蝙蝠蛾拟青霉与冬虫夏草关系的分子系统学研究
冬虫夏草菌室内侵染蝙蝠蛾幼虫的代谢分析
冬虫夏草菌室内侵染蝙蝠蛾幼虫的代谢分析作者：韩晓然来源：《乡村科技》2020年第06期[摘要] 冬虫夏草是我国传统中药中的一种濒危物种。
关于冬虫夏草及其无性型中国被毛孢的代谢已有很多研究报道，然而对于蝙蝠蛾幼虫人工接种中国被毛孢后的代谢变化却鲜有报道。
本研究通过高分辨液质联用分析可准确判定人工培养物与天然冬虫夏草的成分差异，从而找出与天然冬虫夏草成分一致的培养物或僵虫，同时避免有害杂菌感染的样品用于替代天然冬虫夏草，从而扩大虫草药材的来源或找到更多、更安全的替代品，创造较大的经济效益，同时有利于保护野生虫草资源和生态环境。
[关键词] 冬虫夏草;中国被毛孢;子囊孢子;代谢组学;质谱全解析[中图分类号] S567.35 [文献标识码] B [文章编号]1674-7909（2020）06--21 材料和方法1.1 材料3龄虫草蝙蝠蛾幼虫，采自四川省德阳县虫草基地，室内短期人工饲养。
采自青海玉树的天然冬虫夏草经人工诱导得到具有侵染能力的冬虫夏草子囊孢子。
1.2 方法1.2.1 接种培养本研究以子囊孢子悬液为接种體，每个处理20只蝙蝠蛾幼虫。
考虑到蝙蝠蛾幼虫几天就蜕皮一次，而蜕皮可能对侵染不利，故本试验选择在进行浸蘸接种之后进一步采取穿刺接种法并同时将菌液混入幼虫食物中，从而增加侵染成功率。
1.2.2 接种后处理接种后将幼虫放入事先编号的已灭菌的培养皿中，仅饲喂少量珠芽蓼，置于恒温培养箱中，于16 ℃、避光条件下培养。
2 d后继续给予珠芽蓼并注意补充无菌水以保湿培养，5 d后转入土壤中继续饲养。
每隔4 d检查统计幼虫死亡情况并加入少量珠芽蓼。
珠芽蓼均要求进行紫外线照射灭菌消毒。
将侵染所得的死亡僵虫在显微镜下进行镜检观察后，置于冻干机中冷冻干燥后充入氩气保护，并放入-20 ℃冰箱中保存备用。
1.2.3 代谢组分析1.2.3.1 样品的制备。
将侵染所得的僵虫、野外采集的野生僵虫、天然冬虫夏草以及人工培养的中国被毛孢菌丝体同时进行冷冻干燥，之后分别将其置于研钵中磨碎备用;在进行代谢组分析之前准确称取磨碎后的样品各15 mg，加入1 mL甲醇提取液和Fmoc-glycine（1 mg/mL）30 μL作为内标，涡旋30 s，25 ℃超声提取1 h后于4 ℃冰箱中静置12 h。
冬虫夏草与蝙蝠蛾拟青霉
冬虫夏草与蝙蝠蛾拟青霉一、什么是冬虫夏草：冬虫夏草是由冬虫夏草菌寄生鳞翅目蝙蝠蛾科，蝠蛾属昆虫的幼虫所形成的菌虫复合体。
在《本草纲目拾遗》中首先记载为夏草冬虫，冬是虫，夏是草，后称为冬虫夏草。
冬虫夏草菌侵入虫体后以蝙蝠蛾幼虫为营养，在虫体内繁殖、生长。
冬季菌丝充满虫体，幼虫体内营养消耗完后即死亡、僵硬，外观还是虫，即称之为冬虫；来年春末夏初，从僵虫头部长出子座，即称之为夏草，虫体加子座称为“冬虫夏草”。
冬虫夏草是一种稀有珍贵的中药材，是我国的瑰宝，具有重要的食用和药用价值。
它的稀有珍贵之处在于：1.生长环境特殊：仅生长在青藏高原3000-5000米的高原草甸、山地草甸和高山草甸高寒植被中，即西藏、青海、四川、云南和甘肃五省。
2.寄主专一：仅寄生鳞翅目、蝙蝠蛾科、蝠蛾属昆虫的幼虫。
3.生长周期长：蝙蝠蛾的生长周期一般是3年，在4500-5000米高山生长周期长达4-5年，幼虫被侵染至形成冬虫夏草又需要1年，因此，冬虫夏草的生长期需4-6年。
4.独有的医疗、保健作用:性温，味甘，具有益肝肾，补精髓，止血、化痰等功效，研究发现还具有双向免疫调节功能。
二、冬虫夏草所含化合物：1.核苷类：腺苷、尿苷等。
2.甾醇类：麦角甾醇、胆甾醇等。
3.氨基酸：含18种人体必需的氨基酸。
4.肽类：从发酵菌丝提取物中分离到环肽类。
5.甘露醇。
6.多糖。
7.有机酸：软脂酸、硬脂酸、油酸、亚油酸等。
8.有机元素：钙、镁、铁、铜、锌、锰、硫、磷、硒等。
9.维生素类：冬虫夏草含B1、B2、B12、C，不含A、E及β-胡萝卜素，发酵菌丝含B1、B2、B12、E和K。
10.蛋白质及多胺类物质：1，3-二氨基丙烷、腐胺、尸胺、类精胺等。
三、冬虫夏草与蝙蝠蛾拟青霉的关系:蝙蝠蛾拟青霉是从冬虫夏草子座和僵虫体分离得来的。
1982年，中国中医研究院中药研究所从云南迪庆藏族自治州的冬虫夏草（寄主为虫草蛾蝙蝠幼虫）中分离获得并鉴定为蝙蝠蛾拟青霉的菌株。
蝙蝠蛾拟青霉菌丝体研究进展
冬虫夏草(Cordyceps sinensis )是一种寄生于蝙蝠蛾幼虫的虫生真菌及其寄主蝙蝙蝠蛾幼虫尸体构成的虫菌复合体,具有益肾补肺、祛痰止咳等功效,为珍贵的中药材,药用历史悠久。
冬虫夏草对咯血、痨嗽、虚喘精、腰膝酸软、自汗盗汗等病症均有疗效。
蝙蝠蛾拟青霉为丛梗孢科瓶梗青霉属真菌,是从新鲜冬虫夏草的子座中分离获得,并经鉴定命名的一种虫草菌。
现代药理学证明,发酵虫草菌丝体与冬虫夏草有效成分类似,具有相似的药理作用[1-2]。
