牦牛携带的产志贺毒素大肠杆菌分离株的多位点序列分型研究

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牦牛致病性大肠杆菌多价油佐剂灭活苗的初步研制

பைடு நூலகம்
ｍ／３Ｌ只种免疫剂量分别肌肉接种兔６，只接种后２１ｄ
陈明勇（６年～，，士，１６）男博９副教授，主要从事动物传染病学研究。
维普资讯
中国兽药杂志
２０，３（）１／０２６１：１２陈明勇，等０１～表１免疫效力试验结果
养琼脂和厌氧肝肉汤培养基，７℃培养４ｈ观察有３，
１．安全性检查将制成的菌苗分别肌肉和皮下．２５
接种兔５，Ｌ只，观察有无反应。１后宰杀，只４ｍ／０ｄ检查注射部位变化。
１３培养基．
无细菌生长的可用于制苗。１．油佐剂灭活苗的制备在细菌计数的基础上按．３４
一
定比例将两种灭活细菌悬液充分混匀，并按要求
加人一定比例的吐温一０作为水相；以油佐剂为油８相，按一定比例将水相加人油相中，使每ｌｍＬ菌苗中含菌数在１ＣＵ左右，０。Ｆ充分乳化成油包水剂，无
牦牛大肠杆菌病是由某些血清型致病性大肠杆
１．细菌灭活检验．２４
取灭活４～２ｈ８７的细菌悬液接
菌菌株所引起的一类败血性感染和腹泻性传染病，
常给牦牛生产带来严重危害 …。致病性大肠杆菌易
效果。１．免疫剂量测定．５５选用０５ｍＬ只、１／、２．／只ｍＬ

牛肉样品中产志贺毒素大肠埃希氏菌和肠致病性大肠埃希氏菌的分离鉴定

牛肉样品中产志贺毒素大肠埃希氏菌和肠致病性大肠埃希氏菌的分离鉴定朱应飞，聂　翔，熊丽霞，吴学平，占忠旭，匡佩琳（江西省检验检测认证总院食品检验检测研究院，江西南昌 330000）摘　要：于2018年9月—2019年3月，每个月从超市和农贸市场中抽取20个样本，共抽取140个牛肉及制品样本，在qPCR初筛时stx阳性率为45.8%，eae的阳性率为52.2%。

每月的stx初筛阳性率分别为65%、60%、80%、5%、25%、45%和40%；eae初筛阳性率分别为70%、70%、65%、0%、40%、65%和55%。

检出携带stx基因的产类志贺毒素大肠埃希氏菌样本4份，样本阳性菌株检出率为2.9%；检出携带eae基因的肠致病性大肠埃希氏菌样本12份，样本阳性菌株检出率为8.6%。

关键词：产志贺毒素大肠埃希氏菌；肠致病性大肠埃希氏菌；分离；鉴定Isolation and Identification of Shiga Toxin Producing Escherichia coli and Enteropathogenic Escherichia coli in BeefSamplesZHU Yingfei, NIE Xiang, XIONG Lixia, WU Xueping, ZHAN Zhongxu, KUANG Peilin (Jiangxi General Institute of Testing and Certification Food Testing Institute, Nanchang 330000, China)Abstract: From September 2018 to March 2019, 20 samples were taken from supermarkets and farmers’ markets every month, with a total of 140 beef and product samples taken. the positive rate of stx was 45.8%, and the positive rate of eae was 52.2%. The monthly positive rates of stx initial screening positive rates of 65%, 60%, 80%, 5%, 25%, 45%, and 40%, respectively; The positive rates of eae initial screening were 70%, 70%, 65%, 0%, 40%, 65%, and 55%, respectively. Four Shiga toxin producing Escherichia coli samples carrying the stx gene were detected, with a positive strain detection rate of 2.9%; From September 2018 to March 2019, 12 samples of enteropathogenic Escherichia coli carrying the eae gene were detected, with a positive strain detection rate of 8.6%.Keywords: Shiga toxin producing Escherichia coli; enterogenic Escherichi coli; separation; appraisal产志贺菌毒素的大肠杆菌（Shiga Toxin Producing Escherichia coli，STEC）和肠致病性埃希氏菌（Enterogenic Escherichi coli，EPEC）是世界上最重要的食源性病原体之一。

