第一章 薄层色谱法

七 应用实例—TLC测定黄曲霉毒素B1
（一）、原理
根据黄曲霉毒素 B1 能在波长 365 毫微米紫外光下产生 蓝紫色荧光的特性， 采取薄层层析法， 将样品经提取、 浓缩、 薄层分离后，利用其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定 其含量。
（四）、操作方法 1.提取
①适用于大米、玉米、麦类、面粉、薯干、豆类、花生、
2.液液分配展开
与液液分配柱色谱分配机理相同，组分在互不相溶的两 液相中的溶解度不同，因此迁移速率存在差异，在迁移过程 中得到分离。 除以上两种展开机制外，还有化学键合相展开和离子交 换展开。
（一）斑点定位
斑点定位必须采用非破坏性方法。当斑点紫外光显示 时，可采用长波长和短波长紫外灯，使用方便、灵活。采用 化学试剂显色时，通过手动或电动喷雾器向展开好的薄层板 喷洒显色试剂。
相两类需在吸附剂中加入
适量粘合剂，其目的是使吸附剂颗粒之间相互粘附并使吸附 剂薄层紧密的附着在载板上。常用的粘合剂可分为无机粘合 剂和有机粘合剂两类。 （4）荧光指示剂 荧光指示剂是便于在薄层色谱图上对
一些基本化合物斑点（无颜色斑点、无特征紫外吸收斑点） 定位的试剂。加入荧光指示剂后，可以使这些化合物斑点在 激发光波照射下显出清晰的荧光，便于检测。
第一章 薄层色谱法（TLC） 一 薄层色谱法概述
薄层色谱法是一种基于混合物组分在固定相和流动相 之间的不均匀分配或保留而将其分离的方法。与 HPLC 不同， TLC 将固定相涂铺在栽板上，使之形成均匀的薄层。被分离 的样品溶液点加在薄层板下沿的位置，再把下沿向下放入盛 有流动相（深度约 5mm）的密闭缸中，进行色谱展开，实现 混合组分分离。被展开的组分斑点即色谱谱带，通过适当技 术对色谱谱带进行处理可得到定性和定量的检测结果。 薄层色谱法具有技术比较简单， 操作容易， 分析速度快， 高分辨能力，结果直观，不需昂贵仪器设备就可以分离较复 杂混合物等特点。
2.分配色谱对所用载体的要求为：
a.表面积大； b.在展开剂中不溶解，与展开剂和样品组成不起化学反 应或分解作用；
薄层色谱－质谱联用定性。
4.苯 5.乙腈 6.甲醇
（三） 定量方法 1.间接定量法
间接定量法就是将 TLC 已分离的物质斑点洗脱下来，再 采用其他方法对该洗脱液进行定量分析。TLC 间接定量的关 键是斑点组分的定量洗脱。选用怎样的洗脱方法，取决于， 组分和薄层吸附剂的性质。用来洗脱组分斑点的溶剂，对下 一步定量方法应无影响。 a. 分光光度法 将下来的洗脱液配制成标准体积， 再
7.无水乙醚：如不是无水乙醚，则应脱水后再用。 8.丙酮 9.无水硫酸钠 10.硅胶 G：薄层层析用 11.苯乙腈混合液：取苯 98 毫升，乙腈 2 毫升，混匀冰 箱存放备用。 12.三氟醋酸 13.黄曲霉毒素消毒剂：5％次氯酸钠溶液，取 100 克漂 粉精，加入 500 毫升水，搅匀，另溶解 70 克碳酸钠（Na2Co3、 H2O） 于 500 毫升温水中， 溶后， 倒入上述溶液中搅匀、 澄清、 过滤、备用。 14.黄曲霉毒素标准溶液 ①标准储备液（1.02 微克/毫升） ：GBW(E)090015 严格 控制、应加锁于冰箱中避光存放。 （每次记录用量、余量， 以备复查） 。 ②稀释液Ⅰ（0.2 微克/毫升） 取储备液加苯乙腈混合液 稀释。 ③稀释液Ⅱ（0.04 微克/毫升）取稀释液 1 毫升以苯乙 以半透明纸扫下 TLC 图上的斑 腈混合液稀释。
