产志贺毒素大肠埃希菌的分子生物学鉴定和耐药性分析
牛肉样品中产志贺毒素大肠埃希氏菌和肠致病性大肠埃希氏菌的分离鉴定
牛肉样品中产志贺毒素大肠埃希氏菌和肠致病性大肠埃希氏菌的分离鉴定朱应飞，聂 翔，熊丽霞，吴学平，占忠旭，匡佩琳（江西省检验检测认证总院食品检验检测研究院，江西南昌 330000）摘 要：于2018年9月—2019年3月，每个月从超市和农贸市场中抽取20个样本，共抽取140个牛肉及制品样本，在qPCR初筛时stx阳性率为45.8%，eae的阳性率为52.2%。
每月的stx初筛阳性率分别为65%、60%、80%、5%、25%、45%和40%；eae初筛阳性率分别为70%、70%、65%、0%、40%、65%和55%。
检出携带stx基因的产类志贺毒素大肠埃希氏菌样本4份，样本阳性菌株检出率为2.9%；检出携带eae基因的肠致病性大肠埃希氏菌样本12份，样本阳性菌株检出率为8.6%。
关键词：产志贺毒素大肠埃希氏菌；肠致病性大肠埃希氏菌；分离；鉴定Isolation and Identification of Shiga Toxin Producing Escherichia coli and Enteropathogenic Escherichia coli in BeefSamplesZHU Yingfei, NIE Xiang, XIONG Lixia, WU Xueping, ZHAN Zhongxu, KUANG Peilin (Jiangxi General Institute of Testing and Certification Food Testing Institute, Nanchang 330000, China)Abstract: From September 2018 to March 2019, 20 samples were taken from supermarkets and farmers’ markets every month, with a total of 140 beef and product samples taken. the positive rate of stx was 45.8%, and the positive rate of eae was 52.2%. The monthly positive rates of stx initial screening positive rates of 65%, 60%, 80%, 5%, 25%, 45%, and 40%, respectively; The positive rates of eae initial screening were 70%, 70%, 65%, 0%, 40%, 65%, and 55%, respectively. Four Shiga toxin producing Escherichia coli samples carrying the stx gene were detected, with a positive strain detection rate of 2.9%; From September 2018 to March 2019, 12 samples of enteropathogenic Escherichia coli carrying the eae gene were detected, with a positive strain detection rate of 8.6%.Keywords: Shiga toxin producing Escherichia coli; enterogenic Escherichi coli; separation; appraisal产志贺菌毒素的大肠杆菌（Shiga Toxin Producing Escherichia coli，STEC）和肠致病性埃希氏菌（Enterogenic Escherichi coli，EPEC）是世界上最重要的食源性病原体之一。
临床分离大肠埃希菌的耐药性分析
肛 周 的脓肿 之 间存 在 紧 密的联 系。经 统 计 ，２ ３ ０株 大肠埃 希 茵 出现 大部 分 Ｄ 一 内酰胺 类 药物耐 药率 ＞ ６ ５ ． ０ ％， 出现 喹诺 酮 类药物耐 药率 约
１ ， ２方法 ：药敏纸片及 培养基 ：哌拉西林 、头抱他 啶、哌拉西林 一他 唑 巴坦 、头孢噻肟 、氨曲南 、头孢 曲松 、头孢吡肟 、亚胺培 南、庆大 霉 素、美罗培南 、阿米卡星 、头孢 西丁、环丙沙星 、氯霉 素、阿奠西 林 一舒 巴坦和复 方磺胺 甲恶唑纸片以及Ｍｕ ｅ ｌ ｌ ｅ ｒ － Ｈ ｉ ｎ ｔ ｏ ｍＭＨ）培养基等
大 肠埃希 菌Ａ Ｔ Ｃ Ｃ ２ ５ ９ ２ ２ 选择 为Ｅ Ｓ Ｂ Ｌ ｓ 纸片法 予 以质 控菌 阴性和 阳性
的筛选 。
１ ． ３统计学 处理 ：本研究所有 数据资料均采用Ｗｈ ｏ ｎ ｃ ｔ ｏ ． ６ 进 行数据处理 及分析 ，一般资料 采用均数标准差 （ 孑 ± ｓ ）表示 ，计量资料 采用百分
生 予 以严格 的控制 ，对耐 药株 的流 行和 爆 发予 以预 防 。
【 关 键词 】 大肠埃 希杆 菌 ；耐 药性 ；临床 分 离 ；分析
中图分类号 ：Ｒ ４ ４ ６ ．— ８ １ ９ ４（ ２ ０ １ ６ ）３ ２ — ０ ０ ７ ６ — ０ ２
为６ ０ ． ５ ％， 出现 亚胺 培 南、美 罗培 南敏 感 率 约 ９ ９ ． ５ ％， 出现 头孢 哌 酮或舒 巴坦敏 感率 约 为 １ ０ ０ ． ０ ％。检 出 超广谱 Ｄ ・ 内酰胺 酶 （ Ｅ Ｓ Ｂ Ｌ ｓ ） 大