因为发酵方法成本相对较低且条件易于控制,目前利用液体深层发酵方法进行工业化生产菌丝体,已成为解决当前虫草资源匮乏的重要途径之一。
1蝙蝠蛾拟青霉菌丝体研究概况蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali )是从新鲜冬虫夏草中分离所得的隶属丛梗孢科(Moniliaceae )瓶梗青霉属(Paecilomyces Bain )虫生真菌[3]。
1982年,中国医学科学院药物研究所的研究人员从青海化隆采集的新鲜冬虫夏草中分离得到了Cs-4菌株,经鉴定可知,该Cs-4菌株是蝙蝠蛾拟青霉[4]。
此外,1982年,中国中医科学院中药研究所有关学者从云南迪庆采集的冬虫夏草样品中分离获得的菌株,经培养与形态学研究,可将其鉴定为蝙蝠蛾拟青霉[5]。
蝙蝠蛾拟青霉菌丝体是利用蝙蝠蛾拟青霉通过人工深层发酵培养所得,已作为冬虫夏草的代用品在中成药和保健食品中广泛使用。
目前,市场上的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体产品主要为金水宝胶囊。
2蝙蝠蛾拟青霉菌丝体培养方法当前,蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的培养已不仅仅停留在摇瓶和小罐发酵的试验水平上,许多菌丝体产品已经步入工业化大生产。
蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的液体深层发酵培养大多以葡萄糖或淀粉类物质为碳源,动植物蛋白为氮源,并且工业化生产菌丝体的培养基中含有的天然成分足以满足营养需求,并不需要再增加氨基酸等。
已有很多学者对蝙蝠蛾拟青霉菌丝体液体深层发酵培养进行研究。
尚静德等[6]用正交试验法选出了最佳发酵培养基,配方为2%葡萄糖、0.8%乳糖、1%氨基酸复合粉、0.1%硫酸锌、0.1%硫酸镁、0.1%磷酸二氢钾、15%马铃薯。
冬虫夏草及其相关类群的分子系统学分析
冬虫夏草及其相关类群的分子系统学分析魏鑫丽;印象初;郭英兰;沈南英;魏江春【期刊名称】《菌物学报》【年(卷),期】2006(25)2【摘要】为了探明冬虫夏草及其相关类群的亲缘关系,以冬虫夏草、中国被毛孢及中华束丝孢(=冬虫夏草头孢=蝙蝠蛾多毛孢)共6株菌种作为内群和一株蛹草拟青霉作为外群进行了DNA随机多态型(RAPD)分析.此外,基于上述供试材料又在内群中增加了一株蝙蝠蛾拟青霉,并对内群和外群样品的nrDNA间隔区(ITS)碱基序列进行了测定;对于测定的8条序列连同来自GenBank中的4条相关序列进行了分子系统学分析.结果表明:中华束丝孢和中国被毛孢均系冬虫夏草菌的无性型.按照国际植物命名法规,中国被毛孢应为冬虫夏草菌无性型的正确名称.而蝙蝠蛾拟青霉为不同于冬虫夏草菌的另一种真菌;该名称由于不合格发表而不被国际植物命名法规所承认.【总页数】11页(P192-202)【作者】魏鑫丽;印象初;郭英兰;沈南英;魏江春【作者单位】中国科学院微生物研究所真菌地衣系统学重点实验室,北京,100080;中国科学院研究生院,北京,100039;河北大学生命科学学院,保定 071002;中国科学院微生物研究所真菌地衣系统学重点实验室,北京,100080;青海畜牧兽医科学院,西宁,810003;中国科学院微生物研究所真菌地衣系统学重点实验室,北京,100080【正文语种】中文【中图分类】Q939.5【相关文献】1.冬虫夏草氨基酸含量与生态因子的相关性分析 [J], 冯凤英;于斌;刘青利;张艳玲;梁留科;方相林2.高效液相色谱与液相色谱-质谱分析冬虫夏草相关产品之麦角固醇与其衍生物 [J], 陈林垮;许瑞祥;郭嘉信3.冬虫夏草中虫草素相关基因的克隆及生物信息学分析 [J], 吴娟娟;吴明月;贾惠;张森;朱蕙霞4.东海及黄海南部渔业资源水文环境类群划分及其相关特征的初步分析 [J], 刘勇;程家骅5.SARS冠状病毒及相关病毒的分子系统学分析 [J], 张原;齐一琳;洪泂;郑光宇;阮力;郑楠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
冬虫夏草菌对蝙蝠蛾幼虫行为控制原因及机理探究
系。
二、实验背景
2.假设依据
➢2.1肠毒素的发现及相关研究：2017年10月Charissa de Bekker等 人针对类似“僵虫”行为操纵现象对各种具有类似控制现象的寄生 真菌进行了基因组测序及对比，通过分析直系同源簇基因发现肠毒 素可能在真菌操纵虫体的行为中具有重要意义。这些分泌的细菌样 毒素可能通过干扰宿主中化学信号分子的产生而影响宿主行为。
三、实验假设
冬虫夏草菌侵入蝙蝠蛾幼虫体内后分泌肠毒素影响虫体信号转导过 程，改变了幼虫嗅觉感受器上受体蛋白结构使蝙蝠蛾幼虫对10cm 土层中植物（头花蓼等）根系分泌物不敏感而感知2cm土层处上一 代冬虫夏草根部分泌物从而向2cm处移动。
根系分泌物提取 实验1