同样条件下对样品和 标准液进行吸光值测量。 b. HPLC 法 定量 c. GC 法 以 TLC 法斑点洗脱液直接作 GC 分离和定量。 d. 质谱法 采用组分质谱图中的特征离子峰可进行定 量。 以 TLC 法斑点洗脱液直接作 HPLC 分离和
2.直接定量法
a. 斑点面积测量法 点界限，然后测量其面 积。将斑点面积同平行操作的标准样面积相比较进行定量。 b. 目测法 将被测样品和系列溶液点在同一薄层板
（二）、试剂
1.石油醚：沸程 2.正已烷 3.氯仿 30－60℃
花生酱等。称取经过粉碎（20 目筛）的样品 20 克于 250 毫 升具塞三角烧瓶中，加正已烷 30 毫升，甲醇水（55∶45） 100 毫升，加塞后加水少许，盖严防漏，振荡 30 分钟，静置
片刻，以脱脂棉过滤于分液漏斗中，待分层，放出下层的甲 醇水溶液 20 毫升（相当于样品 4 克）于另一分漏斗中，加 氯仿 20 毫升，振摇二分钟，静止分层。另备一漏斗底部铺 脱脂棉少许，再加无水硫酸钠 10 克，下接 60 毫升蒸发皿， 漏斗中的无水硫酸钠先用氯仿湿润。将分层后的氯仿放入已 备好的具有无水硫酸钠的漏斗中，过滤，再加 5 毫升氯仿于 分液漏斗中，分层后一并滤于同一蒸发皿中，最后用少量氯 仿洗涤滤器，洗液并入以上蒸发皿中。将蒸发皿放入通风橱 内于 65℃水浴上通风挥干， 然后放在水浴上冷却 2－3 分钟， 准确加入苯乙腈 1 毫升。用带橡皮头的滴管的尖端将残渣充 分混合，若有结晶析出（苯） ，将蒸发皿从水浴上取下，继 续溶解，混合，晶体消失，再用此管吸取上清液，转移于 2 毫升样液瓶中， 若溶液不够澄清， 应离心， 或放置等候澄清， 取上清液供薄层点板用。 ［注］加入氯仿振摇 2 分钟如出现乳化现象，可滴加甲 醇促使分层或用电吹风机吹热风促使分层。 含油脂较多的样品如花生等也可采用脱油提取，即称取 粉碎样品 20 克移于滤纸筒内，筒内塞以少量脱脂棉，置于 250 毫升脂肪提取器内，在 75－85℃水浴上以石油醚提取脱 油 8 小时，然后将滤纸筒挥干。将脱油后的样品移于 250 毫 升具塞三角烧瓶内，进行检验。 如样品是玉米、大米、小麦时亦可采用下法提取：称取 粉碎过筛样品 20 克于 250 毫升具塞三角烧瓶内，用滴管滴 加 6 毫升水，使样品湿润，并准确加入氯仿 60 毫升，振荡 30 分，加无水硫酸钠 12 克，振摇静止 30 分；以脱脂棉过滤 取滤液 12 毫升（相当于样品 4 克）于蒸发皿，以下步骤与 ①同。 ②适用于花生油、香油、芽籽油等。 称取样品 4 克于小烧杯中， 用正已烷 20 毫升转移于 125 毫升分液漏斗中，再用甲醇水（55+45）20 毫升分数次洗涤 小烧杯，洗液一并移入分液漏斗中，振摇 2 分钟，静止分层 后，将下层甲醇水溶液移于第二个分液漏斗中，原分液漏斗 中再加甲醇水 5 毫升，振荡提取一次，甲醇水溶液一并移入 第二个分液漏斗中，在第二个分液漏斗中加入氯仿 20 毫升， 振摇二分静止分层以后按①操作。 ③适用于酱油、醋，方法有二： 第一法：称取样品 10 克于小烧杯中，为防止提取时乳 化，加氯化钠 4 克，移于分液漏斗中，烧杯用氯仿 15 毫升 分次洗涤，洗液一并移于分液漏斗中，以下自振摇 2 分钟， 静止分层后按第①操作。最后加入 2.5 毫升苯乙腈溶解，此 液每毫升相当于样品 4 克。
