DNA探针和PCR技术在食品检测中的应用
第十二章 核酸探针检测技术
现代食品检测技术第二部分第12章核酸探针检测技术赵杰文邹小波江苏大学食品与生物工程学院第十二章核酸探针检测技术1 核酸探针的种类及其制备方法2 探针标记物与标记方法3 探针杂交与信号检测4 核酸探针在食品微生物检测中的应用1核酸探针的种类及其制备方法一、基因组DNA探针二、cDNA探针三、RNA探针四、寡核苷酸探针一、基因组DNA探针这类探针多采用分子克隆或PCR技术从基因文库筛选或扩增方法制备。
二、cDNA探针cDNA探针是以RNA为模板，在反转录酶的作用下合成的互补DNA，因此它不含有内含子及其他非编码序列，是一种较理想的核酸探针。
三、RNA探针mRNA作为核酸分子杂交的探针是较为理想四、寡核苷酸探针用人工合成的寡聚核苷酸片段作为分子杂交的探针，其优点是可根据需要随心所欲地合成相应的序列，避免了天然核酸探针中存在的高度重复序列所带来的不利影响2 探针标记物与标记方法一、核酸探针标记物种类及其特点二、探针标记方法三、探针的纯化四、探针标记效率的评估一、核酸探针标记物种类及其特点 标记探针的目的是为了跟踪探针的去向，确定探针是否与相应的基因组DNA杂交一、核酸探针标记物种类及其特点 一种理想的探针标记物，应具备以下几种特性：1、高度灵敏性；；2、标记物与核酸探针分子的结合；；3、应不影响探针分子的主要理化特性；4、当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性(Km值)无较大的影响；5、检测方法除要求高度灵敏性外，还应具有高度特异性二、探针标记方法（一）探针的放射性核素标记法（二）探针的非放射性标记法（一）探针的放射性核素标记法1．缺口平移法2．随机引物法3．单链DNA探针的标记4．cDNA探针的标记5．寡核苷酸探针的标记缺口平移法（二）探针的非放射性标记法1．PCR标记法2．体外转录标记RNA探针PCR标记法体外转录标记RNA探针三、探针的纯化（一）凝胶过滤柱层析法（二）反相柱层析法（三）乙醇沉淀法四、探针标记效率的评估通过测定标记产物的量来估计每一次标记反应的效率，这可以准确了解杂交液中应加探针的量。
食品微生物检验内容及检测技术
161综述随着社会的进步与发展，人们生活水平与理念的提升，许多食品安全问题不断被揭露出来，对于食品安全问题的关注度也显著增加。
食品检验是对食品安全的一个重大保障，只有达到标准的食品才能进入市场。
在食品安全问题中，微生物是对食品安全问题造成威胁的主要来源。
微生物是一种肉眼看不见的生物，如果在食品加工或运输过程中，不严格按照标准进行，就很容易被微生物污染，而微生物污染过的食品就会对人体健康安全造成威胁。
因此，做好食品检验工作，为食品安全提供有力保障。
1.食品微生物检验的内容1.1细菌总数的鉴定。
细菌菌落总数是指食品检验经处理，在一定条件下培养后所得1g食品或1ml食品或1cm2食品表面积上所含有的细菌菌落总数。
食品微生物中细菌总数的检验是衡量食品污染程度的指标。
通常是对生活中的食品或水通过特殊的物理、化学和生物的方法进行处理，在特定的培养条件下进行培养，得到细菌总数。
食品中细菌数量越多，腐败速度越快，甚至会对人体健康造成影响。
因此，细菌总数可以作为一个衡量食品安全的标准。
虽然细菌总数的并不能直接反映致病菌的多数量，但在一定程度上，二者是呈现正相关性的。
1.2大肠杆菌群数。
一定范围的大肠杆菌数能够维持人体内的正常菌群，但大肠杆菌菌群包含有多种肠道致病菌，超过范围就会对人造成危害。
在食品微生物检测过程中，待测样品中含有超标的大肠杆菌，很可能表明该待测样品直接或间接接触过粪便感染，当人们食用了这样的食品，其肠道致病菌感染的可能性大大增加。
大肠菌群MPN值是指1g或1ml待测样品中大肠菌群最可能数。
因此，大肠菌群MPN值可以作为粪便污染食品的指示菌。
1.3霉菌和酵母群数。
霉菌和酵母菌也是常见的食品微生物，起初酵母菌用于面包制造，酿酒等生产中，而霉菌也用于酿酒、制酱等一些食品生产中。
但是这一些腐生型酵母菌会使食物腐败变质，对于常见的面包而言，他主要含有淀粉，因此更容易滋生霉菌，霉菌则会分解淀粉，从而产生有毒黄曲霉素，是强致癌物质。
新技术在食品微生物检验检测中的应用
新技术在食品微生物检验检测中的应用随着经济的不断发展，人们对食品质量要求程度越来越高，食品安全问题也成为人们重点关注的问题。