牦牛源肠球菌的分离鉴定及耐药性分析

收稿日期 0&%(!&R!&( 基金项目.十三五/国家重点研发计划课题"0&%(C<A&2&&1&/#(西南民族大学研究生创新课题"JX0&%(eN%)(#(兽医专业学位研究生教育实
践基地建设作者简介徐 ! 凤 "%1R1!#!女 !重庆人 !硕士生 !研究方向 $动物传染病防控 !I!E4$G$UY3;-8*20&%%!%(*',#E " 通信作者张焕容 "%1(R!#!女 !重庆人 !博士 !教授 !研究方向 $动物传染病防控 !I!E4$G$/0//)(/(R!ii',#E
#! 材料与方法
#F#! 材料 %'%'%!粪样 ! !1 份腹泻牦牛粪便样采自红原县龙日乡() 份外表健康牦牛粪便样品和 ) 份带血牦牛粪便样品均采自红原县麦洼乡&无菌采集牦牛粪便于无菌采样袋中!干冰保存并及时送实验室进行细菌分离& %'%'0! 质控菌株 '培养基及主要试剂 ! ! 粪肠球菌 =ZJJ010%0购自中国兽药监察所(胰蛋白胨大豆琼脂 "ZN=#培养基和胰蛋白胨大豆肉汤 "ZN>#培养基均购自青岛海博生物技术有限公司(IU D%E AQ= 聚合酶'?JK 试剂'AW0&&& AQ= H4:.;:' "QZ? 均购自 Z4^4K4公司(药敏纸片购自杭州yright©博看网. All Rights Reserved.

牦牛粪样中大肠杆菌及沙门菌的分离鉴定

牦牛粪样中大肠杆菌及沙门菌的分离鉴定摘要：一、引言二、牦牛粪中大肠杆菌和沙门菌的分离1.样品的收集和处理2.培养基的选择3.分离和纯化方法三、大肠杆菌和沙门菌的鉴定1.形态特征观察2.生化试验3.染色试验四、结果与讨论五、结论正文：一、引言牦牛是青藏高原特有的动物，其粪便作为高原生态系统的重要组成部分，对于研究高原生态环境和牦牛的消化生理具有重要意义。

本研究旨在从牦牛粪中分离鉴定大肠杆菌和沙门菌，以了解其在牦牛体内的分布和生长状况。

二、牦牛粪中大肠杆菌和沙门菌的分离1.样品的收集和处理在海拔3500-4500 米的青藏高原地区，收集牦牛新鲜粪便，将其在4℃保存，运回实验室后，立即进行处理。

将粪便样品在无菌操作台上称取0.1g，加入10 mL 无菌生理盐水，混匀后，制成1:10 的稀释液。

2.培养基的选择选择适合大肠杆菌和沙门菌生长的培养基，如麦康凯琼脂平板、三糖铁琼脂平板等。

3.分离和纯化方法将稀释液均匀涂布在培养基上，37℃培养24-48 小时，观察菌落生长情况。

对疑似大肠杆菌和沙门菌的菌落进行纯化，以获得纯菌株。

三、大肠杆菌和沙门菌的鉴定1.形态特征观察在显微镜下观察大肠杆菌和沙门菌的形态特征，如菌体的形状、大小、颜色等。

2.生化试验进行生化试验，包括发酵试验（如葡萄糖、乳糖、甘露醇等）、氧化酶试验、触酶试验等，以判断菌株的代谢特性。

3.染色试验进行革兰氏染色，观察菌体的染色性质。

同时进行吲哚试验、VP 试验等，以进一步确认菌株的种类。

四、结果与讨论通过以上实验方法，成功从牦牛粪中分离出大肠杆菌和沙门菌。

实验结果显示，大肠杆菌在麦康凯琼脂平板上形成凸起光滑湿润的粉红菌落，沙门菌在三糖铁琼脂平板上形成无色透明菌落。

生化试验结果表明，大肠杆菌能发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇，沙门菌能发酵葡萄糖、乳糖，但不能发酵甘露醇。

染色试验结果显示，大肠杆菌为革兰氏染色阳性红色短杆菌，沙门菌为革兰氏染色阴性杆菌。

五、结论本研究成功从牦牛粪中分离鉴定出大肠杆菌和沙门菌，为进一步研究牦牛消化生理和肠道微生物群落提供了实验材料。

川西北牦牛致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

川西北牦牛致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验汪洋;易力;王红宁;李建文【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2008(44)5【摘要】牦牛大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌（埃希氏大肠杆菌）引起的一种急性传染病。