五
薄层色谱扫描仪
（一）仪器结构
TLC 扫描仪结构主要包括光学元件组合系统、电子元件 组合系统及机械元件组合系统。
（二）主要功能
薄层色谱扫描仪主要用于 TLC 图被分离斑点和薄层空 白的光学相应信号测 量。要求仪器光源稳定，光波单色性能好，光波长在（200～ 800nm）检测器灵敏度高。
六
薄层色谱定性定量方法
（三）、仪器
1.小型粉碎机 3.电动振荡器 2.分样筛一套 4.电吹风机
上，展开后用适当方法 显色，可以得到系列斑点，将被测样品的斑点面积大小和颜 色与标准系列的斑点相比较，可推测出样品的含量范围。这 种定量法非常适用于对常规大量样品的重复分析。
5.薄层板涂布器（可以自制）6.玻璃板：5×20 厘米 7.展开槽： （层析）内长 25 厘米，宽 6 厘米，高 4 厘米 8.1－10 毫升刻度吸管 9.紫外光灯：365nm，220v，125w，启动电流 1.8A 10.微量进样器：20 微升，10 微升 11.分液漏斗：125 毫升 12.蒸发器：60 毫升 13.玻璃漏斗 14.样液瓶：具塞 2 毫升 15.脱脂棉：在索氏脂肪提取器以氯仿提取 2 小时挥干 备用 16.电热恒温水浴
四 薄层色谱吸附剂与载体的选择
1.薄层色谱对吸附剂的要求为：
1.具有大的表面积与足够的吸附能力； 2.对不同的组分有不同的吸附性，因而能较好的分离不 同的化学组分； 3.在所用的溶剂和展开剂中不溶解； 4.不与试样中各组分、溶剂和展开剂起化学反应或破 坏、分解作用 5.颗粒均匀、在使用过程中不会碎裂 6.具有可逆的吸附性，既能吸附样品组分，又易于解 吸； 7.为便于观察分离结果，最好是白色固体。
（四）展开
TLC 展开就是流动相沿薄层（固定相）运动，以实现样 品混合组分分离的过程。这一过程需在具有一定形状的展开 室中进行。薄层展开有三种形式，直线式展开方式为实际应 用中使用最普遍的展开方式。
学惰性好（对溶剂、显色剂等） 、耐一定温度、表面平整、 厚度均匀、价格适宜。 （2）固定相 TLC 固定相包括改性固定相和未改性固定
（二）定性方法 1.利用保留值定性
在特定的色谱系统中，化合物的 Rf 值一定，比较未知物 和标准物的 Rf 值，能够作为鉴定未知物的依据。Rf 值的准确 测定受多方面因素影响，为了增加 Rf 值定性的可靠性，必须 通过改变色谱系统的选择性，重复测定同一化合物的 Rf 值。 如果在分离机理不同的色谱体系中， 比较 Rf 值仍能得到肯定 的结果，那么其可靠性将更大。
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二 薄层色谱法中的薄层板、薄层板的涂铺、点样和 展开 （一）薄层板
TLC 分离的选择性主要取决于固定相的化学组成及其表 面的化学性质。可通过改变涂层材料的化学组成或对材料表 面进行化学改性来实现改变薄层色谱分离的选择性。此外， 固定相的物理性质，如比表面积、比空容、平均孔径等也对 其色谱行为产生影响。 （1）载体 对 TLC 载体的基本要求为：机械强度好、化
涂板方法可以分为涂布法、倾注法、喷洒法及浸渍法四 类，其中涂布法是应用最广泛的涂板方法。 TLC 固定相薄层涂铺大多采用湿法匀浆， 要求薄层均匀、 平整、无气泡、不易造成凹坑和龟裂。 薄层板活化处理可以获得适宜活性，提高色谱分离效率 和选择性。