产志贺毒素大肠杆菌流行病学和stx基因研究进展
１１３０ 中国人兽共患病学报 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ
文章编号：１００２—２６９４（２Ｏ１１）１２—１１３Ｏ一０５
产志贺毒素大肠杆菌流行病学和ｓｔｘ基因研究进展
周 勇，陈守义
中图分类号：Ｒ３７８．２ １ 文献标识码：Ａ 感染产志贺毒素大肠埃希菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ—ｐｒｏ— ｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，ＳＴＥＣ）能引起人严重的疾
病，包括：出血性肠炎（Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｃｏｌｔｉｓ，ＨＣ）、血 栓性血小板紫癜（ＴＴＰ）和溶血性尿毒综合症（Ｈｅ— ｍｏｌｙｔｉｃ—ｕｒｅｍｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＨＵＳ）甚至死亡ｌｌ。ｊ。
目前发现可引起人类感染的ＳＴＥＣ有４７２种血
清型，但经常引起人患病的血清型不到１０种。Ｋａｒ ｍａｉｌ等 推荐根据血清分型和致病力强弱将ＳＴＥＣ
从Ａ到Ｅ分成５个型别。Ａ型为致病力最强的血 清型；包括Ｏ１５７：Ｈ７和Ｏ１５７：ＮＭ。Ｂ型为能引
起严重疾病和暴发流行但感染发生率较Ａ型低的
血清型；例如：０２６：Ｈ１１，Ｏ１Ｏ３：Ｈ２，Ｏ１１１：ＮＭ， Ｏ１２１：Ｈ１９和（）１４５：ＮＭ。Ｃ型与散发的ＨＵＳ
有关，很少引起暴发流行；包括：０９１：Ｈ２１和Ｏ１１３ ：Ｈ２１。Ｄ型通常只引起人腹泻的散发病例，Ｅ型
包括其它与人疾病无关的ＳＴＥＣ血清型。Ｓｃｈｅｕｔｚ 等［６ 建议以毒力基因图谱将ＳＴＥＣ分为３组。第１
组包括能引起ＨＵＳ和或能引起暴发流行的ＳＴＥＣ；
第２组由可引起人腹泻但不发生ＨＵＳ的ＳＴＥＣ组
成；第３组为引起动物疾病的ＳＴＥＣ。
１ ＳＴＥＯ流行病学概况 ＳＴＥＣ感染是动物源性疾病，反刍动物是
ＳＴＥＣ的自然宿主，其中牛是最重要的宿主ｌ７ （在 澳大利亚，绵羊是重要宿主＿ｇ ）。研究发现除了牛，
羊、猪、猫、鹿、马、狗、家禽和野禽等都可分离到 ＳＴＥＣ［９。。 。目前发现有超过４３５种血清型ＳＴＥＣ 分离自牛，牛由于缺少志贺毒素（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ，Ｓｔｘ）
受体所以不致病 ］。牛粪便中ＳＴＥＣ分离率与
季节有关，夏季分离率较高，相应夏季人类感染
ＳＴＥＣ患病率也随之升高 。。 。此外，未断奶的小
牛ＳＴＥＣ分离率较低，断奶后到成年之间的时段分 离率最高，成年后的分离率下降至中等口 ｊ。
人感染ＳＴＥＣ通常经过进食生的或未熟的肉
类、生牛奶或者生食被污染的蔬菜水果而发病，也有
＊广州市医药卫生科技项目（２００９一ＹＤ１２５）和广州市卫生局医药卫 生科技重点项目（２００６一Ｚｄｉ一１１）联合资助 作者单位：广州ｉ市疾病预防控制中心，广州 ５１０４４０ 在屠宰牲畜和生肉加工时被感染 。有研究表明 低于１００ＣＦＵ的ＳＴＥＣ就能引起人致病，因此直接 接触患者也可引起继发感染 。
２００７—２００９年，欧盟各成员国每年检测超过一 万份牛肉样本，ＳＴＥＣ的检出率为０．３ ～２．３ ，
其中Ｏ１５７：Ｈ７的检出率为０．１ ～０．７ 。相比
较而言，在蔬菜和水果中的检出率则低很多，分别是 ＳＴＥＣ ０．１９ 和Ｏ１５７：Ｈ７ ０．１４ ［ｅｅｌ。在英国、加 拿大、新西兰和泰国等ＳＴＥＣ检出率为９ Ｖ０～
ｌ２ ¨２ ］，美国华盛顿州的３份研究中，ＳＴＥＣ的检 出率分别是１ 、１７ ９／６、２３ Ｅ２７ ２９］。在阿根廷，Ｐａｒａ— ｍａ等 叩从５Ｏ份碎牛肉中检出１５份ＳＴＥＣ阳性标
本，在印度，Ｋｈａｎ等从１１１份碎牛肉中查出近５ｏ
样本为ＳＴＥＣ ＰＣＲ阳性 。 不同国家甚至一国不同地区的检出率都存在一
定差异，有的可能与流行趋势有关，但也存在实验技 术方面的原因，比如采样方法的不同、样本数量的大
小和样本的选择以及检测技术的不同（到现在还没
有统一的ＳＴＥＣ特别是非０１５７ ＳＴＥＣ的检测标 准），此外很多研究主要关注Ｏ１５７：Ｈ７的检测。
这些差异造成各实验室数据很难进行比较研究。 由于Ｏ１５７：Ｈ７是ＳＴＥＣ中致病力最强、流行
趋势最广、发病率最高的血清型，因此在ＳＴＥＣ流 行病学研究中，经常将０１５７ ＳＴＥＣ和非Ｏ１５７
ＳＴＥＣ分成２类来进行分析。自１９８２年美国首次 报道Ｏ１５７：Ｈ７暴发流行以来，近３０年不断有
Ｏ１５７：Ｈ７在全球暴发流行和散发病例的报道［３ 。 １９９３年美国发生了一次涉及到４个州７００余名儿
童的Ｏ１５７：Ｈ７暴发，其中４１例发生ＨＵＳ，４例死 亡ｌ３引。１９９６年５—８月在日本发生的Ｏ１５７：Ｈ７暴 发流行，患者９ ０００余名，死亡９人［３ 。 。１９９９—
２０００年我国苏皖等地发生的Ｏ１５７：Ｈ７大规模暴
发流行，患者约２万人，发生急性肾功能衰竭者１９５ 人，死亡人数１７７人 。而近十年非Ｏ１５７ ＳＴＥＣ
血清型也不断有感染流行的报道。此次始于德国的 Ｏ１０４：Ｈ４暴发流行，涉及１３个国家，感染４ １２５
人，发生ＨＵＳ ８９２例，死亡４９人（２０１１年７月１日 数据），是迄今为止非Ｏ１５７
ＳＴＥＣ感染暴发流行最 １２期 周 勇等：产志贺毒素大肠杆菌流行病学和５ｔ：Ｖ基因研究进展 １１３１
严重的一次 。 在北美ＳＴＥＣ ０２６、０４５、ＯｌＯ３、Ｏ１１１以及
Ｏ１２１是最常引起感染的非Ｏ１５７血清型；在欧洲则 以０２６、０１０３、０９１、Ｏ１４５为主ｌｌｌ引。欧盟ＣＤＣ汇总 各欧盟成员国上报的２００８—２００９年ＳＴＥＣ感染病
例，其中０１５７感染占５ｌ ～５３ ，０２６占５．３ ～ ５．４ ，０１０３ ２．３ ～２．８ ，０９１ １．３ ～１．６％， ０１４５ １．３ ～１．６ ，未分型及不能分型的占 ２５．９ ～２８．２ ［ Ｊ
ＳＴＥＣ感染导致ＨＵＳ的病例中接近７５ 发生 在儿童，其中年龄低于１Ｏ岁的儿童最易感。１５ 感
染ＳＴＥＣ后有腹泻症状的儿童会发展成ＨＵＳ，５０％ 的ＨＵＳ患者最终导致肾衰需要血液透析治疗，而
ＨＵＳ致死率接近５ ［３刚 。２００９年Ｈｅｄｉｃａｎ在美
国明尼苏达州对Ｏ１５７和非Ｏ１５７ ＳＴＥＣ感染的特 征进行比较，发现Ｏ１５７感染导致的出血性腹泻
（７８ 比５４ ）、ＨＵＳ（７ 比０ ）和入院率（３４ 比