临床上主要表现为剧烈腹泻、脱水、虚脱及急性败血症。

牦牛大肠杆菌病在牧区普遍存在。

该病既是原发性疾病又可继发多种疾病，具有较高的发病率和死亡率。

随着抗生素的大量使用，耐药菌株不断增多，耐药谱也越来越广，牧民很难准确选用高效药物。

既影响疗效，又造成药物的浪费。

我们在对发病牦牛进行致病性大肠杆菌分离鉴定的基础上，并用抗菌药物对分离菌进行了药敏试验，为临床合理选择用药、有效防治牦牛大肠杆菌病提供依据。

【总页数】2页(P36-37)【作者】汪洋;易力;王红宁;李建文【作者单位】河南科技大学动物科技学院,河南,洛阳,471031;四川农业大学动物科技学院,四川,雅安,625014;洛阳师范学院生命科学系,河南,洛阳,471022;四川农业大学动物科技学院,四川,雅安,625014;四川农业大学动物科技学院,四川,雅安,625014;四川农业大学动物科技学院,四川,雅安,625014【正文语种】中文【中图分类】S823.851【相关文献】1.川西北牦牛肉中产志贺毒素大肠杆菌的分离鉴定及stx2基因的序列分析 [J], 童京京;刘飞;周芳;冉丹丹;汤承2.鸡源致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验 [J], 任丽;徐睿;唐强;何欣怡3.猪源肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验 [J], 丁建华; 吕李明; 周磊; 李泽伟; 孙起荣; 刘雪兰; 李郁4.犊牛致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验 [J], 曹贵忠5.牦牛致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验 [J], 廖娟;王红宁;黄勇;田浪;李建文;王钢因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

西藏牦牛大肠杆菌的分离鉴定及部分生物学特性

《西藏科技》2017年12期（总第297期）西藏牦牛大肠杆菌的分离鉴定及部分生物学特性贡嘎次仁次旺罗布（西藏拉萨市曲水县聂当乡人民政府，西藏拉萨850000）摘要：采集曲水县牦牛产区发生的疑似大肠杆菌自然病死牦牛的心、肝、脾、肾、淋巴结与血液分离鉴定出42株大肠杆菌，通过形态观察、生化试验，血清学鉴定等试验，表明22株分离菌培养特性和生化特性基本一致，其中3株具有很强致病力，是血清型不同的致病性大肠杆菌，分离鉴定的42株病原性牦牛大肠杆菌O抗原定型29株，共覆盖了O142、O148、O158、O26、O43、O159、O39、O108、O91、O21、O14、O13、O36、O24、O18、O68和O25共17种血清型，其中血清型O26、O148、O142、O158为优势血清型，共16株占定型株数的56％，对3株高致病性分离菌的药物敏感性试验显示，该分离菌对所试的22种药物中，丙氟哌酸、氟哌酸、阿奇霉素、头孢氨苄、四环素、呋喃妥因头孢肤肟等7种药物高度敏感，头孢孟多、丁胺卡那、新霉素、庆大霉素、头孢三嗪、链霉素等6中度敏感，对先美福仙、诺氟沙星等药物低度敏感，对氨苄青霉素、青霉素、氨苄西林等药物具有耐药性，对其他药物的敏感性则不一致；通过动物致病实验，Gg5、Gg9和Gg15号菌株的毒力最强，致死率超过93%以上。

结果提示，同一地方的发病牦牛群存在着多种血清型，耐药谱复杂，且没有一种抗生素对所分离的菌株全部敏感。

关键词：牦牛大肠杆菌药敏实验曲水县聂当乡、才纳乡、茶巴拉乡、达嘎乡、曲水镇等是曲水县主要的牦牛产区，也是当地牧民们最主要生活来源，近年致病性大肠杆菌引起牦牛的腹泻及败血症病例呈上升趋势，成为影响本地区牦牛生产的主要疾病之一，患病牦牛主要以下痢、腹泻、食欲不正、排水样粪便、有的还带泡沫的血色粪便、消瘦死亡为特征，以急性出血性肠炎为典型病理变化，其普遍性和严重性以及对畜牧业发展造成的威胁越来越严重。

