4第四章 目的基因的制备2
《生物技术制药》课程笔记
《生物技术制药》课程笔记第一章：绪论一、生物技术的发展史1.1 生物技术概述生物技术是指人们利用微生物、动植物体对物质、能量、信息进行操纵的技术。
它广泛应用于食品、农业、环境保护、能源、医药等领域。
1.2 生物技术的发展简史生物技术的发展可以分为三个阶段：（1）传统生物技术阶段：早在公元前22世纪，中国就开始了酿酒、制酱、制醋等传统生物技术应用。
此后，世界各国也逐渐发展了各自的发酵技术。
（2）现代生物技术阶段：20世纪初，科学家们开始研究酶和微生物，发现了遗传物质DNA和RNA，并逐步揭示了生物体的遗传密码。
这一阶段的代表性成果包括抗生素的发现、遗传工程的创立以及生物制品的生产。
（3）生物技术革命阶段：20世纪70年代末，基因工程技术的发展使生物技术进入了一个新的时代。
基因克隆、基因编辑、基因组学等技术的突破，为生物技术在医药、农业、能源等领域的应用开辟了广阔前景。
二、生物技术药物1.2.1 生物技术药物概述生物技术药物是指利用生物技术方法生产的药物，主要包括蛋白质药物、抗体、疫苗、寡核苷酸药物等。
1.2.2 生物技术药物的特性生物技术药物具有以下特点：（1）高特异性：生物技术药物针对性强，能够精确作用于疾病相关分子。
（2）低毒性：生物技术药物通常来源于自然界中的生物体，毒副作用较低。
（3）复杂性：生物技术药物的结构复杂，生产过程需要严格控制条件。
（4）生产成本高：生物技术药物的生产设备、工艺和原材料成本较高。
三、生物技术制药1.3.1 生物技术制药概述生物技术制药是指利用生物技术方法生产药物的过程。
它主要包括基因工程、细胞培养、蛋白质工程等技术。
1.3.2 生物技术制药特征生物技术制药具有以下特征：（1）生产过程高度自动化、精确化。
（2）药物作用机制明确，针对性强。
（3）生产周期较长，生产成本较高。
（4）药物质量和安全性要求严格。
1.3.3 生物技术在制药中的应用生物技术在制药领域的应用主要包括：（1）生产生物技术药物，如蛋白质药物、抗体、疫苗等。
第四章 目的基因的制取
第四章目的基因的制取内容提要•目的基因的制取策略•鸟枪法制取目的基因•物理化学法分离目的基因•化学合成基因•反转录合成DNA第一节目的基因制取的策略一、外源基因与目的基因基因工程主要是通过人工方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而进行遗传研究或是获得表达产物。
通常我们把插入载体的DNA片段称为“外源基因”；将那些已被或准备要被分离、改造、扩增或表达的DNA片段称为“目的基因”。
原核细胞含有上千个基因，真核细胞基因组内的基因数目更是庞大。
目的基因一般都很小，都仅由几千或几百甚至更少的碱基对组成（人生长激素释放抑制因子的基因仅有42bp）。
要想获得某个特定的目的基因，必须对其性质、结构有所了解，根据其特点来制定分离方案。
二、目的基因制取的策略目的基因制取的策略可分为直接制取和间接制取。
一般来说，大部分低等生物基因组的碱基序列已测定，可以直接制取目的基因（确切定位）。
对于高等哺乳动物来说，目的基因在DNA上无法定位，只能间接制取。
获取目的基因的方法：1、直接制取法：以机械的方法或是限制性内切酶对总DNA进行切割，再直接分离特点位点的DNA分子。
2、逆转录法（互补cDNA法）：以RNA为模板，逆转录合成cDNA。
缺点是cDNA中不含天然基因的内含子。
3、PCR扩增法：对于含极微量mRNA的细胞大多采用PCR扩增，再进行目的基因的制取。
4、鸟枪法（散弹法）：可快速和高纯度地从单拷贝或多拷贝基因中筛选获得天然的目的基因。
5、人工化学合成法。
6、其它方法：mRNA差异显示法、限制性片段长度多态性探针技术等。
目前，真核基因，利用DNA合成仪合成目的基因的成本较高；利用cDNA文库获得目的基因需大量前期工作；直接以生物细胞染色体DNA为模板可获得目的基因，但模板的扩增会产生非特异性产物；一般通过构建完整的基因文库，再从文库中“钓取”出目的基因。
第二节鸟枪法制取目的基因一、“鸟枪法”的概念“鸟枪法”是指将基因组按染色体分开后，将它全部打乱，切成碎片，进行随机测序，测序后再将它们拼接起来的方法。
赣南师范大学2024年研究生招生考试大纲 《基因工程》考试大纲
《基因工程》考试大纲及参考书一、课程性质与考试基本要求基因工程是建立在分子生物学和遗传学基础之上的一门核心技术，它的显著特点是能够跨越生物种属之间不可逾越的鸿沟，打破常规育种难以突破的物种界限，开辟在短时间内改造生物遗传特性的新领域。