耐多药大肠埃希菌产AmpC酶基因型研究及耐药性分析
Multidrug-resistant Escherichia coli producing AmpC enzyme genotypes study and drug resistance analysis Abstract: Objective: Explore the region more resistant drug Escherichia coli (Escherichia coli, E.c oli) production plasmid AmpC beta-lactamase (AmpC enzyme) status and genotype distribution, yield analysis AmpC enzyme Escherichia coli antibiotic resistance to commonly used the characteristics for clinical rational use of antibiotics and prevent resistance genes to spread to provide the theory basis. Methods: Screening test early：screening test：Under the Clinical Laboratory Standards Agency (Clinical labora-tory Standards Insitute, CLSI) disk diffusion method recommended (kerby-Bauer, disk diffusion method) detected 71 Escherichia coli cefoxitin resistance, ie, the inhibition zone≤ 18mm suspicious of AmpC enzyme-positive strains.2.cefoxitin three-dimensional extract test：According to cefoxitinthree-dimensional extract test,whether by extracts of Escherichia coli beta-lactamase hydrolysis of cefoxitin (FOX) to determine whether AmpC enzymes to detect produced AmpC enzymes strains. Kerby-Bauer disk diffusion method : 71strains of Escherichia coli antibiotic susceptibility test to 10 antibiotics were performed by Kerby-Bauer disk diffusion method with the standard of NCCLS. A TCC25922 was used for quality control.The experiment method points:On a flat plate LB doing (37 ℃ incubation 24 hours) for the preparation of bacteria into and 0.5McIntosh standard pipe turbidity the same bacterium fluid, and the bacterium fluid in the uniform coating sterilization Mueller-Hinton culture medium surface, dry for several minutes, by sterile tweezers will drug susceptibility were flat piece of paper stick in the M-H culture medium surface, the distance between each piece of paper > 24 mm, pieces of > 15 mm from the flat. Will the culture dish with a piece of paper in 37 ℃incubation after 24 hours, with mm feet measurement bacteriostatic annulus diameters (bacteriostatic annulus to the edge of the naked eye can't see bacteria obvious growth limit),According to the size of the bacteriostatic annulus diameters reflect the bacteria on the determination of the drug test sensitive degree .Results: 2006 NCCLS standard to judge, and each test all use escherichia coli bacteria strains of the standard quality A TCC is 25922. 