牦牛肠道粪肠球菌的分离和鉴定

牦牛肠道粪肠球菌的分离和鉴定周雪雁;刘翊中;陈轶霞;李倬;刘俊林【摘要】In order to obtain an Enterococcus faecalis strain being symbiotic to yak enteric duct, an Enterococcus strain was isolated and cultured from healthy yak dung samples, Gram staining, biochemical testing, 16S rRNA gene se-quencing comparison and other biological identifications, the results have preliminarily proved that the isolated strain to be Enterococcus faecalis. This experiment provided some evidences for further analysis of the structure of yak intesti-nal flora, for further exploration of the relationship between yak resistance to hunger, thirsty, and crude feed, the strong adaptability to alpine grasslands and the intestinal flora, and for further study on the biological and physiological characteristics of the yak symbiotic E. faecalis and its harms to the host.%试验为获得1株与牦牛肠道共生的粪肠球菌，通过对健康牦牛粪样中的肠球菌进行分离培养、革兰染色、生化试验、16S rRNA基因测序比对等生物学鉴定，初步证实该分离菌株为粪肠球菌。

川西北牦牛源产肠毒素大肠杆菌的分子流行病学调查

川西北牦牛源产肠毒素大肠杆菌的分子流行病学调查郝一妹;张焕容;张斌;汤承【摘要】为调查川西北地区牦牛源产肠毒素大肠杆菌的流行情况,对采自川西北甘孜州和阿坝州的26份腹泻牦牛粪便样品进行大肠杆菌分离,分别以分离的大肠杆菌DNA和牦牛腹泻粪便样本提取的总DNA为模板,采用PCR方法扩增产肠毒素大肠杆菌黏附因子K99+菌毛基因片段,分析产肠毒素大肠杆菌在牦牛腹泻中存在情况,同时比较两种DNA提取方法对产肠毒素大肠杆菌PCR检出率的差异;以分离自外表健康牦牛粪便的105株大肠杆菌DNA为模板,采用PCR方法扩增产肠毒索大肠杆菌黏附因子K99+菌毛基因片段,比较牦牛源产肠毒素大肠杆菌在外表健康牦牛和腹泻牦牛中的携带情况.结果:从26份牦牛腹泻粪便样本中共鉴定出84个大肠杆菌菌落携带K99菌毛基因,这些菌落分别来自所有26份牦牛腹泻样品,因此,牦牛腹泻样本100％分离并检测到携带K99+菌毛基因的产肠毒素大肠杆菌;而粪便总DNA检测结果为K99+菌毛基因阳性率84.62％(22/26),粪便中提取的总DNA模板K99+菌毛基因PCR检出率略低于分离鉴定的细菌DNA检出率;105株外表健康牦牛粪便样本分离株中检测到携带K99+菌毛基因的产肠毒素大肠杆菌34株,检出率为32.38％(34/105),产肠毒素大肠杆菌在牦牛腹泻样本中的检出率显著高于外表健康牦牛粪便的检出率(P＜0.001).结果表明,产肠毒素大肠杆菌在牦牛粪便中存在广泛,是引起牦牛腹泻的一种重要病原菌;以粪便中提取的总DNA为模板,可快速检测牦牛粪便中产肠毒素大肠杆菌的存在.【期刊名称】《西南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(040)001【总页数】4页(P16-19)【关键词】牦牛;腹泻;产肠毒素大肠杆菌;K99+菌毛基因【作者】郝一妹;张焕容;张斌;汤承【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;动物医学四川省高等学校重点实验室,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;动物医学四川省高等学校重点实验室,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041【正文语种】中文【中图分类】S852.61;S858.23致病性大肠杆菌包括产志贺氏毒素大肠杆菌( Shiga toxin-producing Escherichia coli , STEC), 产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC), 肠侵袭性大肠杆菌(enteroinvasive Escherichia coli, EIEC), 肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli, EPEC), 肠聚集性大肠杆菌(enteroaggregative Escherichia coli, EAEC)和弥散粘附型(diffusely adherent Escherichia coli, DAEC)[1]. ETEC是致人、畜腹泻最常见的大肠杆菌, 具有重要的公共卫生学意义[2]. 