８ ９／６）都比非Ｏ１５７高。同时发现只有当Ｏ１５７菌株
携带ｓｔ３： 基因时发生出血性腹泻和入院率比非 Ｏ１５７高。此外，在检测到的非０１５７中，７４ 的血
清型属于０２６、Ｏ１０３、Ｏ１１１、０１４５、０４５等５个血清 型 。Ｇｏｕｌｄ在另一项研究中也比较了２者的
ＨＵＳ发生率（０１５７ ６．３ 比非０１５７ １．７ ）、入院
率（０１５７ ４２ 比非０１５７ １２ ）、死亡率（０１５７ ０．６ 比非Ｏ１５７ ０。ｌ％）。而在这项研究中，８２ 的
非Ｏ１５７菌株属于Ｏ２６、Ｏ１１１、Ｏ１０３、０１２１、Ｏ１４５、
０４５等６个血清型 。 ２００５—２００９年，欧盟成员国共有１６ ２６３份人感
染ＳＴＥＣ的病例报告。其中在２００９年有３ ５７３份
确认病例，发病率是每十万人０．７５。发病率最高的 是爱尔兰，。９年确认病例２３７份，发病率为每十万
人５．３３；其次是丹麦。确认病例１６０份，发病率每十 万人２．９。在２００７—２００９年，９ ６３７份确认病例中
５４８份发生ＨＵＳ（占６ ），其中７ｌ 由（）１５７引起，
１５％由０２６引起。２００６—２００９年，欧盟成员国每年 因为ＳＴＥＣ感染而致死的人数是２～６人 。
２ ｓｔｘ基因及其分型概述 志贺毒素（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ，Ｓｔｘ）由位于ＳＴＥＣ染色
体上的前噬菌体携带的ｓｔａ－基因编码。Ｓｔｘ是
ＳＴＥＣ的主要毒力因子，包括２个没有抗原交叉反 应的Ｓｔｘｌ（ＶＴ１）和Ｓｔｘ２（ＶＴ２）。１９７７年，
Ｋｏｎｏｗａｌｃｈｕｋ等 发现某些大肠杆菌可产生一种
对非洲绿猴。肾细胞有致死作用的细胞毒素，将其命
名为Ｖｅｒｏ细胞毒素（Ｖｅｔｏ ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ，ＶＴ）。ＶＴ属 于Ｓｔｘ家族，包括Ｉ型痢疾志贺菌表达的Ｓｔｘ以及
ＶＴ１、ＶＴ２。ＶＴ１与Ｉ型痢疾志贺菌表达的Ｓｔｘ的 序列同源性达９９ 。由于ＶＴ与Ｓｔｘ的高度同源
性，一开始它们也被命名为志贺样毒素Ｉ型（Ｓｈｉｇａ—
ｌｉｋｅ ｔｏｘｉｎ Ｉ，ＳＩ Ｔ Ｉ）和志贺样毒素Ⅱ型（Ｓｈｉｇａ—ｌｉｋｅ ｔｏｘｉｎ １Ｉ，ＳＩ Ｔ １Ｉ）。ｌ ９９４年，０’Ｂｒｉｅｎ推荐ＳＬＴ和 ＶＴ都可以用来命名大肠杆菌产生的志贺毒素。２ 年后，Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄ建议取消Ｓｈｉｇａ—ｌｉｋｅ ｔｏｘｉｎ名称中
的“ｌｉｋｅ”，直接使用Ｓｔｘ来命名志贺毒素同时ＶＴ的
命称保留并可与８ｔｘ互换。此后，这一建议被广泛 采用… 。 目前研究发现Ｓｔｘｌ和Ｓｔｘ２都有变种，Ｓｔｘｌ有 ２个变种ＳｔｘｌＣ和Ｓｔｘｌｄ［４ ，Ｓｔｘ２至少有１２种变种
（Ｓｔｘ２ｃ、Ｓｔｘ２—０１ １ ３、Ｓｔｘ２—０４８、Ｓｔｘ２ｖｈ—ａ、Ｓｔｘ２ｖｈ—ｂ、
Ｓｔｘ２ｄ—ＯＸ３、Ｓｔｘ２ ＯＸ３ｂ、Ｓｔｘ２ｄ－Ｏ１ １ １、Ｓｔｘ２ｄ—Ｏ１ １８、 Ｓｔｘ２ｅ、Ｓｔｘ２一ＮＶ２０６和Ｓｔｘ２ｇ），并不断有新的变种 被发现 怕 。Ｂｅｒｔｉｎ 钉用ＰＣＲ扩增编码Ｓｔｘ２ Ｂ亚
单位的基因片段，然后用Ｈａｅ１１１、Ｒｓａ Ｉ、Ｎｃｉ １分别
酶切扩增的基因片段，通过酶切产生的片段大小来 对ｓｔｘ。进行分型。现在这种ＰＣＲ—ＲＦＩ Ｐ方法是常 用的ｓｔｘ分型方法。ＢｅｕｔｉｎＬ４副则用ＢｓｔＥ１Ｉ、Ｈａｅ ＩＩ、
Ｐ ＭＩ酶切编码Ｓｔｘｌ Ｂ亚单位的ＰＣＲ扩增产物 将Ｓｔｘｌ的编码基因分成８ｔ．Ｚ＂ 、 １ ｓｔｘ ｄ等３种亚
型。 ＳＴＥＣ由于血清型众多，单从血清分型无法得
到菌株携带毒力基因的情况也就无法判断菌株致病
力的强弱，因此利用分子生物学方法对ＳＴＥＣ菌株
的毒力基因进行分型是常用的ＳＴＥＣ分型方法。 除了上述的ＰＣＲ—ＲＦＩ Ｐ方法，ＰｅｒｓｓｏｎＬ４ 等使用２
对引物对ＳｔｘＡＢ。操纵子的部分特异性片段（４９１ ｂｐ）进行扩增，然后测序，再将序列与ＧｅｎＢａｎｋ上的
序列进行对比，结果发现该方法可以对ｓｔ．ｚ＂ 基因进 行分型。测序方法可以避免ＰＣＲ—ＲＦＬＰ分型的某
些缺陷。比如序列中存在单核苷酸的改变、酶切片段
太小以至电泳无法分辨或者存在相同大小的片段 等。在此研究中，Ｐｅｒｓｓｏｎ采用Ｓｃｈｅｔｕｚ的建议对
ＳＴＥＣ菌株采用（）血清型加菌株名称加ｓｔｘ。基因型
的模式进行分型。利用这一原则，Ｐｅｒｓｓｏｎ等将２５５ 株从患者中分离到的ＳＴ ＥＣ分成１２个亚型。其中，
Ｓｔｘ２一Ｏ１５７一ＥＤＩ ９３３、 Ｓｔｘ２—０４８—９４Ｃ、 Ｓｔｘ２ｃ－Ｏ１５７一 ＦＩ Ｙ１６、Ｓｔｘ２ｃ Ｏ１５７一Ｃ３９４—０３、Ｓｔｘ２一Ｏ１５７一ＥＤＩ ９３３＋
Ｓｔｘ２ｃ一（）１５７ ＦＩ Ｙ１６、Ｓｔｘ２一Ｏ４８—９４Ｃ＋Ｓｔｘ２ｃ￣（）ｌ５７一
ＦＩ Ｙ１６分离自ＨＵＳ患者。此外，ＰＦＧＥ在相同血 清型菌株之间的分型可以用于流行病学调查和感染
溯源。
牛肉样品中产志贺毒素大肠埃希氏菌和肠致病性大肠埃希氏菌的分离鉴定
CHINA FOOD SAFETY 121分析检测牛肉样品中产志贺毒素大肠埃希氏菌和肠致病性大肠埃希氏菌的分离鉴定朱应飞，聂 翔，熊丽霞，吴学平，占忠旭，匡佩琳（江西省检验检测认证总院食品检验检测研究院，江西南昌 330000）摘 要：于2018年9月—2019年3月，每个月从超市和农贸市场中抽取20个样本，共抽取140个牛肉及制品样本，在qPCR初筛时stx阳性率为45.8%，eae的阳性率为52.2%。每月的stx初筛阳性率分别为65%、60%、80%、5%、25%、45%和40%；eae初筛阳性率分别为70%、70%、65%、0%、40%、65%和55%。检出携带stx基因的产类志贺毒素大肠埃希氏菌样本4份，样本阳性菌株检出率为2.9%；检出携带eae基因的肠致病性大肠埃希氏菌样本12份，样本阳性菌株检出率为8.6%。