4.PCR technology:AmpC gene detection of three-dimensional test positive strains.References to specific design 6 primers, using common plasmid small mention kit extraction escherichia coli plasmid DNA for polymerase chain reaction (PCR) template .Each specimen use to design good respectively six primer amplification, positive amplification fragment length were 520 bp, 462 bp, 405 bp, 346 bp, 302 bp, 190 bp .PCR products were agarose gel electrophoresis, UV detector observations.5. Gene sequencing:Plasmid AmpC enzyme gene amplification-positive strains, respectively, to take the PCR amplification products the nucleic quantitative instrumentmeasured the DNA concentration> 300ug/ml, and sent to Shanghai Sangon biotechnology companies were sequenced. Results: 1. 11 strains harboring AmpC were screened, and 8(11.27%) strains were found by cefoxitin three-dimensional extract test. 2.Antimicrobial susceptibility test results:71 Escherichia coli susceptibility results show the whole sensitive to imipenem, amikacin, cefoxitin, aztreonam, cefepime, sensitive rate is higher are more than 59.15%, lower cephalosporincefotaxime, streptomycin, gentamicin, ciprofloxacin, levofloxacin. Multi-drug resistant strains, 24 (33.80%) and 35 double-resistant strains dominated (33.80%), including the mode of multi-drug resistance phenotype of GEN + CTX + LEV (16 strains, 22.54%)-based. Resistant strains producing AmpC enzyme and non-producing AmpC strain rate: AmpC producing strains of a variety of commonly used antibiotics resistance rates significantly higher than non-AmpC producing strains (χ 2 test, P <0.05).4.PCR detected by plasmid AmpC enzyme gene situation: three-dimensional experimental 8-positive strains for PCR amplification, two positive, sequencing results showed that the two are DHA-1 type.Conclusions: 1. In the region of clinical isolates of Escherichia coli producing ESBLs situation is more serious, the AmpC enzyme is relatively small, and the phenomenon of multiple drug resistance has emerged. 2 in the region of the Escherichia coli plasmid-mediated AmpCenzyme genotypes of DHA-1, resistant strains producing AmpC enzyme was significantly higher than non-AmpC producing strains. (3) in the region of Escherichia coli detected the two suspected SSBLs, the genotype combination of both DHA-1 AmpC and CTX-M type of ESBLs.Key words: Escherichia coli; AmpC gene; multi-drug resistant前言大肠埃希菌为革兰氏阴性杆菌，属于肠杆菌科，是寄居于人和动物肠道中的正常菌群之一。