《基因工程》是介绍在分子水平上对基因进行操作的一门学科。
通过本课程的学习和考试，使学生能系统的掌握基因工程的基本理论、基本知识和基本操作技能，培养学生创新思维、实践能力和科学素养，并且能够运用本学科的基本理论和技能，解释实践中的一些实际问题。
二、考试方法闭卷考试总分：100分考试时间：2小时三、试题类型名词解释、简答题、论述题四、参考书：袁婺洲主编，《基因工程》，第二版，化学工业出版社五、课程考试内容及要求第一章基因工程概述1、基因工程的概念2、基因工程的基本流程第二章基因工程工具酶1、限制性核酸内切酶的特征2、影响限制性核酸内切酶酶切反应的因素3、限制性核酸内切酶酶切位点的引入与消失4、DNA连接酶、DNA聚合酶类、碱性磷酸酶、Cas核酸内切酶第三章基因工程载体1、克隆载体2、表达载体第四章目的基因的获取与制备1、从基因文库获取目的基因2、PCR 获取与扩增目的基因第五章目的基因导入受体细胞的方法1、把目的基因导入大肠杆菌2、把目的基因导入动物细胞第六章阳性转化自的鉴定1、遗传表型检测法2、酶切电泳检测3、PCR 扩增鉴定筛选4、DNA序列测定第七章基因工程在基因功能研究中的应用1、基因的表达谱研究技术2、基因的突变研究技术3、基因敲除技术4、基因编辑技术5、基因敲减技术6、基因过表达与异位表达技术7、基因的相互作用研究技术第八章转基因动物1、动物转基因技术2、转基因动物的筛选与检测3、转基因动物的现状与应用。
辽工大基因工程复习题
基因工程复习题第一章1，基本概念：移动基因：（又叫跳跃基因或转座子）是染色体DNA上可复制和位移的一段DNA序列。
断裂基因：编码序列不连续的间断基因。
重叠基因：同一段DNA片段能够编码两种甚至多种蛋白质分子。
假基因：核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋白质的失活基因。
重复序列：基因序列的多拷贝。
基因家族：由功能相关的基因成套组合形成。
哪些是真很和生物所特有的基因：断裂基因、假基因、重复序列。
基因工程（重组体DNA技术）：指用生物化学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体结合成一个复制子，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内，二能持续稳定的繁殖和行使正常功能，从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。
*3、基因工程的基本过程（步骤）。
切—接—转—增—检P16①目的基因制取②基因载体的选择与构建③目的基因与载体DNA的拼接④重组体分子导入受体细胞⑤外源基因的表达和产物的分离纯化第二章*寄主细胞控制的限制与修饰P20①宿主控制限制---核酸限制性内切酶②宿主控制修饰---修饰的甲基转移酶以λ(k) 噬菌体侵染E.coli B菌株为例解释寄主控制与修饰的现象。
λ(k)感染B菌株↙↘大量的噬菌体少量的在被限制前发生甲基化DNA被限制↓传代甲基化链迅速增多↓限制被阻止↓少量具有B菌株修饰的λ(B)群体两种酶的作用：R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的一种是修饰的甲基转移酶——修饰一种是核酸内切限制酶——限制*2、核酸内切酶Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型酶的基本特性P22内切酶Ⅰ型①有内切酶活性和甲基化酶活性——互斥②需要ATP、SAM和Mg 2+辅助因子③EcoB和EcoK是由三种不同亚基组成④有特定的识别位点⑤切割方式：切割的核苷酸顺序无专一性内切酶Ⅱ型①有内切酶活性和甲基化酶活性——分开反应②能识别专一的核苷酸序列，并在固定位置上切割③识别序列的核苷酸对顺序呈回文结构④切割可形成两种核苷酸切割末端————粘性末端和平末端内切酶Ⅲ型①由两个亚基组成的蛋白质复合物，即同时具有内切酶活性和甲基化酶活性②需Mg 2+、ATP、SAM辅助因子③可识别特定碱基顺序，且它的切割位点也是没有特异性的3、基本概念：粘性末端：指DNA分子在限制酶作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，能通过互补碱基间配对而重新环化起来。
第四章 目的基因的获得-PCR