关键词：产志贺毒素大肠埃希氏菌；肠致病性大肠埃希氏菌；分离；鉴定Isolation and Identification of Shiga Toxin Producing Escherichia coli and Enteropathogenic Escherichia coli in Beef SamplesZHU Yingfei, NIE Xiang, XIONG Lixia, WU Xueping, ZHAN Zhongxu, KUANG Peilin(Jiangxi General Institute of Testing and Certification Food Testing Institute, Nanchang 330000, China)Abstract: From September 2018 to March 2019, 20 samples were taken from supermarkets and farmers’ markets every month, with a total of 140 beef and product samples taken. the positive rate of stx was 45.8%, and the positive rate of eae was 52.2%. The monthly positive rates of stx initial screening positive rates of 65%, 60%, 80%, 5%, 25%, 45%, and 40%, respectively; The positive rates of eae initial screening were 70%, 70%, 65%, 0%, 40%, 65%, and 55%, respectively. Four Shiga toxin producing Escherichia coli samples carrying the stx gene were detected, with a positive strain detection rate of 2.9%; From September 2018 to March 2019, 12 samples of enteropathogenic Escherichia coli carrying the eae gene were detected, with a positive strain detection rate of 8.6%.Keywords: Shiga toxin producing Escherichia coli; enterogenic Escherichi coli; separation; appraisal产志贺菌毒素的大肠杆菌（Shiga Toxin Producing Escherichia coli，STEC）和肠致病性埃希氏菌（Enterogenic Escherichi coli，EPEC）是世界上最重要的食源性病原体之一。牛羊等动物作为STEC和EPEC的宿主，可通过粪便污染肉食对人们的健康造成危害[1]。STEC可引起溶血性尿毒症综合征，甚至可能导致死亡[2]。EPEC可引起急性或持续性腹泻，多发于两岁以下的儿童。通常，EPEC会引起急性水样腹泻，并伴有发烧、呕吐和脱水，该病发病迅速，在摄入细菌后几小时后出现症状[3]。本研究旨在用传统平板分离法结合分子生物学方法对江西省南昌市市售牛肉样品中的STEC和EPEC进行分离鉴定。1 材料与方法1.1 仪器与试剂恒温培养箱，上海智诚；实时荧光PCR仪，伯乐；改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基，新生霉素、营养琼脂，北京陆桥；CHROMagar STEC显色培养基，科玛嘉；改良Rainbow O157显色培养基，Biolog；引物和探针，生工生物工程（上海）股份有限公司合成。基金项目：江西省市场监督管理局科技项目（GSJK202104）；江西省检验检测认证总院科研项目（ZYK202212）。作者简介：朱应飞（1978—），男，湖南浏阳人，本科，高级工程师。研究方向：卫生检验。通信作者：匡佩琳（1965—），女，江西泰和人，本科，主任药师。研究方向：药学。E-mail:138****************。122 食品安全导刊 2023年10月（上）分析检测
大肠埃希菌毒力基因研究进展
大肠埃希菌毒力基因研究进展
张金宝;李晓娜;王桂琴
【摘 要】大肠埃希菌是寄生于人或动物肠道内的一种肠杆菌科的革兰阴性菌，常引起幼畜严重腹泻和败血症、猪水肿病、人的出血性结肠炎-溶血性尿毒综合征、新生儿脑膜炎及肾炎等多种疾病，其毒力基因主要有escs、eaeA、Stx1、Stx2、Stx2e、sep、esp、astA、aggA、hlyE、ST （STa、STb）、LT 等。论文主要介绍eaeA、Stx2e、ST（STa、STb）、astA 4个毒力基因的来源、结构、所致疾病及其与大肠埃希菌耐药性之间的相关性，旨在为动物疾病的传染源及疾病的流行病学调查和防控提供相关证据。%Escherichia coli is a Gram-negative bacteria
of Enterobacteriaceae in the intestine of human or animals .It often causes
severe diarrhea and sepsis in young animals ,pig edema disease ,human
hemor-rhagic colitis-hemolytic uremic syndrome ,neonatal meningitis and
nephritis and other diseases .Its viru-lence genes mainly include
escs ,eaeA ,Stx1 ,Stx2 ,Stx2e ,Sep ,esp ,astA ,aggA ,hlyE ,ST (STa ,
STb) ,LT ,etc .This article briefly described the source ,structure ,the illness
caused of the eaeA ,Stx2e , ST (STa ,STb) and astA ,and the correlation
产志贺毒素大肠埃希菌的分子生物学鉴定和耐药性分析
产志贺毒素大肠埃希菌的分子生物学鉴定和
耐药性分析1
李咏梅，李凡
吉林大学基础医学院病原生物学教研室, 1320011
E-mail：mayflower380@
摘 要：本文采用多重PCR（multiplex PCR, mPCR）法对产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga
toxin-producing Escherichia coli, STEC）分离株进行毒力基因的分子生物学鉴定；用WHO
推荐的K-B法对分离株进行抗生素的敏感性测定，以了解stx
1、stx