产志贺毒素大肠埃希菌感染治疗的研究进展
产志贺毒素大肠埃希菌感染治疗的研究进展
郭沁园;方芳;刘伟佳;薛云新;王岱
【期刊名称】《中国抗生素杂志》
【年(卷),期】2022(47)12
【摘要】产志贺毒素大肠埃希菌是一种常见的食源性病原菌,近年来世界各地都有产志贺毒素大肠埃希菌的疫情暴发,但是目前临床上却没有可以有效治疗这种细菌感染的方法。
产志贺毒素大肠埃希菌产生的志贺毒素容易使患者出现溶血性尿毒综合征等并发症,大大增加了病原菌感染治疗的难度。
本文主要就近年来产志贺毒素大肠埃希菌感染治疗方面的研究进展进行综述,以期为研究有效的治疗方法提供新思路。
【总页数】7页(P1242-1248)
【作者】郭沁园;方芳;刘伟佳;薛云新;王岱
【作者单位】分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室
【正文语种】中文
【中图分类】R978.1
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5.志贺毒素抗体对产志贺毒素大肠埃希菌感染的防治作用
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产质粒介导ampc酶大肠埃希菌的耐药性及相关耐药机制
ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＭＩＲ－ｌｉｋｅ Ｗａｓ ｏｎ ａ ５４一ｋｂ ｐｌａｓｍｉｄ．
ｅｎｚｙｍｅ Ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｉｓ
ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｉｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ ｂｒｏａｄ·ｓｐｅｃｔｒｕｍ
１３－１ａｃｔａｍｓ．Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ｔｈｉｓ Ｂ－ｌａｃｔａｍａｓｅ ｆｏｒ ｃｅＲａｚｉｄｉｍｅ ｗａｓ ｑｕｉｔｅ ｌｏｗ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ
安徽医科大学硕士学位论文
采用超声破碎法进行产新酶细菌转化株的粗酶提取，等电聚焦电泳测定其等 电点（ｐＩ）。对粗酶纯化后，ＳＤＳ．ＰＡＧＥ和考马斯蓝染色测定新酶分子量大小，进 行酶促反应动力学研究，以初步了解新酶的动力学特性。
采用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ试验再次验证新酶是否由质粒介导并定位其编码基因所 在质粒大小。
ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ １３－１ａｃｔａｍａｓｅ ａｓｓａｙｓ，ａｎｄ ｃｈｅｃｋｅｄ ｂｙ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ—ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ—ＰＡＧＥ）ａｎｄ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ． Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ Ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｒｅｖｅａｌ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ｏｎ ａ ｐｌａｓｍｉｄ．
ｌｏｗｅｓｔ ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｆｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｍｅａｓｕｒａｂｌｅ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ·
Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｗｉｌｄ—ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎｓ，ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ ｈａｄ ｄｅｃｒｅａＳｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ
大肠埃希菌耐药性分析及超广谱β-内酰胺酶基因检测39
大肠埃希菌耐药性分析及超广谱β－内酰胺酶基因检测摘要】目的了解自贡市第一人民医院临床分离的大肠埃希菌的耐药情况及超广谱β－内酰胺酶（ESBLs）基因的存在状况。
方法对2009年8月～2010年8月临床分离的154株大肠埃希菌用表型确证试验检测ESBLs，用Kirby-Bauer琼脂扩散法做药物敏感试验，并采用聚合酶链反应（PCR）检测SHV、CTX-M基因。