5’ ATCTTGAAC
模板
Taq
TGCATGCAT 3’ ACGTACGTA 5’
5’ ATCTTGAAC 3’ TAGAACTTG
Taq
模板
ACGTACGTA 5’
4. 1个循环的结果
5. 新一轮循环开始 变性—复性—延伸。
DNA elongation
理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。
（2）合成过程
下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的 二核苷酸聚合。
2. 亚磷酸三酯法 原理
将所要合成的寡聚核苷酸链的3′-末端先以3′-OH
与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（CPG）连接， 然后依次从3′-5′的方向将核苷酸单体加上去，所使 用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，具 体的合成和延伸过程如图。
人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所 要扩增的模板DNA双链的5‘端相同。
模板
5’ ATCTTGAAC 引物
5’ ATCTTGAAC 3’ 3’ TAGAACTTG
TGCATGCAT 3’ 3’ ACGTACGTA 5’
引物
模板
ACGTACGTA 5’
3. DNA链的延伸
72 oC
DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链
(d)
3’
3’ 5’ 引物1 3’ 引物1互补链 5’
新引物
3’ 5’
5’ 3’
(e)
不同长度的链
单位长度的链
(f)
引物2互补链
5’ 3’
3’ 5’
引物1互补链
(g)
目的片段（不同长度的链未示出）
聚合酶链式反应示意图
（四）PCR的特点
4第四章 目的基因的制备1
（3）双抗体免疫法分离编码蛋白的基因
原理：抗原、抗体结合 适用范围：适于分离某一真核蛋白质已被分离纯 化，且足以产生特定抗体的基因。
（4）酶促反转录法直接从特定mRNA分离基因 适用范围：主要用于合成分子质量较大，转录产物 mRNA易分离的目的基因。 原理：分离出目的基因的mRNA,再经RT－PCR合 成cDNA
克隆目的基因的基本战略
随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通
过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目
的基因的目的重组子，进而获得目的基因。
鸟枪法步骤
1.使用限制性内切酶将带 有目的基因的DNA链切成若
干小段。
2.再使用DNA连接酶将其整 合到质粒载体的基因中,并 转化受体细胞使其表达。 3.如果在某个细胞中得到
GGA CCTAG
Sal3AI的酶切末端 dATP、dGTP
利用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段将酶 切末端稍短的突出段部分补平，可有效防止 DNA片段自身连接成原基因组的结构，及载 体臂的自身连接，使噬菌体双臂仅能与单个 基因组DNA片段连接。
G
Xho I识别位点图4-4 不经分级 分离的构建例如，已知某目的基因位
于20kb的Sal3AI片段中，
将染色体DNA用Sal3AI切开
，琼脂糖凝胶电泳分离，
用刀片切下相当于18 - 22 kb大小区域内的凝胶块，
22 kb 18 kb
20 kb
从此凝胶块中回收DNA片段
，然后与载体进行拼接
Klenow片段
GATCC G
G CCTAG
GATCC AGG
用精密的密度梯度超速离心技术）
单链酶解法（富含GC的片段Tm高） 分子杂密度梯度离心法
基因工程第四章目的基因的分离和合成
基因的分离方法
电泳分离
利用电场的作用，通过基因的大小和电荷差 异来分离目的基因。
过滤膜分离
利用过滤膜的孔隙大小，将目的基因与其他 分子分离。
基因的合成方法
1
Байду номын сангаас
基因合成的步骤
2
包括设计基因序列、合成基因、验证
基因等步骤。
3
基因合成的原理
利用化学合成的方法合成目的基因的 DNA序列。
基因合成的应用
用于基因工程研究、生物医药和农业 领域，推动科学发展。
实验步骤
