生物检测技术——核酸探针

3)单链DNA探针和双链DNA探针
➢ 用双链探针杂交验测另一个远缘DNA时，探针序列与 被检测序列之间有很多错配，但是，2条探针互补链之 间的配对却十分稳定，即形成自身的无效杂交，结果 使检测效率下降。科学上采用单链探针则可解决这一 问题。单链DNA探针的合成方法:(1)从Ml3载体衍生序 列合成单链DNA探针。(2)以RNA为模板用反转录酶合 成单链cDNA探针。
核酸探针的前景
➢ 基因芯片在环保方面、食品检测方面的研究报道比较少， 这将成为将来的研究方向。从某种意义上我们可以认为： 基因结构或种类决定物种，基因功能或表达则决定生命即 生物的生、老、病、死。基因芯片技术将为我们提供一条 认识生命本质的捷径，同时它的发展也带动了蛋白质芯片、 细胞芯片、多肽芯片、组织芯片的发展和应用。
➢ 核酸探针具有特定的序列，能够与具有相应核苷酸碱 基互补序列的核酸片段结合，因此可用于样品中特定 基因片段的检测。
核酸探针的标记物
一.放射性标记
➢ 放射性同位素是最早使用、也是目前应用最广泛的 探针标记物。常用的同位素有 32P、3 H、35S。其中， 以32P应用最普遍。
➢ 放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测到pg级； 缺点是易造成放射性污染，而且同位素半衰期短、 不稳定、成本高。因此，放射性标记的探针不能实 现商品化。目前，许多实验室都致力于研究非放射 性标记的探针。
➢ 在癌基因的检测和诊断、致病病原体的检测、遗传病的产 前诊断以及亲子关系鉴定等基因诊断方面以及特异性目的 基因及外源DNA的检测方面，核酸探针技术将越来越显出 其巨大的应用解脲脲原体(UU)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)
➢ 双链DNA探针的合成方法：切口平移法和随机引物合 成法。双链DNA探针在与靶序列杂交前，DNA分子必 须变为单链，这一般是通过加热使其变性而达到解链 目的。解链DNA分子被迅速冷却到只能缓慢复性的温 度以下，可使探针保持单链状态。
核酸探针的应用现状
一 食品检测中的应用：核酸探针技术已被用于检验
➢ 人工合成的寡核苷酸探针是在已知基因序列的情况下。 由核酸合成仪来完成，可廉价获得大量的此类探针，长 度一般长约10~30bp，甚至可达50 bp。如果已知核酸 序列可根据已知DNA或RNA序列合成精确互补的DNA 探针，单一已知序列寡核苷酸探针能与它们的目的序列 准确配对，可以准确地设计杂交条件，以保证探针只与 目的序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交， 对于一些未知序列的目的片段则无效；如果不知道核酸 序列，可依据其蛋白质产物的氨基酸顺序推导出核酸序 列从而合成DNA探针。
四 临床诊断和司法方面的应用
➢ 目前利用核酸探针发展起来的PCR在临床上的应用广 泛，。例如：对结核、麻风、沙眼衣原体、金黄色葡萄 球菌、霍乱弧菌等微生物病原体的检测；对艾滋病、病 毒、细胞淋巴瘤病毒的检测；数十种遗传病(如镰刀状 细胞贫血、血友病、肌营养不良症、舞蹈症等)都采用 PCR诊断；肿瘤的诊断；性别鉴定；DNA指纹鉴定。
生物检测技术
——核酸探针
前言
➢ 从基因工程技术一开始，就伴随着核酸探针的应用。 在许多领域如基因研究、SNP检测、STR检测、肿瘤 研究、药理学研究等方面，核酸探针都是一种强有力 的工具。为了能更好的应用和发展核酸探针，有必要 对核酸探针有一个系统的认识。
➢ 核酸探针是以研究和诊断为目的，用来检测特定序列 核酸(DNA 或RNA)的DNA或RNA片段，称为核酸探针， 作为探针的核酸探针片段可以较短(20 bp)，也可以较 (5kb)。
➢ 虽然以上核酸探针已经广泛地应用于各类病毒的检测， 但在检测技术方面还有一些问题，检测一种菌就需要 制备一种探针一次只能检测出一种菌或病毒检测的操 步骤复杂，效率低等缺点。而基因芯片可将大量的探 针同时固定于支持物上，所以一次可对大量核酸分子 进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交的操作 复杂，自动化程度低，检测目的分子数量少，效率低 的缺陷，使核酸探针的应用更加广阔 。现在基因芯片 可以用于检测人类的许多疾病如肿瘤，血友病，地中 海贫血病，异常血红蛋白病，苯酮尿病等。
二 DNA测序及再测序中的应用
➢ DNA 测序早期采用Maxam 和Gilbert的化学法与 Sanger的双脱氧法进行测序。由于这两种测序方法 是手工测序，所以它的精确度较低。在以上两种方法 的基础上，通过与计算机技术和荧光技术的结合，产 生的自动测序仪在很大程度上提高测序的精确度。近 几年，由于DNA测序技术的不断发展和测序策略的 日益成熟，以及自动测序仪的改进，序列测定速度和 准确率大为提高，随之出现了基因芯片的测序，它是 利用固定探针的样品，进行分子杂交产生的杂交图谱， 而排列出待测样品的序列。