同时，从最近几年我国食品安全问题来看，由微生物引起的食品安全问题已经成为当前社会中的一大难题，对人们的饮食安全造成不利影响。
对此，借助新技术的方式加强对食品中微生物的检验、检测，能更好的保障人们的食用安全，同时还能保障食品的安全问题。
文章阐述如何借助新技术的方式检测食品微生物，并深入探索当前应用较为广泛的几项新型食品微生物检测技术，为实现真正的绿色健康生活不断努力。
一、关于食品微生物检测1、食品微生物检测的重要性俗话说的好，民以食为天。
从实际生活中可以了解到，食物与日常的空气、大自然的水相同，也是人们生活中必不可少的一部分，同时还承担着人们基本生活。
而食品微生物检验检测是食品检测中必不可少的一部分，通过食品微生物检验，能明确判断出食品加工环境及食品卫生情况，并对各项卫生管理提供科学、有效的依据。
食品微生物检测过程中，应注意各种病毒，如猪瘟、肝炎等病毒；还应重视检查食物中是否含有寄生虫，如较为常见的蛔虫、弓形体、肺吸虫等等。
事实上，要想了解微生物检测的范围，应研究这几点：（1）食品生产加工厂的环境卫生，如必不可少的生产用水、加工厂内的空气卫生等等；（2）原材料的检测，食品中所使用的原材料，例如使用的生肉、生蔬菜、谷物、甚至是添加剂等；（3）食品所需要的加工环节、储藏环节，在这个环节中还要注意相关从业人员个人卫生，以及加工工具的各项设备卫生等；（4）对出厂产品的最后检测，这一项工序也是工厂对产品最后的检测，更重要的是对零散食品的监测、以及食物中毒的检验。
2、食品微生物快速检测方法具备的特点对食物中的微生物进行快速检测，需要选择具有多种特点的检测方法：（1）检验操作要比较简便，且要有较快的检测速度，可以快速完成检测；（2）检测方法具有较高的灵敏度和特异度，且有较高的精准度；（3）采用自动化程度高的检测方法，这样能够减少人员参与，降低人工成本消耗；（4）标准化程度高，便于学习和掌握；（5）检测所用仪器的体积小，重量轻，携带便捷。
生物制品中DNA残留检测
系列资料：生物制剂中宿主残余DNA检测技术与标准的发展趋势系列1. 生物制品中残留DNA检测标准的变化2015年3月底，中国食品药品检定研究院网站的国家药品标准物质目录中新增加了一个编号为410001的产品：CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒（PCR-荧光探针法）。
这个由中检院与中科院联合研发，由生物制药企业参与标定的试剂盒与现行美国药典（USP）建议的检测方法同步，但与2010版药典附录中外源性DNA 残留量测定法有所不同，可能会对国内生物制品的研发和生产的上下游企业产生影响。
生物制品中宿主细胞残留DNA具有潜在致瘤和传染风险，所以各国药品监管部门对DNA杂质的限量要求非常严格。
美国药典在General Chapter <1130>介绍了三种常用技术，但将在2015年颁布的新版（USP38–NF33）中增加全新章节（General Chapter <30>）来进一步规范残留DNA检测的方法和标准物质。
与1000号以上的章节不同的是，USP编号1000以内的章节详细规定了检测技术、系统适应性标准和标准物质。
新版USP中将唯一推荐qPCR法作为生物制品中宿主残留DNA的标准方法。
qPCR法的技术优势在于序列特异性高、灵敏度高、重现性好，可以为生物制药工业在工艺研究和成品质量控制方面提供可靠的检测手段。
我国参照WHO、FDA和欧盟的标准，很早以前开始就对生物制品中残余DNA 含量进行限制。
从卫生部颁布的《人用重组DNA制品质量控制要点》到近年的《中国生物制品规程》都对DNA含量做了严格要求，部分标准高于国际标准。
2010年版中国药典附录收录了DAN探针杂交法和荧光染料法，这两种方法都存在技术缺陷，很难达到杂质限量检测的灵敏度，已经被欧美药典摒弃。
目前，仍有很多国内企业沿用这两种方法检测残留DNA，致使生产工艺和产品质量很难达到国际一流水平。
根据残余DNA检测技术的发展趋势，小编预计我国2015版药典或增补版本中将出现qPCR方法。
应用化学在不同领域的应用
应用化学在不同领域的应用刘家麒摘要：应用化学作为理工类专业，旨在培养化学基础知识、基础理论、化学分析能力以及相关的工程技术知识和实验操作能力。
近年来，随着高新技术的发展以及社会需要，应用化学这项专业广泛被用于各个不同的领域。
