免疫学常用实验方法 (2)资料
免疫学实验方法
免疫学实验方法免疫学实验方法是免疫学研究的重要部分，它通过一系列的技术手段来识别、分析免疫系统中的各种生物分子、细胞和组织，以及它们之间的相互作用。
这些方法在免疫学领域广泛应用于疾病诊断、药物研发、疫苗研究等方面，对促进免疫学的发展和应用发挥了重要作用。
下面将介绍一些常用的免疫学实验方法。
一、ELISA法ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种用于检测抗体或抗原的免疫学实验方法。
该方法通过将待测抗体或抗原与固相物质结合，再加入酶标记的二抗来进行标记，最后通过酶底物的底物变色反应或荧光底物的发光反应来检测待测抗体或抗原的存在量。
二、流式细胞仪流式细胞仪是一种用于分析和计数悬浮细胞的仪器，它利用激光照射细胞，通过细胞膜上的特异性抗体标记来检测细胞的表面标记物和内部细胞器的性质和分布，对免疫细胞的表型和功能进行高效的分析。
三、免疫印迹法免疫印迹法是一种用于检测蛋白质的免疫学实验方法，通过电泳将待测蛋白分离，再将其转移到膜上，最后使用特异性抗体和标记的二抗来检测待测蛋白的存在量和大小。
四、免疫组化法免疫组化法是一种用于检测组织中特定蛋白的免疫学实验方法，通过将组织切片后进行脱水、脱脂和脱水处理，再使用特异性的抗体来标记待测蛋白，并观察标记物的颜色变化或发光情况来确定蛋白的位置和表达量。
五、免疫沉淀法免疫沉淀法是一种用于检测蛋白相互作用的免疫学实验方法，通过将待测抗体与蛋白结合，再使用蛋白A/G琼脂糖或磁珠等材料将蛋白抗原免疫沉淀下来，最后使用核酸酶或质谱技术来分析蛋白的互作关系。
以上介绍的是一些常用的免疫学实验方法，它们在免疫学研究中起着举足轻重的作用，不仅在科研领域有重要应用，同时在临床诊断和治疗中也有着广泛的运用。
希望以上内容能够对您有所帮助。
临床免疫实验内容
实验一人外周血单个核细胞分离（4学时）（一）实验目的1．掌握人外周血单个核细胞分离的原理及操作方法；（二）实验原理密度梯度离心法。
淋巴细胞与单核细胞的比重为 1.075～1.090，而红细胞与分叶核白细胞的比重为1.092。
淋巴细胞分离液的比重为1.077±0.001，与淋巴细胞比重相同，而红细胞较之为重，通过离心，即可将淋巴细胞分离出来。
（三）实验材料①肝素抗凝静脉血；②Ficoll淋巴细胞分离液（密度为1.077±0.001）；③D-Hanks液；④0.4%的台盼蓝染液；⑤器材：离心机、恒温水浴箱、显微镜、细胞计数板等。
（四）实验方法①抽取抗凝血2ml，与等量D-Hanks液混匀；②取分离液2ml，缓慢加入释血液4ml；③2000 rpm离心20 min，观察细胞分层情况；④取出PBMC，用4倍量D-Hanks液洗涤2次，每次1500 rpm离心10 min；④用10%FCS的Hanks液还原体积至1 ml，取样镜检计数；⑤细胞存活率测定：取一个1.5ml EP管，加入等量的细胞悬液与台盼蓝染液，混匀后静置5min，镜检；⑥注意事项。
（五）实验结果①PBMC的计数= xxx 个/ ml；②细胞存活率=实验二淋巴细胞检测（4学时）（一）实验目的1．掌握免疫组化技术的原理、方法、结果判断及实际应用；2．熟悉E花环形成试验和淋巴细胞转化试验的原理及结果判断。
（二）实验内容1．酶免疫组化技术测定CD3+T细胞数量（操作）（1）原理酶免疫组织化学技术是以细胞涂片或组织切片为检测对象，应用酶免疫技术对特定细胞表面抗原进行显色，通过普通光学显微镜观察，判断细胞表面有无特异抗原的表达。
本实验采用鼠抗人CD3单克隆抗体，与待检T细胞表面CD3分子结合，加入二抗，即聚合辣根过氧化物酶（HRP）标记抗小鼠IgG，通过HRP催化底物显色判断CD3分子的存在，从而确定T细胞。
（2）材料①人外周血单个核细胞悬液；②鼠抗人CD3单抗（武汉博士德）；③两步法免疫组化检测试剂盒（武汉博士德）；④ DAB显色试剂盒（武汉博士德）；⑤ 0.01M PBS（PH 7.4）；⑥器材：2 ml EP管、吸附载玻片、微量移液器、恒温水浴箱、光学显微镜等。
常见免疫学检测方法
常见免疫学检测方法免疫学检测方法是现代医学中重要的实验技术之一，它通过检测机体的免疫反应来评估机体的免疫状态和检测特定的免疫指标。
下面将介绍常见的免疫学检测方法。
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用的免疫学检测方法。
它利用特异性抗体与待测物质结合，并通过酶标记的二抗或底物的酶作用产生可见的颜色反应，从而定量或半定量地测定待测物质的含量。
ELISA具有灵敏度高、特异性强、操作简单等特点，广泛应用于疾病诊断、药物检测、生物学研究等领域。
二、流式细胞术流式细胞术（Flow Cytometry）是一种光学技术，用于分析和计数悬浮细胞或微粒。