核酸探针检测的原理
➢ 核酸探针检测所依据的是核酸分子杂交，其工作原理 是碱基配对，即2条碱基互补的DNA链(或2条碱基互 补的DNA链和RNA链)在适当条件下可以按碱基配对 原则，形成杂交DNA分子。
➢ 生物体含有相对稳定的DNA序列，不易受外界环境因 素的影响而改变。一般来说同种生物的DNA序列相同， 不同种生物体DNA序列不同．生物个体都有自己独特 的DNA序列。根据中心法则．DNA双链的核苷酸分子 是通过碱基之间的氢键作用力专一性互补配对而结合 在一起的，每个基因的RNA和对应的模板DNA链也可 以通过碱基配对而结合在一起。核酸探针就是根据核 酸分子之间的互补配对原则设计的一种检测目标DNA 序列是否存在的一段核酸序列。
➢ 诊断芯心技术是DNA杂交技术和PCR扩增技术相结合 的分子诊断方法，将成为一项现代化诊断新技术。现在， 肝炎病毒检测诊断芯片 、结核杆菌耐的性检测芯片、 多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等一系列诊断芯片逐步 开始进入市场。未来人们在体检时，由搭载基因芯片的 诊断器机器人，对受检者取血，转瞬间体验结果便可以 显示在计算机的屏幕上。
食品中 一些常见的病原菌。 ➢ （1）大肠杆菌： 产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)是引起
人和动物腹泻的主要病原之一。用生物素标记的编码 大肠杆菌耐热肠毒素(ST)的DNA 片段作为基因探针， 检测了污染食品(包括鲜猪肉、鸡蛋、牛乳)中的产ST 大肠杆菌。 ➢ （2）沙门氏菌：沙门氏菌是重要的人畜共患致病菌 及食物中毒性细菌之一，广泛地分布于自然界及畜禽 体内。由该菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的首 位。利用生物素标记的克隆沙门氏菌DNA 片段作为 基因探针，检测了临床样品、食品及饲料样品中的沙 门氏菌。
➢ 随之就出现了基因芯片杂交测序技术(SBH)和邻位杂 交测序技术(GSH)。
基因芯片
原理
原型
三 检测人及生物体基因组中特异性序列
➢ 用非放射性核酸探针—— 地高辛核酸探针可对医学病 毒，禽类病毒，植物病毒的进行检测；用重复DNA 片 段来检测麻风杆菌；用rRNA探针检测铜绿假单脆菌； 用核酸探针检测腺病毒、BK病毒，巨细胞病毒以及恶 性病原虫、弓形虫、利氏曼原虫等。
五 核酸探针技术在浮游植物检测中的应用
➢ 核酸探针技术在浮游植物检测中的应用的是利用高特 异性的寡核苷酸探针直接与细胞内的或从细胞中提取 出来的rRNA进行杂交，从而在混合样品中检测到特 定物种的存在。
➢ 不同物种的基因序列在某些位点会存在一定几率的突 变，但是它们本身又具有高度的保守性，其序列的相 似程度可以反映出它们在系统发育上的关系，当其全 序列或者大部分序列被分析时，就可以得到有关物种 在系统发育方面的足够信息并因此知道它们在系统发 育上的位置，从而鉴定浮游植物。而利用基于这些信 息而设计的寡核苷酸探针即可以直接在环境样品进行 原位杂交，或者与细胞裂解物进行三明治夹心杂交， 从而检测到特定浮游植物在特定海区的存在与否。
二.非放射性标记
➢ 目前应用较多的非放射性标记物是生物素和地高辛， 二者都是半抗原。
➢ 生物素是一种小分子水溶性维生素，对亲和素有独特 的亲和力，两者能形成稳定复合物，通过连接在亲和 素或抗生物素蛋白上的显色物质(如酶、荧光素等)进行 检测。
➢ 地高辛是一种类固醇半抗原分子，可利用其抗体进行 免疫检测，运用原理类似于生物素的检测。地高辛标 记核酸探针的检测灵敏度可与放射性同位素标记的相 当，而特异性优于生物素标记，其应用日趋广泛。
核酸探针的分类及制备方法
➢ 根据核酸的来源和性质，核酸探针可分为RNA探针、人工 合成的寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针等几 类。
1） RNA探针
➢ RNA探针一般都是单链，它具有单链DNA探针的优点，又 具有许多DNA单链探针所没有的优点，主要是：RNA： DNA杂交体比DNA：DNA杂交体有更高的稳定性，所以 在杂交反应中RNA探针比相同活性的DNA探针所产生信号 要强。RNA：RNA杂交体用RNA酶A(胰RNA酶)切比用Sl 酶切DNA：RNA杂交体容易控制，所以用RNA探针进行 RNA结构分析比用DNA探针效果好。
➢ RNA的探针制备过程是将一段含完整或部分基因的DNA 片段插入重组质粒的多克隆位点，以内切酶在插入片段 中某一适当部位或插入片段下游的某一部位消化重组质 粒，使之成为线性DNA，然后在相应的DNA依赖RNA 聚合酶催化下，以含有目的基因的DNA片段为模板合成 RNA探针。
2)人工合成的寡核苷酸探针