2、eaeA、hlyA 4种毒力
基因的分布情况，以及分离株对18种抗生素的敏感性。结果显示产志贺毒素的大肠埃希菌
共有46株，其中两种毒素均产生的有22株（47.8%）；单纯产生stx
1的有16株（36.9%），
stx
2的有8株（17.4%）；四种毒力基因均存在的有19株（41.3%），血清型为O157:H7，而非
O157:H7血清型的菌株（23/46）中，4种毒力基因同时存在的仅有3株（6.6%），但有13
株（56.9%）hlyA基因阳性。全部STEC对复方新诺明耐药，对链霉素耐药率为28.3%，氨苄
西林为30.4%，红霉素为69.6%，而且有5株对至少4种以上抗生素多重耐药，耐药谱为复
方新诺明-链霉素-红霉素-氨苄西林。非O157型 STEC耐药菌次为122， 而O157 型为
63。 实验结果证明mPCR法可以快速检测STEC特征性毒力基因，以判定其致病性能。非O157
型STEC对抗生素较易形成耐药性。
关键词：STEC；鉴定; 耐药性
1．引言
STEC是世界上人类食物中毒的重要致病因子，也是引起大规模食源性食物中毒的主要病
原菌[1]
。STEC中有100余个血清型的致病性大肠杆菌可以致病，主要血清型是O157H7，可引
起非出血性腹泻，出血性结肠炎（haemorrhagic colitis, HC），溶血性尿毒综合症
大肠杆菌耐热性肠毒素_ST_的分子生物学研究进展_王玉炯
第22卷第3期宁夏大学学报(自然科学版)2001年9月Vol.22No.3JournalofNingxiaUniversity(NaturalScienceEdition)Sep.2001文章编号:0253-2328(2001)03-0331-06大肠杆菌耐热性肠毒素(ST)的分子生物学研究进展王玉炯,许崇波(宁夏大学生物工程系,宁夏银川750021)摘要:大肠杆菌的耐热性肠毒素(ST)在产肠毒素性大肠杆菌引起的腹泻中扮演重要的角色,对人类和家畜的健康构成很大的威胁.文章从ST的理化特性、致病机理等一般生物学特性到基因克隆、定点突变以及分子结构与功能的关系等分子生物学特征,全面概述了ST的分子生物学研究进展,对于从分子水平全面了解ST的结构、性质、致病机理以及免疫原性等生物学性状具有重要意义.关键词:大肠杆菌;耐热性肠毒素;分子生物学分类号:(中图)R3782文献标识码:A产肠毒素性大肠杆菌(Escherichiacoli,ETEC)是引起幼畜腹泻的主要病原菌.ETEC具有两类致病因子:一类为肠毒素,另一类为粘着素(或称定居因子),已知的粘着素有K88,K99,F41和987P等.ETEC借助这些粘着素定居于宿主肠道粘膜的上皮细胞上,从而大量繁殖,产生大量肠毒素,由肠毒素造成肠粘膜上皮细胞的病理性变化,导致幼畜腹泻[1].ETEC产生两种肠毒素:一种为不耐热性肠毒素(LT),它由一个分子量为28kD的A亚单位结合5个分子量为11.5kD的B亚单位组成,全LT或B亚单位具有良好的免疫原性[2];另一种为耐热性肠毒素(ST),成熟的ST为18或19个氨基酸组成的小肽,有很强的毒素活性,而免疫原性极差.Rebertson综合研究的资料表明,20%~30%的ETEC为LT+/ST-;30%~40%的ETEC为LT+/ST+;而ST-/ST+接近50%.由于ETEC产生的ST在ETEC性腹泻中扮演重要角色,对人类和家畜健康有很大威胁,因此从分子水平研究ST的各种性质、致病机理和免疫原性等,对控制由ST引起的腹泻性疾病具有重要意义.1ST的一般生物学特性1.1ST的分类根据ST的生物学特性及致病性,将其分为ST(又称STa)和ST(又称STb)两类[2].ST可溶于甲醇,可引起乳鼠和乳猪肠积水;ST不溶于甲醇,对乳鼠不引起肠积水,而对断乳小猪可致肠积水.ST可根据它的来源不同及核苷酸序列的差异分为STa与STb,STa为牛源或猪源(又称STp),STb为人源(又称STh),ST则为猪源性[3].1.2ST的理化性质不同来源的ST其理化性质相同.ST分子呈中酸性,疏水性氨基酸比例高,在低离子强度时易与碱性疏水性多肽聚合.ST分子量较小,为2000D左右,也有报道为4000D和5000D.18肽的小分子具有3个链内二硫键,因该键属于共价键,键能高,不易破坏,故分子结构高度稳定,因而耐热(在10030min和12115min不失活)、耐酸碱(在pH=2~10稳定)、耐多种有机溶剂和表面活性剂;抗各种蛋白酶水解,为肽类毒素中最特殊者;不被淀粉酶、胰蛋白酶、脂酶、链霉蛋白酶、糖化酶等失活.但ST对可破坏二硫键的氧化剂和还原剂高度敏感,0.1mol/L的2巯基乙醇、410-5mol/L的二硫苏糖醇和过甲酸均可使其失活.可溶于甲醇、丙酮等有机溶剂.经等电聚焦测定,ST的等电点为4.3左右.ST纯化后为白色粉末,其最大吸收波长为275nm,最小吸收波长为255nm.ST单独不具免疫原性,但与大分子偶联可产生免疫原性.J.C.Frantz[4]将人工合收稿日期:2000-06-12基金项目:国家自然科学基金资助项目(39660060)作者简介:王玉炯(1963-),男,教授,博士,研究微生物学、分子生物学及基因工程等.成的STa连接到载体蛋白上,加上福氏佐剂免疫动物(母猪、母牛)后可产生抗体,且抗体高峰能维持数周,使出生的新生动物对产肠毒性大肠杆菌的攻击有保护作用.1.3ST的检测对ST的检测广泛应用的是乳鼠试验,即先将过液培养物(或离心后的上清液)经口灌入2日至4日龄的乳鼠,4h后剖腹取出全部肠管称重,计算肠管与剩余尸体重量的比率,此法简单易行,重复性较好.对ST的检测是用断乳小猪肠环结扎试验[2],即将4~9周龄断乳小猪麻醉,取其肠段扎成6cm肠环,每环注入5mL菌液或上清液,然后计算肠环中液体与肠段长度的比率(mL/cm).检测ST的免疫学反应主要有放射免疫测定法(RIA)和ELISA等.随着分子生物学的发展,近年来建立了ST基因探针检测方法[3,5~6],应用结果表明,敏感性和准确性俱佳.1.4ST的作用机理业已证实,ST能激活颗粒性鸟苷酸环化酶(GC)[7],而二硫化合物能抑制此酶,从而使ST无作用.ST的生物活性具有组织特异性,可使回肠上皮细胞内cGMP(环磷酸鸟苷)增高10倍而结肠下段仅增高1.8倍,对其他组织、器官无活性,此特异性可能与受体分布有关.Mg2+,Mn2+等可增强ST的作用.ST的激活作用具有专一性,这是由于ST对小肠粘膜颗粒性酶比可溶性酶具有更高的亲和力,同时小肠粘膜本身以颗粒性酶为主.