该技术通过将待测样品中的细胞或微粒单个地通过激光束，测量其散射光和荧光信号来分析细胞的特性和功能。
流式细胞术可以用于细胞表面标记物的检测、免疫细胞亚群的鉴定、细胞凋亡的检测等。
三、免疫组化免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种通过使用特异性抗体来检测组织中特定蛋白质的方法。
该技术通过将组织切片与特定抗体结合，并利用酶标记或荧光标记的二抗来显示特定抗原的分布和表达量。
免疫组化广泛应用于病理学研究、肿瘤诊断、蛋白质定位分析等领域。
四、免疫印迹免疫印迹（Western Blot）是一种用于检测特定蛋白质的方法。
该技术通过将待测样品中的蛋白质经电泳分离后转移到膜上，然后利用特异性抗体与目标蛋白结合，并通过酶标记的二抗或荧光标记的二抗来显示目标蛋白的分子量和表达量。
免疫印迹常用于蛋白质的检测、定量和鉴定。
五、免疫荧光免疫荧光（Immunofluorescence）是一种利用荧光标记的抗体来检测特定抗原的方法。
该技术通过将待测样品中的抗原与特异性抗体结合，并利用荧光标记的二抗来显示抗原的分布和表达量。
免疫荧光广泛应用于细胞和组织的定位分析、病毒感染的检测等领域。
免疫学技术与方法
免疫学技术与方法
免疫学技术和方法是在免疫学领域用于研究免疫应答和疾病发生机制
的实验技术和实验方法的总称。
随着免疫学研究的不断深入和发展，免疫
学技术和方法也在不断地创新和改进。
下面将介绍一些目前常用的免疫学
技术和方法。
1. 流式细胞术（Flow cytometry）：流式细胞术是一种广泛应用于
免疫学研究的技术，用于对单个细胞进行表面标记和细胞内蛋白表达分析。
该技术利用流式细胞仪将细胞按照大小、形状和标记物的荧光信号进行分
离和检测。
通过流式细胞术可以定量测定细胞表面标记物的表达水平，研
究细胞免疫分型和功能调节。
2. 酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）：ELISA是一种常用的免疫学检测技术，用于测定特定抗原或抗
体在体液或细胞中的含量。
该技术基于抗原与抗体之间的特异性结合反应，通过可见光的信号变化测定含量。
ELISA可以定量测定其中一种抗原或抗
体的浓度，用于研究疾病的诊断和免疫应答的评估。
3. 免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）：免疫组织化学是
一种用于检测组织切片中特定蛋白质的表达和定位的技术。
该技术利用特
异性标记的抗体与组织中的目标蛋白质结合，并通过可见光的显色反应来
观察蛋白质在组织中的分布和表达水平。
免疫组织化学广泛应用于研究组
织的发育、疾病的诊断和治疗效果评估等领域。
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免疫学实验
免疫学实验免疫学实验是研究机体免疫系统的功能和特性的重要手段之一。
通过实验的方法可以深入理解免疫系统的工作机制，探究免疫应答过程中的各种分子、细胞和组织的相互作用，以及相关疾病的发生机制。
本文将介绍几种常见的免疫学实验和它们的应用。
流式细胞术是一种常用的免疫学实验方法，主要用于研究细胞表面标记物的表达和免疫细胞亚群的鉴定。
该技术利用荧光染料或荧光标记的抗体与待测细胞进行结合，然后通过流式细胞仪进行细胞的快速单细胞分析和排序。
通过该方法，可以同时检测多个细胞表面标记物的表达水平，并且能够得到高度纯化的特定亚群细胞。
这种技术在免疫学研究中广泛应用，例如在研究癌症、感染病和自身免疫性疾病等方面发挥了重要作用。
酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种敏感、特异、定量的免疫学实验技术，用于检测样本中特定抗原或抗体的存在和浓度。
该方法利用特异性的抗原-抗体反应，将待测物质与固相或液相检测试剂结合，然后通过酶标记的二抗或底物染色等方法来定量检测。
ELISA广泛应用于免疫学研究和临床诊断中，例如用于检测HIV抗体、乙肝病毒表面抗原等。
免疫组化是一种常用的研究组织或细胞中特定分子的表达和定位的免疫学实验方法。
该方法利用特异性的抗体与待测物进行特异性结合，然后通过染色或荧光探针等方法来可视化该分子在组织或细胞中的位置和分布。
免疫组织化学在癌症研究、器官发育和免疫细胞分析等方面具有广泛的应用。
细胞毒性实验是用于评估某种物质对细胞的毒性作用的免疫学实验方法。
通过将待测物质与靶细胞共培养，观察细胞的形态变化、增殖能力、凋亡率等指标，从而评估待测物质对细胞的毒性水平。
细胞毒性实验在药物筛选、环境污染评估和基础研究中有重要应用价值。
以上介绍了几种常见的免疫学实验和它们的应用。