实验材料
实验1————根系分泌物提取
蛋白结构变化 实验3
——圆二色谱法
实验材料
从在室内饲养一段时间后并进行24 h 饥饿处理，同一世代、健康、 大小一致的4~5 龄蝙蝠蛾幼虫体内提取的嗅觉感受器
圆二色谱法所需的所有实验器材
野外获得纯正冬虫夏草菌种，实验室获取其分泌的肠毒素
实验方法
（1）取100只从在室内饲养一段时 间后并进行24 h 饥饿处理，同一世 代、健康、大小一致的4~5 龄蝙蝠 蛾幼虫体内提取的嗅觉感受器。
实验预 期结果
• （7）B组试虫对冬虫夏草根部和头花蓼根部的选择头数一样多，A 组试虫对头花蓼根部的选择头数更多，则说明蝙蝠蛾幼虫被冬虫夏 草菌孢子感染前对两种植物根系分泌物一样敏感，被感染后则对 10cm土层中头花蓼的根系分泌物更敏感。
• （8）B组试虫对冬虫夏草根部和头花蓼根部的选择头数一样多，A 组试虫对冬虫夏草根部的选择头数更多，则说明蝙蝠蛾幼虫被冬虫 夏草菌孢子感染前对两种植物根系分泌物一样敏感，被感染后则对 2cm土层处上一代冬虫夏草根系分泌物更敏感。
冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组、检测试剂盒和检测
专利名称：冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组、检测试剂盒和检测方法
专利类型：发明专利
发明人：刘桂清,韩日畴
申请号：CN201711340871.8
申请日：20171214
公开号：CN108018370A
公开日：
20180511
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。
本发明以冬虫夏草菌培养液的基因组DNA为模板，采用本发明设计的检测引物组，进行2次单管特异PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，判断冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的存在情况。
本发明建立了一种通过常规PCR反应检测冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的携带情况，只需DNA提取、PCR扩增和电泳检测三步即可完成对样品的检测，操作简单、易于掌握、准确性高，通过本发明的方法可以进一步开发检测试剂盒。
本发明为排除携带蝙蝠蛾拟青霉的冬虫夏草菌培养液提供了新的方法，为提高冬虫夏草菌对蝠蛾幼虫的侵染率及其子座形成提供技术支撑。
申请人：广东省生物资源应用研究所
地址：510260 广东省广州市海珠区新港西路105号
国籍：CN
代理机构：广州科粤专利商标代理有限公司
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蝙蝠蛾拟青霉原生质体紫外诱变育种
蝙蝠蛾拟青霉原生质体紫外诱变育种原生质体诱变技术是一种简便可行的菌种选育方法，在食用菌的菌种选育中得到了广泛应用[1~3]。
冬虫夏草的原生质体紫外诱变，国内已有相关的研究报道。
朱蕴兰等对冬虫夏草（Cordyceps sinensis）原生质体进行紫外诱变，诱变株的生物量和虫草素产量分别比出发菌株提高55.13%和113.99%[4]。
车振明等利用原生质体紫外诱变技术对蛹虫草（Cordyceps militaris）进行诱变育种，两株诱变株的子实体产量和虫草多糖含量均明显高于原始菌株[5]。
蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces hepiali）是天然冬虫夏草中普遍存在的一种虫草的无性型[6，7]，其发酵菌丝体可以作为天然冬虫夏草的替代品[8，9]。
迄今国内尚没有关于蝙蝠蛾拟青霉原生质体紫外诱变的研究报道，本试验对其原生质体进行紫外诱变，以期选育菌丝体得率和腺苷含量更高的蝙蝠蛾拟青霉新菌株。
1 材料和方法1.1供试菌株蝙蝠蛾拟青霉（P. hepiali）ZD 1#，由中山大学基因工程教育部重点实验室从青海省化隆县采集的冬虫夏草（C. sinensis）子座中分离得到，经广东省微生物分析检测中心鉴定。
1.2培养基斜面培养基：PDA培养基。
发酵培养基：鲜马铃薯6%，蔗糖1.5%，蚕蛹粉1.0%，玉米粉0.5%，硫酸铵0.5%，蛋白胨0.2%，pH 5.5~6.0。
原生质体再生培养基(/L)：麦芽糖10 g，葡萄糖4 g，酵母浸出粉4 g，以0.6 mol/L甘露醇为渗透压稳定剂，pH自然。
1.3菌丝摇瓶培养和收获采用二级发酵方法。
一级摇瓶种子在26 ℃、180 r/min培养3~4 d后转移到二级摇瓶中，26 ℃、250 r/min培养2~3 d。
具体方法同参考文献[1]。
摇瓶发酵后的培养液，用4层纱布过滤收集菌丝体，蒸馏水冲洗3次，挤干，50~60 ℃烘干，研磨粉碎，称重。
