20保存。
二、RNA的去磷酸化：1、去磷酸化酶37℃处理1h：（1）取总量10µg 的总RNA或者250ng的poly(A) RNA，按照下表中配比进行轻混匀。
（3）37℃孵育1小时。
2、终止去磷酸化反应，酚氯仿抽提，氯仿抽提：phenol:chloroform的结果要好。
（2）剧烈振荡30s，最高转速（≥10,000g）室温离心5min。
将水相（上层）转移到一个新管中。
（3）加入150µl的氯仿，剧烈振荡30s，最高转速（≥10,000g）室温离心5min。
5'race 的实验方法
2.2.3.3 5′ RACE 获得5′ 端序列根据已知的中间序列设计特异引物Cu3和Cu4，进行5′RACE PCR。
过程如下：1、cDNA纯化（1）取60μl反转录产物于1.5离心管中，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀。
（2）将（1）所得溶液加入吸附柱中，室温放置2 min，12000 rpm离心1 min，弃滤液。
（3）向将吸附柱中700 μl的漂洗液PW，12000 rpm离心1 min，弃滤液。
（4）向将吸附柱中500 μl的漂洗液PW，12000 rpm离心1 min，弃滤液。
（5）12000 rpm离心2 min，尽量除去漂洗液，将吸附柱开盖置于室温放置数分钟，彻底晾干。
（6）将吸附柱安置于新的1.5 ml的离心管中，向吸附柱膜的中央悬空加入30-50μl 的预热到60 ℃的洗脱缓冲液EB，室温放置2 min。
2000 rpm离心2min收集cDNA溶液。
2、cDNA的末端加尾（1）在1.5 mLEppendorf中配制下列反应液，全量为50 μl：纯化的cDNA 25 μl5×TdT Buffer 10 μl0.1%BSA 5 μl10mM dCTP(终浓度0.5mMd) 2.5 μlTdT 15 UddH2O Up to 50 μl（2）37℃反应10分钟。
（4）加入50 μl（等量）的氯仿/异戊醇（24：1），充分混匀。
（5）离心，取上层移至另一离心管中。
（6）重复步骤（4）。
（7）10000 rpm离心5min，取上层（水层）移至另一离心管中。
（8）加入125 μl（2.5倍量）的冷无水乙醇，-20 ℃放置1 h；10000 rpm，离心20min。
（9）沉淀用70 % 冷乙醇清洗沉淀，10000 rpm离心2min，真空干燥。
（10）加入20 μl ddH2O溶解DNA3、PCR扩增以纯化加尾的cDNA为模板，Cu3和AAP为引物，做第一轮PCR。
反应程序如下：10×LA PCR Buffer 2.5μlMgCl2(25 mM) 2.5μldNTP(各2.5 mM) 4μlAAP(10μM)1μlCu3 (10μM)1μlRT product 2μlLA Taq(5U/μl) 0.25μl灭菌ddH2O 11.75μlTotal Volume 25μl反应程序如下：94°C预变性5 min，然后进行以下循环，94°C变性60 s，56°C 退火60 s，72°C延伸45秒，共进行35个循环。
RACE原理及实验步骤
3'-RACE 基本原理
3’ RACE流程图
先利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作为一个引物结 合位点，以Oligo（dT）30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV 作用下，反转录合成标准第一链cDNA.利用该反转录酶具有 的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5'末端时自动加 上3-5个（dC）残基，退火后（dC）残基与含有SMART寡核苷 酸序列Oliogo（dG）通用接头引物配对后，转换为以SMART 序列为模板继续延伸而连上通用接头。然后用一个含有部分 接头序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为上 游引物，用一个基因特异引物2（GSP 2 genespecific primer，GSP）作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板， 进行PCR循环，把目的基因5'末端的cDNA片段扩增出来。最 终，从2个有相互重叠序列的3'/ 5'-RACE产物中获得全长 cDNA，或者通过分析RACE产物的3'和5'端序列，合成相应引 物扩增出全长cDNA。
Southern blotting：
Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位 的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切 酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链 DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者 紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交， 用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含 量。
• 明显增加BD SMART RACE扩增的特异性 • 降落PCR的退火温度符合首次PCR循环的Tm 高于通用 引物的Tm 。 • 退火温度在随后降低到与通用引物相配合的程度，引起 特异性基因模版的指数和高效率的扩增。 • 当引物的T m>70°C时建议使用降落循环程序。
5race和3race的原理
5race和3race的原理近年来，随着人工智能技术的快速发展，机器学习已成为计算机科学领域的重要研究方向之一。
其中，5race和3race是两种机器学习算法，它们在分类、回归等领域都有着广泛的应用。
本文将从原理、应用等方面进行介绍和分析。
一、5race的原理5race是一种基于决策树的机器学习算法，它通过对数据集进行多轮迭代，构建出一棵包含多个叶子节点的决策树，从而实现对数据的分类和预测。
其主要原理可以概括为以下几点：1. 特征选择在构建决策树的过程中，5race首先需要选择一个最优的特征。
这个过程就是特征选择，一般采用信息增益或信息增益比等方法来进行。
信息增益是指在给定特征的条件下，对目标变量的不确定性减少的程度。
信息增益比则是在信息增益的基础上，对特征本身的固有信息量进行了调整，避免了特征取值数目过多时的偏差。
2. 决策树的构建在选定最优特征后，5race开始构建决策树。
它将数据集按照该特征的取值分成多个子集，每个子集对应一个分支节点。
然后对每个子集递归地进行特征选择和决策树构建，直到达到预设的停止条件，例如叶子节点数目达到一定值或分类准确度达到一定阈值。
3. 决策树的剪枝为了避免决策树的过拟合现象，5race还需要对决策树进行剪枝。
这个过程就是去除一些不必要的分支节点，从而使得决策树更加简洁、准确。
一般采用交叉验证等方法来确定剪枝的效果。
二、3race的原理3race是一种基于神经网络的机器学习算法，它通过多层神经元之间的连接权重和偏置值来学习输入数据的特征，从而实现对数据的分类和预测。
其主要原理可以概括为以下几点：1. 激活函数神经元的激活函数是3race中的核心部分，它可以将神经元的输入转换为输出。
常用的激活函数有sigmoid、ReLU、tanh等。
其中，sigmoid函数可以将输入映射到0~1之间，具有良好的可导性和非线性性；ReLU函数可以将负数部分截断为0，从而加速神经网络的训练；tanh函数则可以将输入映射到-1~1之间，具有比sigmoid函数更强的非线性能力。
5’-race鉴定转录起始位点的原理
5’-race是一种用于鉴定RNA转录起始位点的实验技术，它可以帮助研究者确定基因的启动子区域和转录调控元件，对于理解基因表达调控机制具有重要意义。
本文将介绍5’-race的原理及其在实验中的应用。
一、什么是5’-race？5’-race是Rapid Amplification of cDNA Ends的缩写，翻译为cDNA末端快速扩增。
该技术最早由Frohman等人于1988年提出，并在随后的研究中不断完善和应用。
5’-race主要用于鉴定mRNA的5’端序列，揭示RNA的转录起始位置，并发现新的调控元件。
二、5’-race的原理1. 引物连接：5’-race首先通过连接一个短寡核苷酸引物到RNA的5’端，同时进行逆转录反应以合成cDNA。
这个引物称为内引物。
2. 增大cDNA：在反转录后，通过PCR技术进行cDNA的快速扩增，采用一个外引物和内引物的连接引物结合进行扩增。
3. 清除非特异产物：将PCR产物纯化后，对于其中非特异扩增的产物进行去除，留下特异的5’端cDNA。
4. 提取cDNA：将特异5’端cDNA变性后进行连接进行克隆。
5. 测序：对克隆产物测序，最终得到RNA的转录起始位点。
三、5’-race的应用1. 确定基因启动子区域：通过5’-race技术可以鉴定基因的转录起始位点，从而确定基因的启动子区域，帮助研究者进一步分析基因的转录调控机制。
2. 发现新的转录起始位点：对于未知基因或未知转录本，5’-race可以帮助研究者发现新的转录起始位点，进一步研究其功能及调控机制。
3. 肿瘤基因的研究：在肿瘤基因研究中，通过5’-race技术可以鉴定肿瘤相关基因的启动子区域和转录调控元件，对于肿瘤的发生和发展具有重要意义。
四、5’-race的优势与局限1. 优势：5’-race技术可以在较短的时间内鉴定RNA的转录起始位点，帮助研究者快速了解基因的转录调控机制。
2. 局限：5’-race技术对于RNA的质量和纯度要求较高，同时在设计引物和PCR条件优化上也需要一定的技术经验。