结果 154株大肠埃希菌中耐药率最高的是氨苄西林（83.12%），其次是头孢唑林（65.58%），亚胺培南、美罗培南全敏感；ESBLs菌株检出率为51.95％；基因检测结果为SHV 5株 CTX-M 70株，SHV+CTX-M 3株。
结论该院大肠埃希菌株对β－内酰胺药物表现出较高的耐药率，且ESBLs基因检出率也较高，故临床应加强对大肠埃希菌耐药性及耐药基因的监测，严格掌握抗生素的使用指征，防止耐药菌株的传播流行。
【关键词】大肠埃希菌耐药性超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）基因大肠埃希菌是临床分离的革兰阴性杆菌中最常见的菌种，它作为重要的条件致病菌广泛存在于自然界。
尤其是超广谱β－内酰胺酶(extend spectrum beta-lactamases，ESBLs)的出现引起了医院感染的爆发流行。
本研究收集2009年8月～2010年8月本院临床分离的154株大肠埃希菌，通过表型确证试验、药物敏感试验及PCR技术，了解本地区大肠埃希菌的耐药情况及超广谱β－内酰胺酶（ESBLs）基因的存在状况。
1 材料和方法1.1 菌株实验菌株：154株大肠埃希菌临床分离株（不含同一病例相同部位重复分离株）来自自贡市第一人民医院2009年8月-2010年8月期间感染大肠埃希菌的患者。
其中泌尿系统感染84例，呼吸道感染30例，全身感染19例，外科切口感染13例，其他感染8例；全部菌株均重新经VITEK系统（BioMerieux，法国）鉴定确认。
标准菌株：大肠埃希菌ATCC25922 （购自杭州天和微生物试剂有限公司）1.2 试剂抗生素药敏纸片：氨苄西林、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶、头孢西丁、庆大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、亚胺培南、美罗培南、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟/克拉维酸。
菏泽地区猪源产肠毒素大肠埃希菌的分离鉴定及耐药性分析
温海燕．菏泽地 区猪源产肠毒素大肠埃希 菌的分 离鉴定及耐 药性分析［ Ｊ ］ ．江苏农业科学 ， ２ ０ １ ３ ， ４ １ （ ９ ） ： １ ９ ７—１ ９ ８
菏 泽地 区猪源产肠毒素大肠埃希菌 的分离鉴定及耐药性分析
温 海 燕
从菏泽地区 １ １ 个 发 病 猪 场 采 集 典 型
２ 结 果 与分 析
２ ． １ 小肠 黏 膜 涂 片镜 检 结 果
１ ． １ ． １ 发病材料来源
黄、 白痢病死仔猪的小肠及肠 内容物。 １ ． １ ． ２ 培养基 、 试剂 普通琼 脂培养基 、 伊红美蓝选择培养 基、 麦康凯培养基均购 自北京奥博星生物技术 有限责任公 司； 生化试剂 和药 敏纸片购 自杭州天和微生 物试剂有 限公司 ； 标 准单因子 ０血清购 自中国兽 医药 品监察所。
素、 链霉素具有不 同程度的敏感性 ； 对土霉素和四环素耐药 ， 对 其余 １ １ 种抗 生素也有 不同程度 的耐药性 。结果 表明 ， 丁胺卡那霉 素、 多黏菌素 Ｂ可作为该地区预防该疾病 的首选药物 ， 其他 药物须减少 或暂停使用 。 关键词 ： 猪； 产肠 毒素大肠 埃希菌 ； 分离 ； 鉴定 ；份小肠黏膜涂片均看到大量 的红色短杆 菌存 在 ， 结合 病死 猪 的症 状 、 病变 可判定 猪肠 道 内存在 产肠 毒素 大肠 埃 希菌 。
２ ． ２ 细菌分 离
１ ． ２ ． １ 小肠黏 膜涂 片
采集 ３ ５头病死猪 的小肠 ， 分别 在离
经鉴别培养和涂片 、 染色 、 镜检 ， 从３ ５份小肠 内容物病 料 中分 离得 到 ３ ５株大肠埃希菌。
细 菌 进 行 常 规 的 生 理 生 化鉴 定 。
产志贺毒素大肠埃希菌的分子生物学鉴定和耐药性分析
产志贺毒素大肠埃希菌的分子生物学鉴定和耐药性分析1李咏梅，李凡吉林大学基础医学院病原生物学教研室, 1320011E-mail：mayflower380@摘 要：本文采用多重PCR（multiplex PCR, mPCR）法对产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC）分离株进行毒力基因的分子生物学鉴定；用WHO 推荐的K-B法对分离株进行抗生素的敏感性测定，以了解stx1、stx2、eaeA、hlyA 4种毒力基因的分布情况，以及分离株对18种抗生素的敏感性。
结果显示产志贺毒素的大肠埃希菌共有46株，其中两种毒素均产生的有22株（47.8%）；单纯产生stx1的有16株（36.9%），stx2的有8株（17.4%）；四种毒力基因均存在的有19株（41.3%），血清型为O157:H7，而非O157:H7血清型的菌株（23/46）中，4种毒力基因同时存在的仅有3株（6.6%），但有13株（56.9%）hlyA基因阳性。
全部STEC对复方新诺明耐药，对链霉素耐药率为28.3%，氨苄西林为30.4%，红霉素为69.6%，而且有5株对至少4种以上抗生素多重耐药，耐药谱为复方新诺明-链霉素-红霉素-氨苄西林。
非O157型 STEC耐药菌次为122， 而O157 型为63。
实验结果证明mPCR法可以快速检测STEC特征性毒力基因，以判定其致病性能。
非O157型STEC对抗生素较易形成耐药性。
关键词：STEC；鉴定; 耐药性1．引言STEC是世界上人类食物中毒的重要致病因子，也是引起大规模食源性食物中毒的主要病原菌[1]。