菌粉得率以100 mL培养液中菌粉干重的克数来表示。
蝙蝠蛾拟青霉- 蛹虫草复方的安全性评价及调节免疫活性研究
蝙蝠蛾拟青霉-蛹虫草复方的安全性评价及调节免疫活性研究焦春伟1,2，梁慧嘉2，随晶晶2，陈家明2，谢意珍1,2*（1.广东粤微生物科技有限公司，广东肇庆 526000；2.广东粤微食用菌技术有限公司，广东广州 510663）摘 要：目的：评价蝙蝠蛾拟青霉-蛹虫草复方安全性与免疫增强活性。
方法：采用小鼠急性毒性试验、骨髓细胞微核试验、精子畸形试验、微粒体酶（Ames）试验、迟发型变态反应试验、血清溶血素滴度检测和脾细胞抗体生成细胞试验，观察受试物的安全性和免疫功能。
结果：蝙蝠蛾拟青霉-蛹虫草复方对小鼠急性毒性最大耐受量＞20.0 g/kg bw，属无毒级物质，且小鼠骨髓细胞微核试验、精子畸形试验及Ames试验呈阴性；细胞免疫试验中，中剂量（0.33 g/kg bw）、高剂量（0.99 g/kg bw）复方能显著提高小鼠足跖厚度差值（中剂量：p＜0.05；高剂量：p＜0.01）；体液免疫试验中，高剂量复方能极显著提高小鼠溶血空斑数与半数溶血值（p＜0.01），说明复方能增强小鼠细胞免疫与体液免疫。
结论：该复方在试验剂量内安全无毒，且具有增强免疫功效。
关键词：蝙蝠蛾拟青霉；蛹虫草；毒理学；调节免疫；安全性评价Safety Evaluation and Immunomodulatory Activity of a Combination of Paecilomyces hepiali and Cordyceps militaris JIAO Chunwei1,2, LIANG Huijia2, SUI Jingjing2, CHEN Jiaming2, XIE Yizhen1,2*(1.Guangdong Yuewei Biotechnology Co., Ltd., Zhaoqing 526000, China; 2.Guangdong Yuewei EdibleFungi Technology Co., Ltd., Guangzhou 510663, China)Abstract: Objective: To evaluate the safety and immunomodulatory activity of the combination of Paecilomyces hepiali and Cordyceps militaris. Method: Acute toxicity test in mice, bone marrow cell micronucleus test in mice, sperm malformation test in mice, microsomal enzyme（Ames）test, delayed metamorphosis test in mice, serum hemolysin titer detection and spleen cell antibody - producing cell assay were used to observed to determine the toxicity and immune effect. Result: The maximum tolerated oral acute toxicity of the compound in mice was ＞20.0 g/kg bw, which was a non-toxic substance, and the mouse bone marrow cell micronucleus test, sperm malformation test and Ames test were negative; in the cellular immunity test, the medium (0.33 g/kg bw) and high (0.99 g/kg bw) doses of the compound significantly increased the difference in foot and plantar thickness in mice (medium dose: p＜0.05. High dose: p＜0.01); In the humoral immunity test, the high dose of the compound significantly increased the number of hemolytic vacuoles and hemolytic values in mice (p＜0.01), indicating that the compound could enhance cellular and humoral immunity in mice. Conclusion: the compound is safe and non-toxic at the doses tested and has immune-enhancing effects.Keywords:Paecilomyces hepiali; Cordyceps militaris; toxicology; immunomodulatory; safety evaluation基金项目：肇庆高新区创新团队项目（2019ZHQ10）；广州开发区国际科技合作项目（2020GH07）。