这些实验方法在免疫学研究和临床诊断中起着重要作用，为我们深入了解免疫系统的工作机制和相关疾病的发生机制提供了有力的工具。
通过不断改进和发展这些实验方法，我们将能够更加全面、精确地揭示免疫系统的奥秘，进一步推动免疫学科的发展。
免疫学实验技巧分享
免疫学实验技巧分享免疫学实验是生命科学研究中的重要组成部分，对于揭示免疫机制、诊断疾病以及研发免疫治疗方法都具有至关重要的意义。
在进行免疫学实验的过程中，掌握一些实用的技巧可以大大提高实验的成功率和准确性。
接下来，我将为大家分享一些在免疫学实验中积累的宝贵经验。
一、实验前的准备（一）实验设计在开始实验之前，一定要进行详细的实验设计。
明确实验的目的、预期结果以及所需的实验步骤。
同时，要考虑到可能出现的误差和干扰因素，并制定相应的应对措施。
合理的实验设计是实验成功的基础。
（二）试剂和材料的选择选择高质量、可靠的试剂和材料至关重要。
对于抗体、细胞因子等关键试剂，要选择知名品牌，并仔细查看其说明书，了解其适用范围、保存条件和使用方法。
此外，实验中使用的耗材，如移液器枪头、离心管等，也要确保无菌、无杂质。
（三）仪器设备的校准和维护定期对实验中使用的仪器设备进行校准和维护，如移液器、离心机、酶标仪等。
确保仪器的准确性和稳定性，能够有效减少实验误差。
二、细胞培养技巧（一）细胞的复苏细胞复苏是细胞培养的第一步，操作不当容易导致细胞死亡。
从液氮中取出细胞冻存管后，要迅速放入 37℃水浴中，轻轻摇动使其快速融化。
融化过程中要避免水没过管盖，以免造成污染。
待细胞完全融化后，将其转移至离心管中，加入适量的培养基，离心去除冻存液，然后将细胞重悬并接种到培养瓶中。
（二）细胞的传代当细胞生长至 80%－90%汇合度时，需要进行传代。
传代前要先对细胞进行消化处理，常用的消化酶有胰蛋白酶和 EDTA 等。
消化时间要根据细胞的类型和状态进行调整，一般控制在 1-5 分钟。
消化结束后，加入适量的培养基终止消化，轻轻吹打细胞使其分散，然后按照适当的比例进行传代。
（三）细胞的冻存为了长期保存细胞，需要进行冻存。
冻存细胞时，要先将细胞消化、离心，然后用含有 10%DMSO 的冻存液重悬细胞，将细胞分装至冻存管中，缓慢降温至－80℃，最后转移至液氮中保存。
免疫学方法
免疫学方法免疫学是研究生物体对抗外源性病原体和异物的免疫应答机制的科学。
免疫学方法是研究免疫学过程和免疫学问题的一种手段，主要包括免疫学实验方法、免疫学检测方法和免疫学治疗方法等。
本文将从这几个方面对免疫学方法进行介绍。
一、免疫学实验方法。
1. 免疫细胞分离和培养。
免疫细胞分离和培养是研究免疫细胞生物学特性的重要方法。
通过离心、梯度离心、磁珠分选等技术，可以分离出各种免疫细胞，如T细胞、B细胞、巨噬细胞等，并进行体外培养，用于进一步的实验研究。
2. 免疫组化技术。
免疫组化技术是利用抗体与抗原特异性结合的原理，通过染色或荧光标记等方法来检测组织中特定抗原的分布和表达情况。
这项技术在病理诊断、免疫细胞定位等方面有着广泛的应用。
3. 免疫沉淀技术。
免疫沉淀技术是利用抗体与抗原特异性结合的原理，通过将抗体与抗原结合后沉淀下来，从而分离出特定的蛋白质或复合物。
这项技术在蛋白质相互作用、蛋白质结构分析等方面有着重要的应用。
二、免疫学检测方法。
1. ELISA法。
ELISA法是一种常用的免疫学检测方法，通过将待检样品中的抗原或抗体与固相载体上的特异性抗体或抗原结合，再加入酶标记的二抗或底物，通过酶的催化作用产生可检测的信号，从而进行定量或半定量的检测。
2. 免疫印迹法。
免疫印迹法是通过将待检样品中的蛋白质分离、转膜到膜上，然后用特异性抗体结合，最后通过化学发光或染色等方法来检测特定蛋白质的存在和表达水平。
3. 流式细胞术。
流式细胞术是一种利用流式细胞仪对细胞进行快速、高通量的检测和分析的方法，可以用于细胞表面标记物的检测、细胞周期分析、细胞凋亡检测等。
三、免疫学治疗方法。
1. 免疫抑制剂。
免疫抑制剂是一类能够抑制免疫系统功能的药物，常用于器官移植术后的免疫抑制治疗，以防止移植物排斥反应。
2. 免疫增强剂。
免疫增强剂是一类能够增强免疫系统功能的药物或治疗方法，常用于免疫功能低下或免疫缺陷性疾病的治疗，以增强机体抵抗能力。
免疫学实验整理
免疫学实验整理一、凝集试验、吞噬试验（一）凝集试验1、直接凝集反应（ABO血型鉴定）2、间接凝集反应（类风湿因子测定）3、金黄色葡萄球菌协同凝集试验（二）吞噬试验（示教）1、中性粒细胞的吞噬作用（小吞噬）2、巨噬细胞的吞噬作用（大吞噬）名解：1.免疫学检测技术：利用免疫学原理来检测抗原、免疫分子（抗体、补体、细胞因子和粘附分子等）及免疫细胞等免疫学研究对象的实验过程。
如凝集反应可用于检测抗原抗体，吞噬十堰可用于检测免疫细胞等。