5'race 测序原理
5'race 测序原理5' 端快速扩增的 cDNA末端测序（5' RACE）是一种用于确定RNA序列的实验技术。
该技术通常用于鉴定RNA的5'端，尤其是在未知的转录起始位点（TSS）或者在已知的TSS附近的RNA修饰位点。
下面我将从多个角度全面解释5' RACE 测序的原理。
首先，5' RACE 测序的原理基于逆转录和PCR技术。
首先，RNA通过逆转录酶转录成cDNA，然后使用特定的引物（内引物）与cDNA结合。
内引物通常是一个寡聚核苷酸序列，它会与cDNA的末端结合。
接着，内引物与cDNA结合后，逆转录酶开始合成第一链cDNA。
接着，通过PCR扩增技术，使用内引物和外引物进行扩增，外引物与内引物相结合可以扩增出目标cDNA的片段。
最后，扩增出的片段可以进行测序，从而确定RNA的5'端序列。
其次，5' RACE 测序的原理涉及到特定引物的设计。
内引物的设计需要考虑到其与cDNA末端的特异性结合，以及逆转录酶的合成。
外引物的设计需要考虑到内引物的位置，以确保扩增出目标cDNA的片段。
引物的设计对于5' RACE 测序的成功至关重要。
另外，5' RACE 测序的原理还涉及到PCR扩增技术。
PCR扩增是通过DNA聚合酶酶链反应合成大量特定DNA片段的技术。
在5' RACE 测序中，PCR扩增可以扩增出包含RNA 5'端序列的cDNA片段，从而进行后续的测序分析。
总之，5' RACE 测序的原理基于逆转录和PCR技术，通过特定引物的设计和PCR扩增技术，可以确定RNA的5'端序列，为研究RNA转录起始位点和修饰位点提供了重要的实验手段。
希望这些信息能够帮助你更全面地了解5' RACE 测序的原理。
RACE实战经验(节省新手时间)一、我刚做过5、3RACE,我个人的
RACE实战经验（节省新手时间）一、我刚做过5'、3 ‘ RACE我个人的经验如下：1、首先，提的RNA必须完整，最好跑个RNA电泳来验证一下；2、设计引物时要注意：Tm最好大于70度，两引物间要有100-200bp 的重叠区；Tm最好大于70度的原因如下：a）T m 大于70 度，好做touchdown PCR ；b）相应加长引物，可以更有效地扩增，尤其是针对丰度低、比较难扩的产物。
插曲：为什么要做Touchdown PCR?touchdown PCR是退火温度一步一步降低，指第一阶段PCR时退火温度在每一个循环都降低一定的值如此扩几个循环，然后进入正常PCR。
这样开始的是特异性高的目的片断，到后来目的片断增加后，降低退火温度来提高产量。
非特异带再开始高温扩增少，后面温度降低时，特异带产量已高于非特异产物，最后特异产物再最终产物中占优势。
3、用巢氏PCR相对容易出结果；4、如果出现多个条带，要分别验证；5、PCR过程中，我一般分两次，第一次用touchdowm PCR，后产物稀释50倍，作二次，72度尽量长一点，我们一般用2-3min ；6、结果分析，最好是重叠区吻合，否则，应重新做。
二、花了2, 3个月，我的5 ‘ RACE试验总算成功了，有些心得体会与大家分享。
我用的是Gen eRacer Kit，约5000人民币/kit，可做5次。
本人用过GenRacer, Oligo-capping 等全长cDNA合成方法。
除了作过不同的方法之比较外，也有诸多实战经验。
希望同仁们能对下面两篇敝作予以指正。
特别提醒，在用Gen Racer时，还碰到过一bug, 多次对产物测序结果竟然显示引物内的序列与说明书中不一致，在上海博亚公司重新合成引物后，作对比实验，发现试剂盒中引物bug的真实存在。
各位可要小心。
最初我严格按照说明上的要求，总RNA取其要求的最大量即5ug （非常少，沉淀后几乎看不到），再进行RNA脱磷酸反应，反应后用苯酚：录仿等沉淀rna ;再进行mRNA脱帽反应，反应后用苯酚：录仿等沉淀rna;再用T4 RNA ligase连接脱帽mRNA 至Gen eRacer RNA OLIGO 上，反应后再次用苯酚：录仿等沉淀rna ；最后用superscript III 进行RT 反应，最后用Gen eRacer 5' primier 及我的下游GSP用高保真酶进行PCR。
RACE技术
引物(根据已知序列设计)和PolyT引物PCR即
可。大多实验者反映一次PCR可以搞定。
SMARTTM 3‘-RACE的原理
5'-RACE ：5'-RACE相对较难，目前流行几种5'RACE。其一为加接头(传统)，根据接头引物和自 己设计特异引物PCR，可以设计巢式PCR二次扩 增。另外，有利用反向PCR技术，连接成环在 PCR。还有，GENE公司一种 smartRACEPCR，利 用反转酶末断加C特点,直接加上多G接头，转换模 板而无需用连接酶加接头。利用mRNA的3‘末端的
验证基因特异性引物的对照