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药学学报Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ ２００８，４３（４）：４２１—４２６
ｓａｍｐｌｅｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｓｈｏｗｅｄ １ ００％ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒＤＮＡ．ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐ．ｈｅｐｉａｌｉ．Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ， ａｎｏｔｈｅｒ ｐａｉｒ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｒＤＮＡ．ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ ａｓ ｔｈｅ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ０６７７４０）ｂｕｔ ｔｈｅ ｌａｔｔｅｒ ｏｎｌｙ ｓｈａｒｅｄ ８７．３％ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ 日．ｓｉｎｅｎｓｉｓ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＪ３０９３５３）．Ｔｈｉｓ ｐａｉｒ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ｔｈｅ Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ ＰＣＲ．ａｎｄ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｈｏｗｅｄ １００％ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ＡＢ０６７７４０．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ Ｈ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ ｉｓ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｂｏｄｙ ｏｆ Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ．ｗｈｉｌｅ ｓｏｍｅ ｏｔｈｅｒ ｅｎｄｏｐａｒａｓｉｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ｓｕｃｈ ａｓ Ｐ．ｈｅｐｉａｌｉ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｅｘｉｓｔ ｉｎ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ．
药学学报Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ ２００８，４３（４）：４２１—４２６
·４２ｌ·
蝙蝠蛾拟青霉与冬虫夏草关系的分子系统学研究
杨金玲，肖 薇，何惠霞，朱慧新，王淑芳，程克棣，朱 平’
（中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所卫生部天然药物生物合成重点实验室，北京１０００５０）
摘要：以５月和６月两个不同时段采集的分别产于青海省化隆县和四川省康定县的冬虫夏草（Ｃｏｒｄｙｃｅｍ
Ｋａｎｇｄｉｎｇ，Ｓｉｃｈｕａｎ
Ｈｕａｌｏｎｇ，Ｑｉｎｇｈａｉ
Ｓｔｒｏｍａ ２－１ Ｓｔｒｏｍａ ３－１
Ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ ｂｏｄｙ ２－２ Ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ ｂｏｄｙ ３－２