1. 收集目的基因样本 2. 提取目的基因DNA 3. 分离目的基因 4. 合成目的基因 5. 验证合成的目的基因 6. 分析实验结果
结果与讨论
实验结果表明电泳分离和过滤膜分离是有效的基因分离方法，基因合成技术 可用于合成目的基因。讨论了实验过程中的优缺点和改进方法。
结论和展望
基因工程中的目的基因的分离和合成方法有重要的应用价值，未来可以进一 步优化分离和合成技术，提高实验效率和基因合成的准确性。
基因工程第四章目的基因 的分离和合成
本章介绍了基因工程中的目的基因的分离和合成方法，包括电泳分离和过滤 膜分离，以及基因合成的原理、步骤和应用。
实验目的
1 了解基因工程的目的基因
明确在基因工程中需要分离和合成的目的基因。
2 掌握基因的分离和合成方法
学习电泳分离、过滤膜分离和基因合成的原理和步骤。
3 了解基因合成的应用
《目的基因的制备》课件
表达
让目的基因在目标生物体 中得到表达，产生所需的 蛋白质或产物。
常用的制备方法
1
PCR法
通过聚合酶链式反应扩增目的基因，需设计引物与模板DNA配对。
2
连接法
通过连接酶催化，将目的基因与载体DNA连接，形成重组DNA。
3
重组法
利用重组酶切割DNA，然后将目的基因嵌入到载体DNA中。
PCR法的制备步骤
重组法的制备步骤
1. 将目的基因和载体DNA以及重组酶一起反应。 2. 重组酶切割DNA，使目的基因与载体DNA形成黏性末端。 3. 将目的基因嵌入载体DNA中，即形成重组DNA。 4. 将重组DNA转化入宿主细胞，进行表达。 5. 检测表达产物的功能和纯度。
目的基因的应用
科学研究
目的基因的制备使得科学家可 以深入研究细胞、生物体和人 类基因等重要领域。
1. 设计引物，使其与目的基因的序列互补。 2. 提取模板DNA。 3. 设置PCR反应体系，包括引物、酶、酶缓冲液等。 4. 进行PCR扩增，包括变性、退火、延伸等步骤。 5. 检测PCR产物的纯度和大小。
连接法的制备步骤
1. 准备目的基因、载体DNA和连接酶。 2. 将目的基因与载体DNA进行切割，暴露黏性末端。 3. 用连接酶将目的基因与载体DNA连接。 4. 转化连接产物入宿主细胞，形成重组DNA。 5. 筛选含有目的基因的克隆，进一步分析。
医学研究
目的基因的制备有助于研究疾 病发生机制、疾病基因与药物 治疗的关系，推进医学进步。
农业应用
通过改良作物品种，提高产量 和抗病能力，目的基因的制备 对农业发展具有重要意义。
常见问题及解决方法
1 降低质量
使用高质量的试剂和操作规范可以减少目的基因制备过程中的质量问题。
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mRNA 为模板合成 方法常用的有两 种：一种如左图 ；另一种随机引 物引导合成法。
随机引物引导的cDNA合成法：
根据可能序列合成出6-10个随机碱基的寡核苷 酸片段，这种混合物可与mRNA模板在多位点同时杂
交，且可作为合成第一链的引物。
这种方法可从mRNA模板的多位点同时合成cDNA， 能包含模板的完整信息，故适于较长的mRNA分子克 隆。
反向PCR
思考题
1. 什么叫目的基因？ 2. 以EST法为例说明分离目的基因的过程优缺点？ 4. 如何构建载体表达1000kb的目度如λgt11) 。插入片段
可表达融合蛋白，有活性、抗原性。常采用能与表
达产物发生特异性结合的抗体或化合物进行标记筛
选。特别适用于氨基酸序列不清楚的蛋白质的筛选 。
非表达型：可用一般载体(如λgt10)
，适用于已知
氨基酸顺序或其同源序列蛋白质，根NA片段的出现概率 f：某mRNA 的丰度 / 总mRNA数的比值
N=ln( 1-P ) / ln( 1-f ) 根据经验公式,提高目的基因mRNA在和提高目的
第四章 目的基因的制备
第二节困难，但在某一 特定发育期和特定组织仅得以表达的基因仅占总基 因数的15%，产生mRNA,因此从mRNA出发分离目 的基因，大大降低难度。 某生物基因组转录的全部或部分mRNA经反转 录产生的各种cDNA片段，分别与载体重组而存在 合成的双链DNA重组入载体，导入宿主(大肠杆 菌)增殖
（3）mRNA的丰度与cDNA基因大小的关系要获得高丰度的某mRNA, 必细胞总mRNA数/细胞中某种mRNA的拷贝数 实际需构建的最小值远超过公式理论值
经验公式：
N=ln( 1-P ) / ln(性：
①某些RNA病毒分离的唯一方法;
②筛选简单易行；
③假阳性概率降低;
④直接用于基因工程操作; ⑤研究真核细胞mRNA的结构和功能.