有关ST激活酶的作用机理主要有两种学说:一是瀑布学说,认为ST结合到细胞膜表面,打开钙离子能道,钙摄取增加,激活调钙蛋白,触发磷酸酯酶A2,膜磷脂释放花生四烯酸,后者的过氧化物及过氧化氢代谢物使GC激活,但有的学者认为,ST并不引起小肠细胞花生四烯酸的释放及改变膜脂成分;二是直接偶联学说,该学说认为ST激活GC是直接的,不需要介导酶,即与已知腺苷酸环化酶激活机理相似,依靠ST受体复合物系统激活.近来,S.A.Waldman研究发现了小肠粘膜颗粒性GC与ST受体偶联的新模式[8],即两者可能通过细胞骨架成分紧密相连.这种偶联可抵抗各种离子、非离子去垢剂、盐及尿素等的溶解,而其他组织上的酶可被上述物质所溶解,但ST受体抵抗溶解作用,说明其他组织中酶与受体无特殊偶联关系.S.A.Waldman观察到GC只有与细胞骨架成分、ST受体结合在一起才被ST所激活.ST受体及GC定位于细胞膜刷状缘的亚细胞结构中,其中含有丰富的细胞骨架成分,包括肌纤蛋白等不受去垢剂溶解的物质,这些骨架成分提供基质使GC定位于此,并与受体偶联.有趣的是小肠粘膜细胞膜上的cGMP依赖性蛋白激酶也与受体及GC位于相同位置,并与骨架成分紧密相连.进一步研究发现,位于刷状缘的25kD蛋白磷酸化后,在小肠可介导ST毒素诱导的离子转移.据以上资料推测,ST引起水和电解质分泌是由刷状缘上ST受体,GC,cGMP依赖性蛋白激酶,25kD底物蛋白形成一个功能性复合物所介导,这些成分可以共价键形式紧密连接于细胞骨架成分上,并保持一种有利于各种成分相互作用的适当的空间排列结构,从而发挥各自的功能.上皮细胞cGMP增多而引起肠液潴留致泻已予公认,但对其中的机理尚不明了.业已发现,cGMP和cAMP一样,能使电泳性质相似的刷状缘膜和basolateral膜蛋白磷酸化,小肠绒毛上皮细胞内cGMP含量增高,Cl-主动吸收受抑制,跨膜电位和短环路电流增加,8溴cGMP模拟的短环路电流增加约为8溴cAMP的1/3,推测ST的作用可能与霍乱肠毒素通过cAMP升高使Na泵磷酸化、Na+吸收障碍导致水泻的机理相似,即cGMP使Cl-转运蛋白磷酸化,Cl-主动转运受抑制,进而肠腔内电解质与水潴留引起腹泻.2ST的分子生物学研究2.1ST基因的位点编码ST的基因位于产肠毒素性质粒(Ent)上.含有ST基因的质粒多是接合性质粒,分子量为46~97MD,与编码性菌毛的F质粒有一定的同源性.含有ST基因的质粒分子量为21~80MD,至少一部分质粒是接合性质粒.ST常与定居因子在同一大质粒上,ST常与LT在同一大质粒上[9].某些ST基因位于转座子上,两端有反向重复序列,称为Tn1681.2.2ST基因的克隆和表达M.H.W.So等[10]首先报道成功地克隆了ST基因,即将带有ST毒性决定簇的牛源大肠杆菌ESF0041的质粒用EcoR切出8.9kb的片段,然后与载体pSC101连接,转化到非产肠毒素性大肠杆菌,使ST的产量大约增加3倍,然后又将这一杂种质粒进行亚克隆,用BamH酶切产生2个片段,大小分别为5.6kb和3.4kb,再分别与pBR322重组,转化后进行筛选检测,发现只有3.4kb片段产生ST.以此再用Pst消化产生1.7kb,1.4kb和0.3kb332宁夏大学学报(自然科学版)第22卷片段,将1.7kb片段再克隆后可产生ST,命名此克隆为pMS3.后来作者又对pMS3进行了亚克隆,用Taq与Hind酶切,连接转化后得到了TC1,并确定TC1就是质粒ESF0041含ST基因的最小DNA片段,大小约473bp[11].S.L.Moseley等[3]用人源ETEC的Ent质粒,经BamH酶切,把1.9kb的片段克隆到pBR322中,得到重组菌株pSLM003,把pSLM003经Taq酶切的840bp片段再克隆到pBR322上,构建出高产毒株pSLM004.ST在致病过程中起着非常重要的作用,几乎所有重症腹泻患者的样本中,只要分离到ETEC,大都产生ST.如何增强ST的免疫原性,是当前大肠杆菌肠毒素研究的热门课题之一.L.M.GuzmanVerduzco等[12]用EcoRIt和Hpa酶切pRIT10250质粒,加入linker后,重组到pUC13上,构建出重组质粒pGK26,再对pGK26进行Hind和Sst双酶切后,作为载体分子,把编码LTB的基因片段连在ST下游上,构建出重组质粒pGSK51.J.D.Clements[13]把编码ST的基因片段连在LTB基因的下游,构建出3种不同的STLTB融合基因.ELISA检测表明,当LTB基因和ST结构基因之间插入一段7个氨基酸(AspProArgValProSerSer)的linker时,ST的表达水平最高;当两者之间有3个氨基酸(IleProGly)时,ST表达次之;当两者之间不插入氨基酸时,ELISA没有检测到ST的存在.张兆山等[14]采用不耐热肠毒素LTB亚单位基因作为载体分子,将编码ST抗原决定簇的寡核苷酸连接在消除了终止密码子的LTB基因下游,并使之处于同一开放阅读框架中,构建了3种不同的STLTB融合基因.核苷酸序列分析证实该融合基因有正确的阅读框架;ELISA检测表明,这些融合基因既能表达LTB,也能表达ST.当LTB基因和ST结构基因之间插入21bp的寡核苷酸时,ST的表达水平最高,比野生菌株高8倍以上;当两者之间插入9bp的linker时,ST表达次之,是E.coliH10407菌株的3倍左右;二者相隔33bp时,ST的表达水平与野生菌株相近.Westrnblotting试验显示了STLTB融合蛋白的存在,但该融合蛋白依然还具有ST毒性.许崇波等[15~16]将ST前体蛋白基因(proST)与半乳糖苷酶基因融合在一起,结果表达的融合蛋白具有良好的免疫原性,且失去了ST本身的生物学毒性.王玉炯等[17~19]将proST基因融合在产气荚膜梭菌毒素基因的下游,其表达产物具有2种抗原的免疫原性,免疫动物后产生了具有中和活性的抗体,且已失去ST本身的生物学毒性.目前已用该基因工程菌株制备出双价基因工程灭活苗,在市场上应用效果良好,取得了良好的社会和经济效益wrence等[20]用EcoR和Hind双酶切pUC9STb质粒,用Klenow片段补平末端,再用BamH酶切,然后重组到pKC30上,构建出重组质粒pKC30STb,这使STb的产量比其他野生菌株高10~20倍.R.Urban等[21]把编码phoA的基因片段重组到编码STb的质粒pT7ST73上,构建成pSTphoA融合基因,其产生的融合蛋白分子量为50000D,具有类似STb的生物学活性,为进一步研究STb提供了很好的材料.2.3ST核苷酸序列分析对STa,STb,ST不同基因的DNA序列分析有助于阐明ETEC的ST群结构.STa和STb的基因有70%的DNA序列同源,其基因产物C端的18个氨基酸序列是高度保守的,其他序列有68%的氨基酸同源[3].ST类的毒素基因编码成一条有71个氨基酸的多肽,核苷酸序列不同于ST基因,这为ST毒素组成一个不同类群提供了依据[22].