利用两个GSPS进行阳性对照：（只有两个 GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。） 为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利 用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对 照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片 段。如果没有这个片段，应该重复cDNA的合 成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行 cDNA的合成。
SMARTTM 3‘-RACE的原理图
SMARTTM 5'-RACE的原理
先利用mRNA的3‘末端的poly（A）尾巴作为 一个引物结合位点，以Oligo（dT）30MN作 为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转 录合成标准第一链cDNA.利用该反转录酶具 有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链 的5’末端时自动加上3-5个（dC）残基，退 火后（dC）残基与含有SMART寡核苷酸序列 Oliogo（dG）通用接头引物配对后，转换为 以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接 头。
反应中涉及到的一些事项
降落PCR可以明显的增加RACE PCR产物的 特异性。在最开始的循环中，退火温度高于 AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的 扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的 温度，可以进行随后的PCR循环。
5'RACE说明
-3-
【使用器具】 尽量使用一次性塑料器材，若用玻璃器材时应在使用前按下列方法进行处理。 （1）用 0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在 37℃下处理 12 小时。 （2）然后在 120℃下高压灭菌 30 分钟以除去残留的 DEPC。 RNA 实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其他实验。
引物序列（5’→ 3’） CATGGCTACATGCTGACAGCCTA CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG AGGTAGGTGATGTTCCGAGAGCGT TTGGAGTCGCCCTCAGCAGAGAT
长度 23 mers 34 mers 24 mers 23 mers
●保存: -20℃
●试剂盒原理
5′-Full RACE 的扩增原理图
-2-
【操作步骤】 1. 使用 Alkaline Phosphatase（Calf intestine）［简称 CIAP］去掉 Total RNA 中裸露的 5′磷酸基团。 2. 使用 Tobacco Acid Pyrophosphatase ［简称 TAP］去掉 mRNA 的 5′帽子结构，保留一个磷酸基
400 μl 100 μl 100 μl
For Control Reactions（5 次量）：
Control HL60 Total RNA（1 μg /μl）*2 5′RACE Control Outer Primer（10 μM）*2 5′RACE Control Inner Primer（10 μM）*2
不能形成复杂结构。 4. 引物 3′端的 3～4 个碱基不要与配对引物形成互补序列。
●试剂盒特点
原理
RNA 模板 基因种类 扩增片段大小 反转录酶 扩增特点
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5 Race(2007-11-18 21:37:08)转载▼分类：核酸技术如果您顺的话，一个礼拜足矣！同意，5'-RACE确实比较难，但也有顺利的时候，我上周做5'-RACE也一次就成功了，我觉得关键还是RNA 的质量，如果RNA模板质量不好，后面做得再认真也是白费！当时要克隆基因的5'GC含量达到了80%，一般的反转录酶和PCR都拿不到，后来加了海藻糖60度反转录一个小时后，用TaKaRa的GC-Buffer和LA-Taq才扩出来，当时就为了这个5端，很是费了力气。
如果RCR产物不是很特异或没有目的条带的话，建议用nest PCR。
在做5‘时，对RNA要求比较高，最好用新鲜的组织提，随即做逆转录，扩增。
做RACE PCR条带单一的不多，尽可能的回收与目的片段大小相近的条带。
克隆的时候，一般kit上建议挑8-10个克隆，多一个，多一份希望，因为RACE，尤其是5’太难了，我作了约6个月。