局限性: ①所含遗传信息远小于基因组,受细胞来 源或发育时期的影响; ②不能直接获取基因内含子和编码区外的调 控序列的结构与功能信息; ③高丰度mRNA的cDNA比例较高,分离较易,而
五、基因的化学合成（p204） （1）基因化学合成的概况
1979年首次化学合成有活性的大肠杆菌酪氨酸
转移核糖核酸基因.现用DNA合成仪快速合成寡核苷
酸片段,再用酶化学法获得目的基因DNA片段.
（2）基因的组装方式
150～200bp以内可化学合成。要获得较大的高
等真核基因必须设计一种特殊方法,能把合成的DNA
片段构建成完整的基因的过程，称为基因组装。
20世纪70年代提出,常用的有两种:
全片段酶促连接法: 酶促填充法:
基因化学合成法的局限性：
主要适用于一些分子较小的基因的合成；
只有在基因的全序列或其表达产物现
的可能。
Messenger RNA with Poly(A) Tail (AAAA)
S1核酸酶
双链cDNA
优点： ① 适合于研究不同 时期或不同发育 阶段基因表达的 变化；
② 不用纯化mRNA， 可用总RNA作为合 成cDNA第一条链 的模板，避免分 子丢失；
③ 在cDNA第一条链3’ 端同聚物加尾， 不会丢失末端核 苷酸。
碱性磷酸酯酶——mRNA5’端变成羟基 核酸酶——除去mRNA5’帽子结构
低丰度的比例较低,较难.
四、利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因
若已知目的基因的全序列或 其两侧序列，可通过合成一对与 （1）套式PCR 模板DNA互补的引物，十分有 （2）反向PCR 效地扩增出所需的DNA片段。 （3）不对称PCR 要求待扩增的DNA片段的序 （4）锚定PCR 列已知或至少其两端20bp左右 （5）长程PCR 序列已知。 利用常规PCR只能合成1kb以 （6）反转录PCR 内长度的DNA片段 特殊类型PCR可满足多种需 要。 （7）锅柄PCR （8）Alu PCR
Buffer wash to release bound mRNA
Ribosomal RNA Lacking Poly (A)
Poly(A) RNA blinds to thymine nucleotides Other RNAs and cellular components flow through column
子，人工合成寡含克隆数少，适于高丰度分离纯化出mRNA （含oligo（dT）的纤维素柱） 以mRNA 为模板，合成cDNA 第一链 双链cDNA 的合成 常用方法:第一 第二 第三 第四 第五
EcoRI酶切位点衔接头 + GGA
→ DNA-RNA嵌合引物
亲生物素 包裹的磁 性颗粒
人工合成完整基 因的所有寡核片 段,相邻的有4～ 6bp重叠互补,适 当条件复性形成 带粘末段的双链.
T4 DNA连接 酶酶促形成 磷酸二酯键.
只合成完整基 因的一些片段, 相邻3’的短序 列互补,适当 条件复性形成 模板(引物复 合体).Klenow 片段将四种 dNTP填补互补 链之间的单链 区, T4 DNA连 接酶连接,限 制性酶切割后 重组入载体.