从ETEC培养的上清液中已分离出具有ST活性、含18个氨基酸的肽链.对纯化的ST肽链作序列分析,表明它是由ST基因的54~72密码子进行编码.在STa和STb之间,ST肽链18个氨基酸的序列十分恒定[23].A.M.K.Saeed等[24]报道了从牛中分离的E.coliM490,B41,M524产生的ST具有完全相同的氨基酸顺序.这些结果表明了编码ST的基因是高度保守的,广泛分布于不同寄主来源的大肠杆菌中.M.So等[11]将编码ST的转座子样片段Tn1681进行亚克隆和插入突变,正确确定了ST基因在该转座子中的位置,测定了Tn1681中心部分的全部核苷酸序列,从中可以看到这一基因具有在细菌中单独表达所必需的全部特征:-10序列的同源性,16S核糖体结合位点,转译开始、终止信号,转录停止信号.由此核苷酸序列推算出该基因产物是72个氨基酸,氨基端前18个氨基酸多数是亲水的,表明这一区域的多肽起ST毒素信号序列的作用.该氨基酸序列的另一个特征是半胱氨酸占有很大比例(18%),它们可能形成3对二硫键,使ST具有非常紧密的构象,从而解释了ST对热、对酸的稳定性及对氧化剂和还原剂的敏感性.R.A.Houghten等[25]通过测定人工合成的线型ST分子中二硫键形成的先后顺序,间接测定了3对二硫键的位置,分别为5-10,6-14及9-17.经氧化剂或还原剂处理,ST的生物活性消失,表明二硫键对于ST的生物活性是必需的.333第3期王玉炯等:大肠杆菌耐热性肠毒素(ST)的分子生物学研究进展
STX噬菌体病毒相关特性及STX毒素的诱导特征
上海交通大学
硕士学位论文
Stx噬菌体病毒相关特性及Stx毒素的诱导特征
姓名：***
申请学位级别：硕士
专业：预防兽医学
指导教师：严亚贤;孙建和
20070101 IV菌体以外的噬菌体。并对其中一株Stx2噬菌体A亚单位进行测序验
证。结果显示8株大肠杆菌O157溶源菌株经丝裂霉素C诱导后均优
先释放Stx2噬菌体，不释放Stx1噬菌体。通过多次纯化，获得8株
Stx2噬菌体。通过比对发现Stx2噬菌体ΦPB0308-2 A亚单位核苷酸
序列与GenBank中多株Stx2噬菌体（X07865、AP005154、AF548457、
AP000363）相应序列的同源性高达99％。本试验不仅鉴定了大肠杆
菌O157溶源菌株诱导后优先释放的是Stx2噬菌体，验证了stx
基因
在大肠杆菌菌株间的水平转移，同时还建立了指示多种Stx噬菌体的
优化方法，将有助于对Stx噬菌体的进一步研究。
将实验室分离的8株Stx2噬菌体作为试验材料进行相关特性研
究。采用随机引物法（Dig－dUTP）标记了789bp的stx2
基因片段
作为探针进行Southern blot。测定Stx2噬菌体增殖效价、将其中
的6株噬菌体进行电镜观察，并对其基因组大小、酶切片段的多态性
和蛋白质组成进行了初步分析。Southern blot结果进一步验证了该
8株噬菌体均为Stx2噬菌体，各噬菌体的增殖效价高，从108
PFU/mL～
1010
PFU/mL不等。电镜下观察到的6株Stx2噬菌体形态基本一致，
头部均为正六边形，尾部很短。各噬菌体之间存在着相同的蛋白结构
模式，但是限制性内切酶片段长度表现出一定的多态性，噬菌体的基
因组大小从48.0kb～65.3kb不等。
Stx2噬菌体能够介导stx
基因在大肠杆菌菌株间的水平转移，
而某些抗生素又能诱导Stx噬菌体的释放，但抗生素对Stx毒素的诱
导作用还没有一个明确的结论。本试验选用丝裂霉素C作诱导剂，研 V究了诱导前后以及诱导后8h、12h、16h四个阶段滤液中Stx的表达
志贺毒性大肠杆菌 (STEC) 的临床实验室检验
J Biomed Lab Sci 2011 Vol 23 No 4 127 志賀毒性大腸桿菌(STEC)的臨床實驗室檢驗 陳星宇1 孫俊仁2* 1台北市立聯合醫院仁愛院區 2三軍總醫院臨床病理科 人類如果感染志賀毒性大腸桿菌 (shiga toxin–producing Escherichia coli ,STEC)會造成嚴重腹瀉。即時且適當的診治可以減少病人併發嚴重腎臟疾病及改善病人預後。所以實驗室如何正確診斷志賀毒性大腸桿菌就很重要。以群聚感染爆發與感染控制的角度而言，實驗室必須能區分所流行的志賀毒性大腸桿菌血清型。本篇文章為介紹臨床實驗室診斷志賀毒性大腸桿菌的檢驗流程。此流程包含腹瀉檢體的採集及運送、針對志賀毒性大腸桿菌的培養及非培養的相關鑑定試驗。在台灣，志賀毒性大腸桿菌所造成的群聚感染並不常見，主要是跟我們熟食的飲食習慣有關。但隨著生食主義及生機飲食的盛行，志賀毒性大腸桿菌感染的風險也相對提高。臨床實驗室了解如何快速檢測志賀毒性大腸桿菌感染就顯得格外重要。 關鍵詞：志賀毒性大腸桿菌、志賀毒素 志賀毒性大腸桿菌 (Shiga toxin–producing E. coli, STEC)簡介 志賀毒性大腸桿菌(Shiga toxin–producing E. coli, STEC)泛指會產生志賀毒素(shiga toxin)的大腸桿菌[1-3]。大腸桿菌的分型主要依據O抗原及H抗原進行血清分型。O抗原為表面抗原(Somatic Ag)而H抗原則為鞭毛抗原(Flagellar Ag)。STEC亦可以專一性抗血清針對其表面抗原及鞭毛抗原進行分型。舉例來說，STEC下最有名的E. coli O157:H7，別名為STEC O157:H7表示其所攜帶的表面抗原為O 157，而其所攜帶的鞭毛抗原為H7，並且可以產生志賀毒素。STEC在分類上可以區分成O157 STEC及Non-O157 STEC兩類。常見的STEC感染症主要是感染E. coli O157:H7。但是至少還有150種STEC血清型證實與群聚感染或是人類疾病有關，這些血清型別可以被歸類為non-O157 STEC。在美國地區non-O157 STEC感染症與六株non-O157血清型(O26, O45, O103, O111, O121及O145)較為相關[4, 5]。志賀毒素的命名最早是因為其毒素結構與功能類似於Shigella dystenteriae所分泌之Shigella dystenteriae type 1[6]。目前常見的Shiga toxin可以分成兩大類，分別為Shiga toxin 1 (Stx1)及 Shiga toxin 2(Stx2) [7, 8]。