Ｋａｎｇｄｉｎｇ，Ｓｉ ４－２
引物设计 设计合成真菌ｒＤＮＡ－ＩＴＳ通用引物： ＩＴＳｌ：５’．ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ．３’和ＩＴＳ４：５’． ＴｃＣＴｃＣＧＣ，ｒＩ＇ＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３ ７，用于扩增ｒＲＮＡ基 因“ＩＴＳｌ－５．８Ｓ ｒＤＮＡ．ＩＴＳ２”序列。根据通用引物扩 增得到的蝙蝠蛾拟青霉“ＩＴＳｌ．５．８Ｓ ｒＤＮＡ．ＩＴＳ２”序 列设计两对特异引物：ＣＳｌ：５’－ＣＣＴＡＴＣＧＴＴＧＣＴＴＣ ＧＧＣＧＧＡＣ－３’和ＣＳ２：５’－ＴＣＣＴＡＣＣＴＧＡＴＣＣＧＡＣＧＴＣ ＡＡＣ．３’；ＣＳ３：５ ７一ＣＣＣＣＣＡＡＡＣＴＣＴＧＴＡＴＴＣ ＴＣ．３ ７和 ＣＳ４：５’－ＣＧＧＴＧＣＧＡＧ７ＩＴＧＧＡＴｒＡＣ－３’，以进行ＰＣＲ 及巢式ＰＣＲ。根据ＧｅｎＢａｎｋ注册号为ＡＢ０６７７４０和 ＡＪ３０９３５３的ＤＮＡ序列设计两对特异引物：ＡＢｌ：５’． ＣＡＧＴＴＧＣＣＴＴＡＧＣＧＧＧＡＣＣＧ－３’和ＡＢ２：５’．ＣＧＡＧＧＴ
Ｔａｂｌｅ １ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｏｆ Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
Ｄａｔｅ ｏｆ ｓａｍｐｌｉｎｇ
Ｌｏｃａｌｉｔｙ
Ｎｕｍｂｅｒ
Ｍａｙ １２，２００６ Ｍａｙ １９，２００６ Ｊｕｎｅ ２０，２００６ Ｊｕｎｅ １２．２００６
Ｈｕａｌｏｎｇ，Ｑｉｎｇｈａｉ Ｓｔｒｏｍａ １—１ Ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ ｂｏｄｙ Ｉ－２
Ｑｉｎｇｈａｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ａｎｄ Ｋａｎｇｄｉｎｇ Ｃｏｕｎｔｙ ｉｎ Ｓｉｃｈｕａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｉｎ Ｍａｙ ａｎｄ Ｊｕｎｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｒＤＮＡ—ＩＴＳ
ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｖ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ ｔｈｅ ｆｒｅｓｈ ｓｔｒｏｍａ ｏｒ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ ｂｏｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｏｆ Ｐ．ｈｅｐｉａｌｉ，ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｆｕｎｇａｌ ｐｒｉｍｅｒｓ ＩＴＳｌ／ＩＴＳ４．Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＭＤｌ８一Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ． Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｔｈｏｓｅ ｆｒｏｍ ＧｅｎＢａｎｋ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅ ４６ ｃｌｏｎｅｓ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｃｈｏｓｅｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ ｓｈａｒｅｄ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｏｒ ａｌｍｏｓｔ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｒＤＮＡ．ＩＴＳ ｒｅｇｉｏｎｓ ａｎｄ ｈａｄ ｏｖｅｒ ９９％ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｗｉｔｈ ｓｏｍｅ ｒＤＮＡ—ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ａｎｄ Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ．ｂｕｔ ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅｍ ｈａｄ ｏｎｌｙ ａｂｏｕｔ ７２％ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ Ｐ．ｈｅｐｉａｌｉ． Ｔｗｏ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｒＤＮＡ－ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐ．ｈｅｐｉａｌｉ，ｔｈｅｎ ＰＣＲ ａｎｄ Ｎｅｓｔ—ＰＣＲ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｏｍａ ｏｒ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ ｂｏｄｙ ｏｆ Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ ｓａｍｐｌｅｓ ｍｅｎｔｉｏｎｅｄ ａｂｏｖｅ．Ｔｈｅ ａｐｐａｒｅｎｔ ｂａｎｄｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｎｅｓｔ—ＰＣＲ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ａＵ ｏｆ ｔｈｅ
某些已在ＧｅｎＢａｎｋ中注册的中国被毛孢（Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）或冬虫夏草的ｒＤＮＡ—ＩＴＳ序列的一致性均在９９％以上。
但与蝙蝠蛾拟青霉的ｒＤＮＡ．ＩＴＳ序列的一致性约为７２％。根据蝙蝠蛾拟青霉的ｒＤＮＡ—ＩＴＳ序列设计了两对特异引
物，分别以不同产地及不同生长时期共４个批次的冬虫夏草子座和僵虫基因组ＤＮＡ为模板，进行ＰＣＲ及巢式ＰＣＲ
扩增，均得到了相应片段，该片段与蝙蝠蛾拟青霉的ｒＤＮＡ—ＩＴＳ序列具有１００％的一致性。在ＧｅｎＢａｎｋ中注册号为
ＡＢ０６７７４０的另一个标明为冬虫夏草的ｒＤＮＡ．ＩＴＳ序列与注册号为ＡＪ３０９３５３的中国被毛孢的ｒＤＮＡ．ＩＴＳ序列一致性
仅为８７．３％，但根据ＡＢ０６７７４０序列设计特异引物，也从冬虫夏草基因组ＤＮＡ中扩增到其相应序列。研究结果表
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｈｅｐｉａｌｉ ａｎｄ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｒＤＮＡ．ＩＴＳ．Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕａｌｏｎｇ Ｃｏｕｎｔｙ ｉｎ
ｓｉｎｅｎｓｉｓ）新鲜子实体为材料，采用分子生物学方法，以ｒＤＮＡ—ＩＴＳ序列为分子标记，对蝙蝠蛾拟青霉（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ
ｈｅｐｉａｌｉ）与冬虫夏草之间的关系进行了探讨。以真菌通用引物ＩＴＳＩ／ＩＴＳ４分别对蝙蝠蛾拟青霉及冬虫夏草子座和僵
虫基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，获得的片段克隆到ｐＭＤｌ８·Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ上进行测序，结果表明，随机挑取的４６个克隆与
万方数据
为材料，以ｒＤＮＡ．ＩＴＳ序列为分子标记，对蝙蝠蛾 拟青霉与冬虫夏草之间的关系从分子系统学角度进 行了研究。
材料与方法 材料２００６年５月１２日和６月２０日于青海省
化隆县、２００６年５月１９日和６月１２日于四川省康 定县采集４批冬虫夏草（表１）。蝙蝠蛾拟青霉Ｃｓ４ 为本实验室保存菌种。
总ＤＮＡ提取新鲜冬虫夏草样品用无菌水清 洗去泥污，再分别用７０％酒精和０．１％升汞进行表 面消毒，然后用无菌水冲洗５次，无菌塑料袋密封后 置液氮中运送至实验室，６ ｈ内完成ＤＮＡ提取。采 用改良ＣＴＡＢ法…’提取冬虫夏草子座、僵虫及蝙蝠 蛾拟青霉基因组ＤＮＡ。
Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ
ＹＡＮＧ Ｊｉｎ—ｌｉｎｇ，ＸＩＡＯ Ｗｅｉ，ＨＥ Ｈｕｉ·ｘｉａ，ＺＨＵ Ｈｕｉ－ｘｉｎ，ＷＡＮＧ Ｓｈｕ－ｆａｎｇ， ＣＨＥＮＧ Ｋｅ—ｄｉ，ＺＨＵ Ｐｉｎｇ‘
（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００５０，Ｃｈｉｎａ）
明，在天然冬虫夏草中除了中国被毛孢之外，还普遍存在着蝙蝠蛾拟青霉等内寄生菌。
关键词：蝙蝠蛾拟青霉；冬虫夏草；中国被毛孢；ｒＤＮＡ·ＩＴＳ区；系统发育分析
中图分类号：Ｒ９１５
文献标识码：Ａ
文章编号：０５１３—４８７０（２００８）０４一０４２１一０６