偶没有买试剂盒，自己合成了3条引物，买了反转录酶。
然后一次就出来了。
RACE的盒子最常用的是CLONTECH和INVITROGEN的，这个方法我也试过很多次了，方法很简单，但是作出来效果非常的不理想。
PCR出来的东西都是杂七杂八的东西，更多的时候是弥散的条带。
SmartRace 既然称之为Smart，因为它的引物能特异的识别5'端帽子位点，因此排除了所有非完全的逆转录。
再加上使用基因特异性引物，使其做出来的可能性更大。
这个方法省钱，但是我不是很看好，祝好运。
另，建议你不要用oligodT进行逆转录，在基因mRNA300bp处设计一条或几条基因特异性逆转录引物更好。
希望你能有好结果。
我刚做过5’、3‘ RACE，我个人的经验如下：1、首先，提的RNA必须完整，最好跑个RNA电泳来验证一下；2、设计引物时要注意：Tm最好大于70度，两引物间要有100-200bp的重叠区；3、用巢氏PCR相对容易出结果；4、如果出现多个条带，要分别验证；5、PCR过程中，我一般分两次，第一次用touchdowm PCR，后产物稀释50倍，作二次，72度尽量长一点，我们一般用2-3min；6、结果分析，最好是重叠区吻合，否则，应重新做。
这里有两个原因：1、Tm大于70度，好做touchdown PCR；2、相应加长引物，可以更有效地扩增，尤其是针对丰度低、比较难扩的产物。
RACE是采用PCR技术由已知的部分cDNA顺序来扩增出完整的cDNA 3 '和5 '端的方法，又被称为单边PCR(one-sided PCR)和锚定PCR(anchored PCR)。
3'-RA CE的—般过程是：以oligo(dT)17和在许多文章中被称为锚引物(anchor primer)或接头(adaptor)的序列组成的引物QT逆转录mRNA得到第一条cDNA链，然后用含部分锚引物序列的引物Q0与基因特异性引物GSP1进行第一轮扩增得到双链cDNA ，第二轮扩增则采用内部引物(nested primer)Ql和GSP2，以防止产生非特异性扩增产物。
采用同样的原理可以进行5'-RACE,先用基因特异性引物GSP-RT逆转录mRNA 获得cDNA第一条链I然后用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和dATP在cDNA 5 '端加上poly(A)尾巴再使用(1)QT引物合成cDNA第二条链；(2)Qo和一个在GSP-RT上游的引物GSP1扩增cDNA,最后采用内部引物Q1和GSP2进行第二轮PCR扩增以提高特异性。
扩增后得到的双链cDNA用限制性内切酶酶切和Southern杂交分析并克隆，得到5'特异性和3’特异性的cDNA文库。
从两个有相互重叠顺序的5'和3' RACE 产物中可以获得全长cDNA，或者可以分析5 '和3 '端顺序，合成相应引物扩增出全长cDNA 。
目前,对于扩增基因的5'端还没有一种完美的技术,RACE 也不例外,特别是5'RACE 对于得到的克隆(经检测后为阳性克隆),通用的做法是挑选10个以上的单克隆送去测序.就我个人经验,也是挑了5个才测到我的目的基因的.建议你用clontech 的smart race试剂盒,我以前用的也是TAKARA的,结果做了N 次都没出来,换试剂盒后一次就做出来了.合成单链CDNA后,用TAQ酶来合成第二条链,也就是相当于双链DNA中的另一条链,用的是上游引物,按照碱基互补的原理,在酶的作用下完成.我刚刚做过RACE，其实当时本来买试剂盒准备建cDNA文库的，但是库建的不好，杂交了好几次都没杂出东西来，后来用它的接头引物和基因特异性引物扩增，最初只设计了特异性引物的巢式引物，最初扩不出东西来，后来把接头引物也设计了内部引物，而且pcr时把模板的量加大，因为可能模板少也很难扩出来，我们都用该方法扩的，都出来了，当然有时有多条带需验证是否单引物扩增产物。
这是我做实验的体会，祝大家早日出结果。
SMARTTM 5‘-RACE的原理是先是利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录引物结合位点，以Oligo(dT)30合成标准第一链cDNA。
利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5‘末端时自动加上3一5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART 寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头(figure 2 )。
然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作为上游引物，用一个基因特异引物2(GSP 2 genespecific primer,GSP)作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5‘末端的cDNA片段扩增出来。