其他常見名稱像是verocytotoxigenic E. coli則是指其所分泌的志賀毒素會使Vero細胞株產生細胞病變現象。因其會造成人類疾病主要是以腸道出血，所以又稱為enterohemorrhagic E. coli。STEC感染主要會造成急性腹瀉(diarrhea)，此外約8%病人在感染後會出現溶血性尿毒症候群 (hemolytic uremic syndrome, HUS)的症狀。其他嚴症狀像是血小板減少症(thrombocytopenia)、溶血性貧血(hemolytic anemia)及腎衰竭(renal failure)等症狀。如果臨床上觀察到血栓性血小板低下性紫斑症(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)或是溶血性尿毒症候群伴隨腹泄癥候，則必須要懷疑為STEC感染[9, 10]。但是，並非每個感染STEC病人都會出現溶血性尿毒症候群，出現症狀輕重與否與菌種毒性及宿主免疫力有直接關係。而HUS 症狀則是無論是O157 STEC亦或是non-O157 STEC皆有可能造成[10]。STEC造成的感染症主要是因為食用被STEC所污染過的食物 (未煮熟的絞肉、受汙染的果汁、生菜及牛奶)、飲用收稿日期：100年10月12日 通訊作者：孫俊仁 三軍總醫院臨床病理科 台北市內湖區成功路2段325號臨床病理科 電 話：886-2-87923311 ext 88092 傳真：886-2-87927226 電子郵件：sun3342@ 綜 論 志賀毒性大腸桿菌的檢驗
志贺氏菌样毒素Stx2e缺失突变株的构建及部分生物学特性的分析
疫病防控 中国畜牧兽医文摘２０１３年２９卷第９期 加蛋氨酸、维生素Ａ、维生素Ｂ、维生素ｃ、维生素Ｄ及部分脂肪 酸等，确保免疫力的维持。接种疫苗时，应处置得当，防止造成 猪群惊吓。若遇到不可避免的应激和疫苗接种时，应在接种前后５ ｄ内，在饮水中添加抗应激剂。 ９营养因素 维生素及其他营养成分都对猪免疫能力有显著影响。营养 缺乏，特别是缺乏维生素Ａ、维生素Ｂ、维生素Ｅ、维生素Ｄ和多 种微量元素及全价蛋白时，均能影响机体对抗原的免疫应答，抑 制免疫反应。维生素Ａ缺乏会导致淋巴细胞萎缩，影响淋巴细胞 分化、增殖、受体活化与表达能力下降。导致体内的Ｔ淋巴细胞 减少，吞噬细胞的吞噬能力下降，Ｂ淋巴细胞的产生抗体能力下 降。 对策：注意饲料中营养成分的监测，饲喂新近生产的饲料； 因维生素易在夏季氧化或被还原而失效，所以在夏季，饲料内应 多添加维生素。 １０母源抗体干扰 一定的母源抗体对于保护仔猪避免早期感染传染性疾病具有 极其重要意义。但由于母猪个体免疫应答的差异，以及母猪所用 疫苗的不同。造成不同来源的仔猪母源抗体水平参差不齐。当母 源抗体水平很高时，因疫苗中的抗原被母源抗体中和而致免疫失 败，或母源抗体过低又迟迟没有进行免疫，而出现免疫空白期， 在这期间如果感染野毒易致免疫失效。 对策：监测母源抗体，大部分猪母源抗体降到安全范围之内 即进行首免。通过母源抗体水平的检测，制定合理的免疫程序， 提倡活疫苗和灭活疫苗的同时使用免疫的方法，使活疫苗中和一 部分母源体后，使每只仔猪的抗体处于同一水平，只有这样才能 达到免疫的目的。 １１病原体血清型 许多病原微生物都有多个血清型，甚至有多个血清亚型，某 猪场感染的病原微生物与使用的疫苗毒株在抗原上可能存在较大 差异或不属于一个血清型或血清亚型，从而导致免疫失败。 对策：针对血清型制备疫苗，可有效解决这一难题。 １ ２野毒早期感染或强毒株感染 机体接种疫苗后需要一定时间才能产生免疫能力，而这段时 间内恰恰是一个潜在的危险期，一旦有野毒入侵或机体尚未完全 产生抗体之前感染强毒，就会导致疾病的发生，造成免疫失败。 对策：活疫苗和灭活疫苗的同时使用，充分利用活苗产生ＩｇＧ 抗体快、并且具有ＩｇＡ、ＩｇＭ抗体，而灭活疫苗产生的ＩｇＧ抗体持久 的特点，使他们各自发挥出自己的长处从而将病原拒之门外。 １３病毒性疾病 猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒２型、猪瘟病毒、猪 胸膜肺炎放线杆菌、附红细胞体、弓形体等均会侵害机体免疫系 统，破坏免疫细胞，使机体无法产生足够保护力，从而影响疫苗 的免疫效果。 对策：要做好这些疾病的防疫，严防引入，以保证其他疾病 的免疫应答。 １４药物 卡那霉素、糖皮质激素、四环素、氟苯尼考等均可使机体白 细胞减少、抗原传导受阻，应答不足；有些抗生素会影响活菌苗 的增殖，使抗原数量不足，自然就产生不了足够的免疫应答。 对策：在免疫前后，禁止添加或注射可引起免疫抑制或杀灭 活菌苗的药物。 １５疫苗保护期 有些疫苗保护期较短，抗体水平降到无法提供有效保护时， 应及时进行二免，否则，极易出现免疫失败，虽然原来有免疫 过，但照样有猪发病。 对策：通过抗体监测，以确定最佳二免时间。 １６其他 其他因素，如饲养管理不当、卫生消毒制度不健全、周围环 境中存在大量的病原微生物，在使用疫苗期间机体已受到病毒或 细菌侵袭，都会影响疫苗的效果，导致免疫失败。许多重金属均 可抑制免疫应答，器械和用具消毒不严，免疫接种时不按要求消 毒，使免疫接种成了带毒传播，反而引发疫病流行。 对策：保证冷链运输，尽量缩短运输时间，根据本地区疫 病流行情况和规律、病史、日龄、品种、母源抗体水平和饲养管 理条件以及疫苗种类、性质等因素制定合理、科学的免疫程序， 并视具体情况适当调整。必须对饲料进行监测，确保不含霉菌毒 素和其他化学物质。加强饲养管理，减少应激和合理选用免疫促 进剂（左旋咪唑、干扰素），控制好温度、湿度、通风、饲养密 度，饲喂全价配合饲料，做好消毒工作，接种疫苗前应对健康状 况进行详细调查，确定接种时间，对病、弱猪应剔除、隔离，确 保接种猪是健康猪。做好环境、进出人员、车辆的消毒和灭鼠工 作，保持清洁良好的环境卫生是提高免疫接种效果的基本保证。 综上所述，选用优质疫苗，制定科学合理的免疫程序并严格 执行，实施正确的免疫接种技术，确定疫苗接种到位，并结合科 学的饲养管理、均衡的饲料营养、良好的圈舍卫生，合理用药， 减少环境应激，提高猪机体的抵抗力，实施疾病综合防治措施， 即可有效预防猪传染病的发生，避免免疫失败所造成的危害。
产肠毒素大肠杆菌毒力的分子机制-畜牧兽医论文-农学论文
产肠毒素大肠杆菌毒力的分子机制-畜牧兽医论文-农学论文