国内外学者一致认为ETEC能产生两种致病因子, 即黏附因子和肠毒素[3-4]. ETEC主要借助其所产生的菌毛抗原黏附于小肠粘膜, 定居并产生肠毒素而呈现致病作用[5]. 虽然大肠杆菌血清型很复杂, 但牛的ETEC一般都含有K99﹑F41﹑31A﹑FY(ATT25)等菌毛抗原, 其中以 K99﹑F41最为常见[6], 只要检测到携带K99菌毛基因的大肠杆菌, 即可判定该大肠杆菌为ETEC[7-8]. 世界多个国家对牛的产肠毒素大肠杆菌进行了深入的调查研究. 而牦牛作为青藏高原特色的物种之一, 对其含K99+菌毛基因产肠毒素大肠杆菌的携带情况未见文献报道. 本研究对川西北地区阿坝州和甘孜州腹泻牦牛的粪便总DNA和从腹泻粪便样品中分离的大肠杆菌提取的DNA, 以及外表健康牦牛粪便分离的大肠杆菌DNA进行ETEC 黏附因子K99+菌毛基因PCR检测, 以弄清牦牛源产肠毒素大肠杆菌的流行情况, 为该病的防治提供理论, 并为该种致病菌的临床快速检测提供可靠的方法.1.1 菌株和粪便样本外表健康牦牛源大肠杆菌105株, 分离自川西北甘孜州和阿坝州来源的待屠宰牦牛粪便棉拭子, 由西南民族大学动物医学实验室保存[9]; 大肠杆菌 C83912, 购自国家兽医微生物菌种保藏中心; 16份来自甘孜州塔公草原和10份来自阿坝州若尔盖腹泻牦牛的新鲜粪便样本.1.2 引物合成参照文献[10]中引物序列合成产肠毒素大肠杆菌黏附因子K99+菌毛基因引物1对. 引物信息见表1, 引物由上海生工生物工程技术有限公司合成.1.3 主要试剂Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker 600均购自大连宝生物公司; 琼脂糖购自大连宝生物工程; 麦康凯琼脂培养基购自北京陆桥技术有限责任公司.1.4 粪便样品的预处理[11]每份粪便样本0.5g加入装有750μL无菌PBS缓冲液(0.05mol/L, pH7.4)的1.5 mL离心管中充分振荡摇匀5-10min后500rpm 离心5min, 取上清液. 此步骤重复3次. 上清液5 000rpm/min离心10min, 收集沉淀臵于1.5 mL离心管中. 沉淀物重悬于1mL双蒸水中.1.5 粪便总DNA的提取取上述粪便样品预处理液, 根据卢圣栋[12]改良的酚/氯仿抽提法提取总DNA 作为模板.1.6 细菌的分离培养及DNA提取将粪便棉拭子接种于含LB培养液中, 预增菌8 h, 接种环沾取一环用三分区逐步稀释划线接种于麦康凯培养基, 臵37℃培养24 h, 观察其菌落特征. 挑取特征菌落增菌后按酚-氯仿法提取细菌DNA.1.7 产肠毒素大肠杆菌K99+菌毛基因PCR检测方法的建立采用下述反应体系：10×PCR Buffer 2.5µL, dNTP10 mmol/L2µL, 上下游引物均为10 pmol/L各1µL, Taq酶5U/L 0.2µL, DNA模板2µL, 加超纯水至总体积25µL ; PCR反应条件为95℃预变性5min, 94℃变性30s, 55℃退火40s, 72℃延伸50s, 共30个循环, 72℃延伸10min; 以参考菌株作为阳性对照, 灭菌超纯水作为空白对照,建立产肠毒素大肠杆菌K99+菌毛基因的PCR检测方法.1.8 细菌DNA和粪便样品总DNA的PCR检测采用1.7中建立的方法对105株分离自外表健康牦牛粪便的大肠杆菌DNA以及26份粪便样品中分离的93株大肠杆菌DNA和26份腹泻粪便总DNA进行PCR 检测.2.1 产肠毒素大肠杆菌K99+菌毛基因PCR检测方法以参考菌株作为阳性对照, 灭菌超纯水作为空白对照, 成功建立产肠毒素大肠杆菌K99+菌毛基因的PCR检测方法, 扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析, 获得了约200bp的特异性条带, 经测序证实目的片段大小为230bp.2.2 腹泻粪便样品中分离细菌的K99+菌毛基因PCR检测结果从26份腹泻粪便样品中共挑取93个可疑菌落, 菌落增菌后提取DNA经PCR检测, 其中84个菌落来源的DNA检测出K99+菌毛基因片段, 而这84个菌落分属于26份腹泻粪便样品, 随机抽取PCR产物测序证实为230bp的目的基因. 因此, 经细菌分离后, 腹泻样品中100%检测到K99+菌毛基因.2.3 腹泻粪便样品总DNA K99+菌毛基因PCR检测结果26份腹泻样品总DNA中, 有22份获得了与预期目的片段大小相符的特异性条带,随机抽取PCR产物测序证实为230bp的目的基因片段, 26份腹泻样品总DNA中K99+菌毛基因阳性检出率为84.62%(22/26).2.4 外表健康牦牛源大肠杆菌DNA K99+菌毛基因PCR检测结果105株外表健康牦牛源大肠杆菌DNA经PCR检测, 其中34株的DNA经PCR扩增获得了特异性条带, 阳性检出率为32.38%(34/105), 随机抽取PCR产物测序证实为230bp的目的基因片段. 部分样品的 PCR扩增结果如下图1.牦牛是分布在海拔3000米以上的古老牛种之一. 中国有1400多万头, 是世界上拥有牦牛数量和品种最多的国家, 约占世界牦牛总数的95%以上[13]. 牦牛对高寒草地生态环境条件具有很强的适应性, 能在空气稀薄、牧草生长期短、气候寒冷的恶劣环境条件下生活自如, 繁衍后代, 并为牧民提供奶、肉、毛、役力、燃料等生产、生活必需品, 是当地畜牧业经济中不可缺少的畜种. 牦牛腹泻症是目前危害牛业生产的主要疾病之一. 