应用化学主要课程有分析化学实验、普通生物、有机化学等。
本文将对应用化学在不同领域的应用展开论述，旨在说明应用化学有着一定的专业性和实用性。
关键词：应用化学；不同领域；应用Application of Applied Chemistry in different fieldsLiu Jia QiAbstract：As a science and engineering major, applied chemistry aims to cultivate basic chemical knowledge, basic theory, chemical analysis ability, and related engineering knowledge and experimental operation ability. In recent years, with the development of high-tech and social needs, applied chemistry has been widely used in various fields. The main courses of applied chemistry include analytical chemistry experiment, general biology, organic chemistry, etc. This paper will discuss the application of applied chemistry in different fields, aiming to show that applied chemistry has a certain degree of professionalism and practicality.Key words: Applied Chemistry; different fields; application随着时代的的发展，应用化学这项专业被广泛被用于不同领域，作为食品检验机构从业人员，本人结合自己工作所学到的专业知识以及工作经验，对应用化学在食品、教育、体育、环境的应用展开综合论述，旨在说明应用化学在不同领域都有很强的实用性和技术性，并且有着一定的发展前景。
pcr技术在病原生物鉴定中的应用实验报告
pcr技术在病原生物鉴定中的应用实验报告PCR技术，在分子生物学研究和临床医学中有着广泛的应用。
PCR通过利用酶在体外合成一条特定DNA序列，从而扩增目标DNA。
PCR技术在病原生物鉴定中特别有用，因为许多病原体的数量太少，不易被传统培养方法检测出来。
本实验报告将描述PCR技术在病原生物鉴定中的应用。
材料和方法材料：1.病原菌：分别收集大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体和结核分枝杆菌的菌株。
2. PCR试剂盒：包括PCR模板DNA（菌落），PCR反应缓冲液，聚合酶，dNTPs（脱氧核酸三磷酸），MgCl2，PCR引物，溶剂等。
3. 电泳仪：含有10％（w/v）聚丙烯酰胺和TBE缓冲液的平板，以及Agarose凝胶，乙溴化物（EB）等。
方法：1.从培养基上挑出适当的菌落，用管涂器转移到已添加生理盐水的96孔板中。
标记菌株。
抖动并在37℃下催化24小时。
2.收集菌株，将其离心，将细胞沉淀加入200μl 的 Tris-EDTA （TE）缓冲液，用超声波压碎。
使菌株的DNA完全释放，可用乙醇沉淀法纯化DNA。
3.设置PCR反应环境：将PCR反应管中加入20μl PCR反应缓冲液，2μl PCR模板DNA，1μl MgCl2溶液，0.5μl聚合酶（Taq酶），0.5μl PCR 引物，4μl dNTPs，72μl 的水。
混合物在PCR热循环器中按照以下条件扩增目标DNA：先以95℃处理2分钟进行热变性，其次以94℃56秒脱氧，然后以50℃45秒回收，之后以72℃1.5分钟延长扩增。
4.扩增完成后，取出反应体积2μl用于电泳分析，将其与DNA分子量标准品一起电泳于聚丙烯酰胺凝胶上，之后通过紫外线扫描进行可视化。
结果PCR为常用的病原体鉴定方法，以下是病原菌的PCRF结果。
表格一：病原菌的PCR结果菌株名称PCR扩增的目标片段（bp）大肠杆菌640沙门氏菌258金黄色葡萄球菌 583肺炎支原体235结核分枝杆菌386通过对扩增的目标DNA的大小范围进行分析，可以准确确定菌株的种类和数量。