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产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是一类能在小肠上皮细胞定植和增殖,继而产生和释放由质粒和/或染色体编码的热不稳定(LT)和/或热敏(ST)肠毒素的病原菌。这类病原菌每年引起成千上万例腹泻病例,尤其在发展中国家,且ETEC每年引起300 000~500 000名5岁以下儿童的 。这类病原菌也是导致旅行者腹泻的常见原因,并常常困扰着被部署在疫区的军事人员。伴随着感染性腹泻的反复发作,可导致患者生长阻滞和营养不良,进而恶性循环。营养失调的儿童表现出更高的感染风险。
临 ETEC感染通常伴有急性的水样腹泻,如同霍乱病例,有从温和到严重的水样腹泻等多种类型。除腹泻外,其他体征如头痛、发烧、恶心、呕吐也常常被报道。依据美国农业部最近连续监测报告(USDA:APHIS:VS.Swine.2002,2006,2010)表明,腹泻仍然主要危害着养猪生产业,导致猪群中发病率和病死率最高。
1 毒力的分子机制
ETEC至少可产生、分泌并有效释放LT和/或ST毒力因子,鉴于编码这些毒素基因系统发育进化树明显多样性,各自可能是形成致病性克隆的基本元素。然而,这些病原菌的发病机理仍然有待详尽研究。其他必需的毒力因子,如ETEC如何定植,毒素如何成功靶向定位宿主细胞,以及可能增强这一过程的至关重要的毒力因子,至今还没有被完全发现。
1.1 毒素及其分泌系统
1.1.1 热敏毒素热敏毒素(LT),与其高度同源的霍乱毒素CT一样,是由5个B亚基五聚体,和一个A亚基组成的异质性聚合体。
A亚基包含2个由二硫键连接的结构域:A1和A2,其中A1是毒素活性分子,而A2分子通过螺旋使A亚基与五聚体的B亚基相连接(图1)。 B亚基和神经节苷脂GM1在位于宿主细胞膜穴样内陷的中心相结合后,激发对全毒素的内吞作用。
2020大肠杆菌的分型方法及其研究进展
2020大肠杆菌的分型方法及其研究进展
肠埃希氏菌是一种条件性致病菌，致病性的大肠埃希氏菌具有高度的传染性，会严重危害健康。快速准确地测定大肠埃希氏菌的污染来源对有效缩小疫情影响范围极有帮助，从而避免对人类健康和经济贸易造成重大损失。建立简便高效的分型方法是微生物溯源的关键，常见的大肠埃希氏菌分型方法可分为表型分型和分子分型，这些分型方法各有优劣，具有不同的适用范围。
大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E. coli)又称大肠杆菌，属革兰氏阴性菌，于1885年首次被发现[1]，是人和动物体内的正常寄居菌。大肠埃希氏菌是一种条件致病菌，在正常情况下不致病，然而一些特殊血清型菌株可导致人或动物腹泻、腹痛甚至会产血性粪便，重症病例会并发溶血性的尿毒综合征以及血小板减少性紫癜[2-3]。
根据大肠埃希氏菌对人类的致病机理不同，可将其分为5种类型：
. 肠致病性大肠埃希氏菌(Enteropathogenic escherichia coli，EPEC)
. 肠产毒性大肠埃希氏菌(Enterotoxigenic escherichia coli，ETEC)
. 肠侵袭性大肠埃希氏菌(Enteroinvasive escherichia coli，EIEC)
. 肠出血性大肠埃希氏菌(Enterohemorrhagic escherichia coli，EHEC)
. 肠集聚性大肠埃希氏菌(Enteroaggregative escherichia coli，EAEC)
大肠埃希氏菌的肠道传染具有比较广泛的特性，而食品在生产、包装及运输过程中极易感染此菌，进而引发传染性疾病[5]。2018年6月，大肠埃希氏菌O157:H7污染生菜事件的暴发，影响了美国36个州，事件造成96人住院和5人死亡[6]。
2019年4月，美国的10个州暴发牛肉感染大肠埃希氏菌O103事件，导致177人感染，其中21人住院，涉事公司紧急召回了53 200磅牛肉[7]。大肠埃希氏菌是一些传染性疾病的重要来源之一，致病性的大肠埃希氏菌严重威胁着人类健康[8]。迅速确定大肠埃希氏菌的污染来源可有效缩小疫情影响范围，避免对人类健康和经济贸易产生重大损失。根据大肠埃希氏菌表面抗原的不同，大肠埃希氏菌可分为1 000多种血清型[9]，建立简便高效的追溯技术和分型方法是微生物溯源的关键。
山东省零售肉类样品中分离、鉴定携带志贺毒素基因(stx)的O157和非O157大肠杆菌
山东省零售肉类样品中分离、鉴定携带志贺毒素基因（stx）的O157和非O157大肠杆菌
【摘要】实验采用DNA探针杂交技术，对购买的53个市售肉类样品进行检测，31个（58%）样品检测出含有stx基因的大肠杆菌，其中牛肉检出率最高（68%）。分离的42株携带stx基因的大肠杆菌，均不是O157。使用O157特异免疫磁珠技术，从8个牛肉样品中分离到携带eae和stx2基因的大肠杆菌O157。
【关键词】产志贺毒素大肠杆菌；O157特异免疫磁珠技术；DNA探针杂交技术
产志贺毒素大肠杆菌（STEC）的自然宿主是牛和其他动物，因此，零售的肉类可能被STEC污染[2]。尽管STEC包含超过200种O：H血清型，但大部分与严重的人类疾病没有关系。肠出血性大肠杆菌（EHEC）属于含编码紧密黏附素的eae基因的STEC，可以引起严重的胃肠道疾病。由EHEC感染的病例部分是由志贺毒素（Stx）引起。O157：H7/-（H7或H阴性）是EHEC中主要的血清型，可是H抗原很难检测，并且检测之前的动力实验可能导致H抗原丢失。因此，STEC中携带eae基因的O157血清型，作为典型的EHEC菌株，引起人们的极大关注。
本次实验研究了购买自山东省零售肉类样品中非O157和O157的分布情况，筛选了携带stx基因的非O157和O157大肠杆菌，检测了stx1、stx2和eae基因，通过RPLA方法确认了产生Stx1和Stx2毒素的能力。Stx2毒素阴性的STEC O157被发现，鉴定这些菌株将为研究携带stx2基因，却缺乏Stx2毒素的机制提供新的信息。
1、材料和方法
1.1菌株
大肠杆菌O157：H7菌株Thai-12，作为不产Stx2毒素的代表性的阴性对照。
1.2肉类样品中含stx基因大肠杆菌的检测
肉类样品购自青岛当地的超市和市场。25g样品加入225mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB），37℃培养6h。取1mL该增菌液接种10mL TSB，42℃培养2h，作为第二次增菌液。取2次增菌液分别接种DHL琼脂和麦康凯琼脂，37℃培养18～24h。