STEC中有100余个血清型的致病性大肠杆菌可以致病，主要血清型是O157H7，可引起非出血性腹泻，出血性结肠炎（haemorrhagic colitis, HC），溶血性尿毒综合症(haemolytic uraemic syndrome, HUC)。
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产志贺毒素大肠埃希菌的分子生物学鉴定和耐药性分析1李咏梅，李凡吉林大学基础医学院病原生物学教研室, 1320011E-mail：mayflower380@摘 要：本文采用多重PCR（multiplex PCR, mPCR）法对产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC）分离株进行毒力基因的分子生物学鉴定；用WHO 推荐的K-B法对分离株进行抗生素的敏感性测定，以了解stx1、stx2、eaeA、hlyA 4种毒力基因的分布情况，以及分离株对18种抗生素的敏感性。
结果显示产志贺毒素的大肠埃希菌共有46株，其中两种毒素均产生的有22株（47.8%）；单纯产生stx1的有16株（36.9%），stx2的有8株（17.4%）；四种毒力基因均存在的有19株（41.3%），血清型为O157:H7，而非O157:H7血清型的菌株（23/46）中，4种毒力基因同时存在的仅有3株（6.6%），但有13株（56.9%）hlyA基因阳性。
全部STEC对复方新诺明耐药，对链霉素耐药率为28.3%，氨苄西林为30.4%，红霉素为69.6%，而且有5株对至少4种以上抗生素多重耐药，耐药谱为复方新诺明-链霉素-红霉素-氨苄西林。
非O157型 STEC耐药菌次为122， 而O157 型为63。
实验结果证明mPCR法可以快速检测STEC特征性毒力基因，以判定其致病性能。
非O157型STEC对抗生素较易形成耐药性。
关键词：STEC；鉴定; 耐药性1．引言STEC是世界上人类食物中毒的重要致病因子，也是引起大规模食源性食物中毒的主要病原菌[1]。
STEC中有100余个血清型的致病性大肠杆菌可以致病，主要血清型是O157H7，可引起非出血性腹泻，出血性结肠炎（haemorrhagic colitis, HC），溶血性尿毒综合症(haemolytic uraemic syndrome, HUC)。
但是，近年来非O157H7 STEC引起的HC、HUC在逐年增加。
由于E.coli O157H7不发酵山梨醇而比非O157H7STEC容易鉴定，所以非O157H7STEC 常被人们所忽视。
而STEC致病的特征性毒力因子是1型志贺毒素（Shiga toxin type1, stx1）和2型志贺毒素（Shiga toxin type2, stx2）,分别由stx1基因编码和stx2基因编码。
然而，其他毒力因子如由eaeA基因编码的紧密素（intimin）也称黏附抹平因子（attachment and effacement factor）；由hlyA基因编码的溶血素（hemolysin）等也是重要的毒力因素[2]。
因此，用多重PCR技术对标本进行STEC毒力基因的鉴定，不仅可作特征性鉴定，而且还可对其潜在的致病性能作出前瞻性判定。
1本课题为高等学校博士学科点专项科研基金资助课题，编号为30271251-1-尽管STEC所引起的腹泻多数是自限性的，但是早期应用抗生素进行治疗，可以减少发展成HUC的病历。
但是不良后果则是EHEC多药耐药菌株的增加[3]。
为了了解STEC在各种来源标本中的分布及毒力基因存在情况，及分离株对临床常用抗生素的敏感性，本文作如下报告：2．材料和方法1.1材料1.1.1试验标本取自于长春市、吉林市儿童医院住院腹泻患儿粪便，长春市、吉林市防疫站提供的食品、水源、动物粪便中初分离出的大肠埃希菌。
1.1.2 质控菌株 大肠埃希菌ATCC25922，金黄色葡萄球菌ATCC25923，铜绿假单胞菌ATCC27853，吉林大学基础医学院病原生物学教研室提供。
1.1.3试剂 PCR用试剂均购于北京鼎国生物技术发展中心，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。
药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司，批号200208。
1.1.4仪器 PCR扩增仪（新加坡）；UV WHITE-2020D凝胶成像系统；DY-WI恒压恒流水平电泳仪（北京）。
1.2方法1.2.1标本分离和处理 对临床采集的腹泻患者粪便标本，动物粪便标本1g用Cary-Blair 培养基运送，实验室初步分离出可疑为大肠埃希菌；环境和食品标本1g先行肉汤增菌，后接种麦康凯培养基。
上述菌株均经37℃培养18h-20h，用接种环取2-3个可疑菌落，置500μl灭菌双蒸水或生理盐水中，混匀，100℃煮沸10-15min，振荡混匀，13 000g离心1min，上清液即可用于PCR模板。
1.2.2 mPCR鉴定 STEC的四种毒力基因的引物序列及扩增片段的大小见表1[1]mPCR的反应总体积为50ul，在0.5ml反应管中依次加入10×buffer ，0.2mmol/l 的dNTPs，10pmol的引物每条1.5ul,TaqDNA酶1U,模板2ul，双蒸水补至50ul。
设阳、阴性对-2-照。
反应程序为94℃7min变性模板DNA，94℃1min,56℃1min,72℃1min，30个循环，最后72℃延伸5min。
PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，分子量100-1200bp的Marker作参照，EB染色后用琼脂糖凝胶成像软件分析系统检测和分析结果。