临床上以排水样、糊状或褐色粪便为特征[14], 给牦牛业带来了重大的经济损失. 本试验对外表健康牦牛粪便中分离的105株大肠杆菌经K99+菌毛基因PCR扩增鉴定, 发现其中34株携带K99+菌毛基因, 阳性率高达32.38%(34/105),而腹泻样本经直接提取粪便总DNA和经细菌分离培养后PCR检测, K99+菌毛基因检出率分别为84.62%(22/26)和100%(26/26). 可见从外表健康牦牛粪便中分离的大肠杆菌K99+菌毛基因携带率明显低于临床腹泻牦牛粪便样品总DNA 和经分离鉴定的大肠杆菌中提取的DNA检出率. 推测携带K99+菌毛基因的产肠毒素大肠杆菌是引发川西北牦牛腹泻的重要原因之一. 本试验针对牦牛腹泻样本, 分别采取了粪便总DNA和分离细菌的DNA作为PCR检测模板, 粪便总DNA检出率略低于分离细菌的DNA检出率, 但两种DNA PCR检测结果差异不显著, 直接提取粪便总DNA作为PCR检测模板大大缩短了检测时间, 人力和材料消耗少, 能够达到快速检测的目的; 而先分离细菌再检测, 耗时长, 工作量大, 但检测结果更准确.【相关文献】[1] MUDIT CHANDRA,PUI CHENG,GAELLE RONDEAU,et al. A single step multiplex PCR for identfication of six diarrheagenic E.coli pathotypes and Salmonella[J]. International Journal of Medical Microbiology, 2013(303): 210-216.[2] RANIAA NADA,ADAMARMSTRONG,HINDI SHAHEEN,et al.Phenotypicand genotypic characterization of enterotoxigenic Escherichia coli isolated from U.S. military personnel participating in Operation Bright Star, Egypt, from 2005 to 2009[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2013(76): 272-277.[3] STEPHEN D. Enterotoxigenic Escherichia coli infections in newborn calves:a review[J]. J Dairy Sci, 1985(68):229-256.[4] WRAY.Aspects of coli bacillosis in farm animals[J]. J Hyg, 1985(75): 577-593.[5] 张勇, 吴鹏, 张天聪, 等. 牛源大肠杆菌分离株菌体抗原及菌毛特性研究[J]. 黑龙江八一农垦大学学报, 2007, 19(3): 76-80.[6] SHIMIZU M, T SAKANO, J YAMAMOTO,et al. Incidence and some characteristics of fimbriac FY and 31A of Escherickia coli isolates from calves with diarrhea in Japan[J]. Microbio Immunol, 1987(31): 417-426.[7] 段新华,李建军. 致犊牛腹泻肠毒素大肠杆菌多重 PCR检测方法的建立[J]. 中国动物检疫, 2010, 27(1): 33-34.[8] CLEIDE FERREIRA CATANI,TATSUMI YAMADA,MARILDA C. Vidotto, Tomomasa Yano, Adhesion of bovine enterotoxigenic Escherichia coli(ETEC) by type l-like fimbriae[J]. FEMS Microbiology Letters, 1996(137): 241-245.[9] 宋定州,于学辉,汤承,等.牦牛产志贺毒素大肠杆菌主要黏附因子相关基因的分子流行病学调查[J]. 中国畜牧兽医, 2013, 40(1): 153-156.[10] YONG-IL CHO,WON-IL KIM. Development of a panel of multiplex real-time polymerase chain reaction assays for simultaneous detection of major agent-s causing calf diarrhea in feces[J]. J Vet Diagn Invest, 2010(22):509-517.[11] 陈蓓, 黄瑞. 粪便标本中细菌DNA提取方法的比较[J]. 中国血液流变学杂志,2007, 17(2):210-214.[12] 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术[M]. 2版, 北京: 中国协和医科大学出社, 1999: 61-149.[13] 中国畜禽遗传资源状况编委会.中国畜禽遗传资源状况[M]. 北京: 中国农业出版社, 2004.[14] 陈明勇, 陈德成, 曾群辉, 等. 西藏地区牦牛致病性大肠杆菌的分离鉴定[J]. 中国预防兽医学报, 2001, 23(5): 389-390.。