最终，从2个有相互重叠序列的3' / 5‘-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3‘和5‘端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。
我们在实验中发现，要做好RACE反应实验不容易，实际操作中仍存在不少困难。
因此，对RACE反应条件进行反复摸索是实验必须要做地。
这是因为:第一，在5‘-RACE包含了有3个连续的酶反应步骤(反转录、同聚物加尾和PC R扩增)，每一步都可能导致失败;第二，扩增。
DNA末端的特异性完全依赖锚定引物及扩增DNA模板样品不均一性，因而特异性一般很低，常呈现不清晰的成片条带或截短的产物背景。
因此，使用RACE技术扩增得到的特异末端片段，所获得的重组克隆最好能够全部测序，以排除RACE实验结果中扩增产物假阳性和假阴性，最终有可能获得新基因的全序列。
我们相信，第一链，同时利用它的加尾特性在合成的cDNA链3’加上3-4个dCTP，而且当帽子结构存在时该酶的加尾活性最高（对全长分子的富集机制），随后这3-4个碱基与体系中事先加入的引物（该引物的3’端有3-4个dGTP）配对，MMLV 继而以聚合酶活性将配对引物补成双链。
目前基于该技术的试剂盒只有Clontech公司生产，全名为SMART RACE cDNA amplification kit（Cat634914）流程见图：该方法的突出优点就是操作简便，成功率较高，全场分子的比例较高。
cDNA第一链的合成和加尾一步即完成，避免了其他方法中对mRNA和cDNA链的反复操作，降低了mRNA降解和合成产物丢失的风险，使本来就含量甚微的全长分子得到最大保存，所以这种方法得到了广泛认可，应用最多。
如果加上RNA提取时间，这种技术可以在3个小时内得到加上接头的cDNA产物，最大限度地降低了mRNA的降解风险。
2、Oligo capping method方法（又称RLM-RACE）是由日本东京大学铃木等人开发，可以更精确的定位转录起始位点。
我们知道真核生物的mRNA具有一个3’尾巴和一个5’帽子结构，该技术正是利用5’端的帽子特性对全长分子进行富集和扩增。
降解的mRNA5’端都有一个磷酸基，用碱性磷酸酶去掉该磷酸基，随后用烟草酸性焦磷酸酶去掉帽子结构，则全长分子的5’端会暴露出磷酸基，随后的连接步骤中锚定引物将特意的加在全长分子的5’端而不会和降解的分子连接（全长分子的富集机制）。
目前基于该方法的试剂盒有TaKaRa（5’-Full RACE kit D315）和Ambion（Firstchoice RLM-RACE kit AM1700）两家都有生产，步骤如图：该方法的最大优点就是全长分子的比率高，可以说只要是扩增产物就肯定是全长分子。
但是该方法的最大缺点是操作复杂，而且都是针对mRNA分子进行操作，使mRNA分子降解的风险极大提高，所以成功率不是很高。
对于新手和实验室条件较差者不推荐使用该试剂盒。
3、Self-ligation技术。
基因特异性（或者OligodT）反转录合成cDNA第一链，RNase H降解杂合链中的RNA，连接酶连接纯化后的cDNA链，在已知片段上设计反向PCR引物进行未知片段的扩增。
该试剂盒宝生物以前有售，现在已停产，原理如图：该试剂盒想法十分好，但是由于没有全长分子的富集机制，得到全长分子的几率比较低。
而且在实际使用中它的扩增片段都比较短，不能满足实验要求。
4、Anchored PCR方法。
利用一条基因特异性反转录引物，在反转录酶的作用下合成cDNA第一链，将RNA-DNA杂合链中的RNA降解纯化后，利用末端转移酶在cDNA链的3’端加入PolyC尾巴（尾巴长度不能确定），然后利用abridged anchored primer和一条基因特异性引物扩增（可能需要巢式PCR才能得到结果）。
该试剂盒有Clontech（Marathon cDNA amplification, Cat: 634913）和Invitrogen（5’RACE system for rapid amplification of cDNA ends, Cat: 18374-058）公司在售，操作简图如下：该法最大的缺点是全长分子的比率较低，而且操作复杂，整个实验流程需要耗费超过一天的时间。
这种方法没有像SMART和Oligo capping method中那样采取对完整分子的富集机制，所以它依赖于高质量的反转录酶（具有通读复杂二级结构的能力、具有较高的反应温度）和高质量的RNA，否则得到全长分子的几率会很低。
你这个就是利用的invitrogen的5‘RACE试剂盒的原理啊。
自己只需要买TdT 和dCTP就行了，既方便又省钱，我们实验室就是这样做的。
RT产物的纯化只需要用普通的胶回收试剂盒就行了，我们实验室用的是Omega的。