（见图1）对鉴定为STEC的菌株进行血清型分型，大致分成Ｏ157和非Ｏ157两群。
1.2.3 STEC的耐药性监测 采用WHO推荐的K-B法对分离鉴定的全部STEC菌株，进行18种常用抗生素的药物敏感试验，结果依照NCCLS判定[3][7]。
3.结果3.1 STEC的分子生物学鉴定从各种标本中分离出可疑大肠埃希菌112株，经mPCR鉴定出能产生志贺毒素的菌株46株，来源遍布人、动物粪便，污水，食品，数量上无显著性差异。
其中两种毒素均产生的有22株（47.8%）；单纯产生stx1的有16株（36.9%），stx2的有8株（17.4%）；四种毒力基因菌存在的有19株（41.3%）。
46株STEC中有23株为O157H7，23株非O157H7 。
23株O157型STEC中，有19株（82.6%）stx1、stx2、eaeA、hlyA基因均阳性；而非O157中仅有3株（6.6%）stx1、stx2均阳性，eaeA基因阳性1株（2.2%），hlyA基因阳性13株（56.9%）。
即非O157菌株中hlyA基因的携带率要高于eaeA基因。
见表2表2 46株STEC四种毒力基因的分布情况基因型菌株数(n) 血清型构成比（%）O157:H7 41.3stx1＋stx2＋eaeA＋hlyA 192.2non-O157stx1＋stx2＋hlyA 1stx1＋stx2 2 non-O157 4.3stx1 5 non-O157 10.9stx2 2 non-O157 4.323.9 stx1＋hlyA 11non-O1578.8stx2＋eaeA＋hlyA 4O157:H7stx2＋hlyA 1non-O1572.2non-O1572.2 stx2＋eaeA 11 2 3 4 5 6 7 8 9 10图1 STEC毒力基因的分布1和9为Marker，2为阳性对照，10为阴性对照，3-8为待测菌株。
-3-3.2药物敏感试验46株STEC，在所采用的18种临床常用抗生素的测试中，对复方新诺明（SXT）、氨苄西林（AM）、链霉素（S）、红霉素（E）氨曲南（AZT）耐药率较高，对其余抗生素耐药率较低。
所有菌株对SXT耐药，并且存在多重耐药，耐药谱为复方新诺明-链霉素-红霉素。
在23株O157型STEC中6株（26.1%）对链霉素，3株（13.0%）对氨苄西林耐药。
15株（65.2%）对红霉素耐药。
在23株非O157型STEC中7株（30.4%）对链霉素耐药，11株（47.8%）对氨苄西林耐药，17株（73.9%）对红霉素耐药，至少有5株达到耐4种以上的抗生素，方式为复方新诺明-链霉素-红霉素-氨苄西林。
与O157型相比，仅存在对氨苄西林耐药性的差异P＜0.05。
非O157型STEC的耐药总菌次为122株，而O157型为63株。
详见表3表3 46株STEC对抗生素的敏感试验结果抗生素敏感耐药R（%）氯霉素（C） 442 4.34（2* 2） 8.7 奈替米星（NET） 4210（5* 5） 21.7氨曲南（AZT） 36奥格门丁（AMX/CA） 39 7（2* 5） 15.2 头孢克罗（CEC） 397（2* 5） 15.246（23*23） 100复方新诺明（SXT） 0哌拉西林（PIP） 406 13.04 8.7头孢吡肟（FEP） 426 13.0头孢噻吩（CF） 405 10.9头孢曲松（CRO） 416 13.0头孢唑啉（CZ） 406 13.0庆大霉素（GM） 409（4* 5） 19.6 四环素（TE） 37红霉素（E） 1432（15* 17） 69.63 6.5呋喃妥因（FT） 435（1* 4） 10.9 诺氟沙星（NOR） 4114（3* 11） 30.4氨苄西林（AM） 32链霉素（S） 3313（6* 7） 28.3 注：*为O157型STEC耐药株4．讨论STEC所产生的志贺样毒素（Shiga-like toxin, SLT）是引起Vero细胞变性、坏死的毒素，是介导致病的主要因素，而LEE（locus of enterocyte effacement）致病岛所携带的eaeA基因编码产生的紧密素蛋白可以促使细菌粘附于肠黏膜细胞[4]，以及hlyA基因编码产生的溶血素都可增强本菌的毒性。
传统的鉴定方法包括营养培养、菌落选择、生化反应特性和志贺毒素的鉴定[5]，需要几-4-天的时间才能完成STEC的鉴定。
本试验用多重PCR法可同时检测四种致病的毒力基因，这不仅可了解两型志贺毒素共同或单独存在的情况，而且还可以检测到另外两种毒力基因与之并存的状态。
实验结果表明，在产志贺毒素的大肠埃希菌中，主要的血清型确实为O157[6]，而且4种毒力基因并存的几率也很高。
本试验所获得的非O157型的STEC株中stx1、stx2、hlyA 基因存在的百分率分别可达41.3%、13.2%和56.7%，故非O157型STEC的致病性确实不容忽视。
因此采用多重 PCR可以快速、特异地筛选标本中的STEC并对其潜在的致病性能给以评价。
本试验从环境标本（污水）、家畜、家禽粪便以及食品中也分离鉴定出一定数量的STEC，并检测到耐药性的存在。
提示应该加强食品卫生的监督和管理以及合理在家养动物中使用抗生素，以减少食源性STEC型食物中毒的可能性和抗生素的选择压力。
对致病性大肠埃希菌引起的临床病症，及时投用敏感的抗生素，对减轻症状、延缓病程起着重要的作用。
因此经常了解细菌的耐药趋势和抗菌药物选择压力，将经验用药改变为根据细菌药敏试验结果使用抗生素，避免滥用抗生素，从而减少耐药菌株产生及耐药的严重程度。