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ＭｕｌｔｉｌｏｃｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｉｎｇｏｆＳｈｉｇａｔｏｘｉｎ ‘ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｙａｋｓ
ＳＴＥＣｓｔｒａｉｎｓ．ＩｔｃｏｕｌｄｂｅｃｏｎｃｌｕｄｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｅｘｉｓｔｓｈｉｇｈｌｙｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｍｏｎｇｔｈｅＳＴＥＣｉｓｏｌａｔｅｓｉｎｙａｋｓ，ｓｏｍｅｏｆｗｈｉｃｈｍａｙｈａｖｅｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｔｏｃａｕｓｅｈｕｍａｎｄｉｓｅａｓｅ．ＫＥＹＷＯＲＤＳ：Ｓｈｉｇａｔｏｘｉｎ — ｐｒｏｄｕｃｉｎｇＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ；ｍｕｈｉｌｏｃｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｉｎｇ；ｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｅ；ｙａｋ
ｅｒＭａｊｏｒＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ（Ｎｏ．２０１３ＺＸ１０００４ — ００１）Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＬｕＳｈａｎ，Ｅｍａｉｌ：ｌｕｓｈａｎ＠ｉｃｄｃ．ｃｎ
２０１３ＺＸ１０００４ — ００１） ‘
志贺毒素（Ｓｈｉｇａｔｏｘｉｎｓ，Ｓｔｘｓ）大肠杆菌的总称，是
重要的食源性病原菌，可引起水样腹泻、出血性肠炎
（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｃｏｌｉｔｉｓ，ＨＣ）、溶血性尿毒综合征（ｈｅ —
ｍｉｓｔ．ＵｅＣ．ｉｅ／ｍｌｓｔ／ｄｂｓ／Ｅｃｏｌｉ）提供的ＭＬＳＴ方案，对青海玉树牦牛中分离的５４株ＳＴＥＣ分离株的７个管家基因进行ＰＣＲ扩增并测序，通过序列比对确定其等位基因及菌株序列型（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｅ，ＳＴ），并使用ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｅｓ软件构建最小生成树（Ｍｉｎｉ —
中国人兽共患病学报１．２．２管家基因扩增根据Ｅ．ｃｏｌｉＭＬＳＴ数据库（ｈｔｔｐ：／／ｍｌｓｔ．ＵＣＣ．ｉｅ／ｍｌｓｔ／ｄｂｓ／Ｅｃｏｌｉ）提供的大肠杆菌ＭＬＳＴ分型方案，包括７个管家基因ａｄｋ、ｆｕｍＣ、ｇｙｒＢ、ｉｃｄ、ｍｄｈ、ｐｕｒＡ、ｒｅｃＡ。ＰＣＲ引物序
ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｙａｋｓｉｎｔｈｅＱｉｎｇｈａｉ — ＴｉｂｅｔａｎＰｌａｔｅａｕ，ａｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｉｎｇ
ｍｏｌｙｔｉｃｕｒｅｍｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＨＵＳ）等病死率高的疾
病［１］。目前报道分离自患者的ＳＴＥＣ血清型达４７０
多种，其中以Ｏ１５７：Ｈ７血清型为主。ＳＴＥＣ主要
通讯作者：卢珊，Ｅｍａｉｌ：ｌｕｓｈａｎ＠ｉｅｄｃ．ｃｎ
作者单位：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，传染病预防控
制国家重点实验室，北京１０２２０６
１１３８
牦牛携带的产志贺毒素大肠杆菌分离株的多位点序列分型研究
孙晖，白向宁，赵爱兰，孟琼，熊衍文，卢珊
摘要：目的对牦牛携带的产志贺毒素大肠杆菌（Ｓｈｉｇａｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，ＳＴＥＣ）进行多位点序列分型（Ｍｕｈｉｌｏｃｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｉｎｇ，ＭＬＳＴ）分析，了解菌株的遗传进化关系及致病潜力。方法根据Ｅ．ｃｏｌｉＭＬＳＴ数据库（ｈｔｔｐ：／／