2.凝集反应（agglutination reaction）:在一定浓度的电解质溶液中，颗粒性抗原与相应抗体结合后，出现肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。
3.直接凝集反应（direct agglutination reaction）:细菌、细胞等颗粒性抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直接凝集反应。
4.间接凝集反应（indirect agglutination reaction）：将可溶性抗原或抗体先吸附于适当大小的颗粒性载体表面（这种载体与免疫无关），然后与相应抗体或抗原结合，在适量的电解质存在下，出现特异性凝集现象，称为间接凝集反应。
5.协同凝集实验（coagglutination）：利用金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）能与人和多种哺乳动物IgG的Fc段结合而不影响其Fab段功能的特性，将已知的特异性抗体吸附于金黄色葡萄球菌上，与相应的抗原发生的凝集反应即为协同凝集试验。
6.滴度（titer）、效价：The maximum dilution that gives obviously visible agglutination (++) is called the titer.实验及注意点：1、检测抗原抗体的基本原则：根据抗原抗体结合反应的高度特异性，用已知抗体（抗原）检测未知抗原（抗体），有现象则说明有相应抗原，无现象则无相应抗原。
2、直接凝集反应（ABO血型鉴定）：若加A抗体出现凝集说明血清中有A抗原，为A型血。
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激光束
侧向散射 光，荧光
细胞
二色镜
1
2
3
前向 散射 光
收集透镜
带通滤波片 光电倍增管
b. 数据处理
光信号
FSC SSC FL1 FL2 FL3
对数 线性
电信号
线性 线性 对数
脉冲处理，模数转换
记录数据，显示结果
c. 细胞分选
488 nm laser
- Charged Plates
Single cells sorted into test tubes
Nonspecific: Mitogen : LPS, ConA, PHA Superantigen(超抗原): SEB Cytokine : IL2, IL4, TNF Antibody: CD3, TCR, CD28
Specific: specific antigen:破伤风类毒素，PPD(纯结核蛋白衍生物)
ascites Monoclonal antibody
ELISA
II. Assay for cell function
Proliferation: T cell, tumor cell, … Cytotoxic assay : T cell, NK cell, …
Cell Proliferation Stimulators
MHC: 同种异体细胞(MLR,混合淋巴细胞培养)
• Assay for T cell proliferation
a. 3H-TdR
3H-TdR
wash
Stimulate
Assay
b. MTT
Assay Mechanism:
操作简单，重复性差
c. CFSE
proliferation
CELL
Figure 15.67 Following cell proliferation in human peripheral blood lymphocytes using the CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit C34554). Human peripheral blood lymphocytes were harvested and stained with CellTrace CFSE (carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester; 5(6)-CFDA, SE) on Day 0. A portion of the population was arrested at the parent generation using mitomycin C (red peak). The remainder of the sample was stimulated with phytohemagglutinin and allowed to proliferate for 5 days. Solid green peaks represent successive generations.