简述食品中大肠杆菌的快速检测方法相关研究进展
简述食品中大肠杆菌的快速检测方法相关研究进展摘要：大肠菌群的快速检测是食品、药品卫生监督检验迫切需求，本文从免疫学技术，酶学的技术，分子生物学技术，传统检测方法改进技术，物理化学技术，其它技术方面对大肠菌群快速检测方法研究进展进行综述，并对其存在问题及应用前景进行分析。
这些方法各有优缺点，免疫学技术和分子生物学技术灵敏度高，但假阳性率高，无法区分死活菌；酶学的技术和物理化学技术特异性好，省时省力，但这些方法成本较高，不适合基层实验室使用；传统检测方法改进技术结果准确，但费时费力。
因此，仍需要发展一种新的方法解决所存在的问题。
要真正实现大肠菌群的快速检测还需要不断进行科学研究，以寻找一种能够真正实现成本低、灵敏度好、准确性高并且检测速度快的更合适的方法。
关键词：食品；大肠菌群；快速检测；研究1引言大肠菌群为一群在37C、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰阴性无芽胞杆菌的统称。
这些细菌多存在于温血动物粪便中，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然存在的主要原因。
因此，大肠菌群被国际上公认为检测各种水质、医药及食品在流行病学上安全性的指示菌。
如果检测到大肠菌群呈阳性结果，那么便表明食品、药品或者水质存在大肠菌群，已经被粪便污染。
大肠菌群的数量与受到的污染程度成正比，数量越多，受污染越严重。
目前我国国家标准主要用多管发酵法来检测大肠菌群多管发酵法作为一种传统的检测方法已沿用多年，其准确性、权威性无可质疑，但该方法费时费力，而且检测所需的费用较高，已无法满足人们对食品、药品安全现场监测的要求，因此，现在食品、药品卫生监督检验迫切需要一种更加有效、快速的大肠菌群检测方法。
近年来，世界各国针对大肠菌群的快速、定量检测技术都进行了专门的研究，本文综述了大肠菌群快速检测技术的研究进展，并对其存在问题及应用前景进行分析。
2大肠菌群主要的快速检测方法2.1免疫学技术免疫学方法检测原理是依据抗原和抗体特异性反应。
实时荧光PCR检测食品肉类种源的方法探讨
分析与检测1 PCR检测技术概述1.1 PCR技术简介PCR技术始于1985年，其用于特定的DNA片段的快速检测，与传统的检测方法相比，能够对特定的成分进行快速检测，并能够快速检测出目标物质中的不同成分，因此，该技术在目前的食品成分检测和致病菌检测等多方面均得到了越来越广泛的 应用[1]。
1.2 PCR技术的优势传统的成分检测环节往往需要大量的人力物力，且操作的复杂程度高，由于各种成分的生物特性和化学性质都有着一定的区别，对各个成分进行分别鉴定时，经常需要多次调整环境的pH、温度等参数，任何一个环节的失误都可能导致前功尽弃，而PCR技术的应用，有效解决了上述问题[2]。
具体来看，PCR技术主要表现出以下两方面的优点：①便利性好，与传统方法相比，PCR技术只需使用较少的设备和常规的操作步骤即可实现检测，整个过程更加便捷；②速度快，可以短期进行大量的检测[3-4]。
2 食品中肉类种源的实时荧光PCR检测2.1 实验材料2.1.1 实验试剂实验试剂包括琼脂糖、GelRed染色剂、50 bp DNA Ladder、无水乙醇、DNA提取试剂盒、DreamTaq PCR Master Mix，以及市售的牛肉卷样品和牛肉。
2.1.2 实验仪器实验仪器包括高速冷冻离心机、恒温水浴槽、涡旋振荡器、电子天平、生物分光光度计、制冰机和实时荧光PCR仪。
2.2 实验方法2.2.1 样品处理及基因组模板制备首先，采用剪刀和研钵，将所购买的样品剪碎和研磨，以进行匀质处理，其中，牛肉样品需要先在105 ℃下烘干，而后再进行均质处理。
两种样品的均质处理，应当保持一定距离，分开进行，避免交叉污染。
在均质处理步骤完成后，按照DNA试剂盒上的说明进行后续操作，以获取OD260/OD280比值处于1.7～2.0区间内的动物组织DNA。
2.2.2 引物与探针的合成及有效性验证根据Genbank所公布的基因序列，并通过Meglign软件进行对比分析，选取匹配度低和差异大的序列片段，并使用primer express2.0软件，在引物探针设计原则指导下，设计牛源成分的特异性引物和探针。