产志贺毒素大肠杆菌（Ｓｈｉｇａｉｎｇ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，ＳＴＥＣ）是一类产１种或１种以上
国家 “ 艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治” 科技重大专项（Ｎｏ．
Ｔｈｅｍｉｎｉｍｕｍｓｐａｎｎｉｎｇｔｒｅｅ（ＭＳＴ）ｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｕｓｉｎｇＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｔｈｉｒｔｙ — ｏｎｅＳＴｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇ７ｎｅｗａｌｌｅｌｅｓａｎｄ
ｍｕｍｓｐａｎｎｉｎｇｔｒｅｅ，ＭＳＴ），分析牦牛ＳＴ型与ＨＵＳＥＣ及人源主要流行血清群ＳＴＥＣ菌株ＳＴ型间的进化关系。结果５４株
牦牛ＳＴＥＣ菌株呈现高度遗传多态性，可分为３１个ＳＴ型别，其中包括７个新的等位基因型和１７个新的ＳＴ型，并存在与ＨＵＳＥＣ及主要流行血清群ＳＴＥＣ亲缘关系相同或相近的ＳＴ型别。结论青藏高原牦牛携带的ＳＴＥＣ具有遗传多样性及一定的特异性，部分菌株具有对人致病的潜力。关键词：产志贺毒素大肠杆菌；多位点序列分型；序列型；牦牛中图分类号：Ｒ５１５文献标识码：Ａ文章编号：１００２ —２６９４（２０１３）１２ —１１３７ —０６
ＳＵＮＨｕｉ，ＢＡＩＸｉａｎｇ — ｎｉｎｇ，ＺＨＡＯＡｉ — ｌａｎ，ＭＥＮＧＱｉｏｎｇ，ＸＩＯＮＧＹａｎ — ｗｅｎ，ＬＵＳｈａｎ
（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒｊｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄＣｏｎｔｒｏｌ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＣｏｍｍｕｎｉｃａｂｌｅ
ＳｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＭａｊｏｒＳｃｉｅｎｃｅ＆ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＰｒｏｇｒａｍｆｏｒＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄＣｏｎｔｒｏｌｏｆＡＩＤＳ，ＶｉｒａｌＨｅｐａｔｉｔｉｓａｎｄＯｔｈ
嚣
中国人兽共患病学报
２０１３，２９（１２）
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｏｏｎｏｓｅｓ１１３７
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｃｊｚ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００２—２６９４．２０１３．１２．００２
ＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＣｈｉｎｅｓｅＣｅｎｔｅｒｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０２２０６，Ｃｈｉｎａ）
ｉｎｇｇｅｎｅｓｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲａｎｄｔｈｅｎｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．Ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｅｓ（ＳＴｓ）ｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｓｅｑｕｅｎｃｅｓｃｏｍｐａｒｉｎｇ．
１７ｎｅｗＳＴｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｉｎ５４ｙａｋＳＴＥＣｉｓｏｌａｔｅｓ．ＳｏｍｅｏｆｔｈｅｓｅＳＴｓｓｈａｒｅｄｔｈｅｓａｍｅｏｒｒｅｌａｔｅｄＳＴｓｗｉｔｈＨＵＳＥＣｏｒｈｕｍａｎ