Estimates of the number of articles published per 5-year period from 1960 to 2005
Figure. Estimates of the number of articles published per 5-year period from 1960 to 2005. The search was done in February 2005 in PubMed/National Library of Medicine, NIH, with the search terms: enzymeimmunoassay, enzyme-linked immunosorbent assay (EIA/ELISA combined), and RIA. (Ordinate), number of articles in which the keywords are quoted. (Abscissa), 5-year periods from 1960 to 2005. , combined EIA/ELISA; , RIA. [Note: I do not pretend that the numbers in this figure are precise; the trends, however, are evident.]
•Cell function: 3H－TdR proliferation MTT CFSE Cytotoxicity 51Cr
•Animal experiment
I. Antigen-Antibody Reaction
非非共共价价键键结合结合 抗体的互补决定区 (CDRs)
抗原决定簇(antigenic determinant) 又称表位 (epitope)
Antigenic Determinant
Features of Ag-Ab Reaction
Specificity 特异性
Reversibility可逆性
Ag+Ab→Ag·Ab
解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。 在一定条件下(如低pH、高浓度盐等)可以解离。
Ratio最适比例
Sensitivity 敏感性
化学比色法： mg/ml
酶反应测定法： 5-10μ g/ml (免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿)
标记的免疫测定法： ng/ml 水平 (例如，用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定HBsAg，其 敏感度可达0.1ng /ml)
Often used methods
ELISA------酶联免疫吸附试验 Immunohistochemistry --------免疫组织化学 FACS------流式细胞术 Western Blotting-------免疫印迹技术
待测样品的合理稀释
•不同类型的检测方法
2. Immunohistochemistry (免疫组化)
原理：抗原抗体反应，抗体标记技术（荧光、酶） 用途：组织或细胞内抗原的定性和定位 流程：
Copyright ©2007 American Association for Cancer Research
Figure 3. mTNF induces infiltration of innate immune cells and angiostasis in tumors from TNFR1–/– but not TNFR1–/–/R2–/– mice. A to F, TNFR1–/– mice or TNFR1–/–/R2–/– mice were injected s.c. with 5 x 106 of J-mTNF10 cells. Ten days after tumor cell challenge, tissue sections of the injection site were stained for Mac-1+ (A and B), Gr-1+ (C and D), and CD31+ (E and F) cells as indicated. G and H, for confocal microscopy analysis, tissue sections were stained with Cy3-labeled anti-CD31 for blood vessel endothelial cells (green) and the VasoTACS in situ kit to detect apoptosis (red). Arrows, apoptotic endothelial cells in the tumor.
1. ELISA(酶联免疫吸附试验 Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)
RIA (radioimmunoassay, Berson&Yalow， 1960)
IRMA(immunoradiovelric assay, Miles&Hiles, 1968)
E(L)I(S)A (Engvall&Perlmann, van Weemen and Schuurs , 1971)
• 特点
（1）多参数定量分析每一个细胞；
（2）细胞分选； 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群、 单细胞克隆等。
(3）高通量（分析分选）． 分析150，000个/ 秒 分选100，000个/秒
• 基本结构
•工作原理
a. 光信号收集分离，导向，各探测通道接收并转化 为电信号。
Myeloma
?
A clonal cell line secreting specific Ab
Jerme，Köhler and Milstein 1984 Nobel Prize
B cell
Fusion
Myeloma
B cell
B cell+Bcell B cell+Myeloma Myeloma Myeloma+Myeloma
（1）固相的抗原或抗体，
即"免疫吸附剂"（immunosorbent）;
（2）酶标记的抗原或抗体，
称为"结合物"（conjugate）；
（3）酶反应的底物。
•ELISA基本的实验过程
a.包被 b.抗原抗体反应 c.酶促反应,显色 d.终止显色，读取数据。 •对照和标准曲线
阳性对照 阴性对照 定量测定：标准品制作标准曲线
Complementarity-determining regions (CDRs):
CDR1 CDR2
CDR1
CDR2 CDR3
CDR3
H