贵州地方山羊GnRHR基因多态性研究

《黑龙江畜牧兽医》 科技版
2015 年 08 月（ 上） 97
贵州地方山羊 GnＲHＲ 基因多态性研究
张劲松1 ， 龙威海2 ， 许厚强2 ， 冯文武2 ， 陈 祥2
（ 1． 习水县农牧局， 贵州 遵义 564600 ； 2． 贵州大学 动物科学学院 / 高原山地动物遗传育种与 繁殖教育部重点实验室 / 贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室， 贵阳 550025 ） 中图分类号： S827 ； Q786 文献标识码： B 文章编号： 1004 － 7034 （ 2015 ） 08 － 0097 － 04
表1 引物 P1 P2 P3 退火温 度 /ħ 63 58 59 退火温度及目的片段长度 引物序列、 目的片段 长度 /bp 921 434 1 121 引物序列 F 5' － AAACCAGGCCATCTGCTGAG － 3' Ｒ 5' － CTGACTTCCAGAGCCCAAGC － 3' F 5' － AGCAGTTGCTTTGGGCAACA － 3' Ｒ 5' － CACAGCAAGTGCCATTCTGAT － 3' F 5' － AGTTCAACCTCAGTCCACTCT － 3' Ｒ 5' － TGGATAGTGGGTTGGTTGCT － 3' 扩增区域 外显子 1 及 内含子 1 外显子 2 及 内含子 2 外显子 3
高繁殖力也存在相关性。 韩丹等［7］ 在西农萨能奶山 羊和波尔山羊 2 个品种 GnＲHＲ 基因中发现 2 个多态 收稿日期： 2014 － 09 － 29 ； 修回日期： 2014 － 10 － 11 位点， 并且这 2 个多态位点均与其产羔数显著相关。 基金项目： 贵 州 省 科 技 重 大 专 项 项 目 （ 黔 科 合 重 大 专 项 字 利用 DNA 池和测序技术筛选单核苷酸多态性（ SNP ） （ 2013 ） 6008 ） 作者简介： 张劲松（ 1973 － ） ， 男， 畜牧师， 硕士， 研究方向为畜 具有方便快捷、 切实有效等特点［8］。 试验采用 DNA 牧水产技术推广． 池结合 PCＲ 测序法对山羊 GnＲHＲ 基因全部外显子 通信作者： 陈 祥（ 1974 － ） ， 男， 教授， 博士， 研究方向为动物 进行多态位点检测， 并进行生物信息学分析， 以期筛 遗传育种与繁殖，as． xchen@ gzu． edu． cn． 选出对山羊繁殖性状有益的多态位点， 为提高贵州地
DOI:10.13881/ki.hljxmsy.2015.1369
繁殖性状是家畜的重要经济性状， 由于繁殖性状 的遗传力很低， 采用常规的育种技术改良产仔数性 状， 其选育进展缓慢。繁殖性状中的排卵数和窝产仔 数是决定繁殖率的关键因素， 产仔数的高低受许多因 素影响， 排卵数则是其中重要的影响因素之一， 而排 卵率与产仔率之间有着较高的遗传相关 。 由于排卵 是受垂体性腺轴调控的， 因此参与垂体性腺轴调控的 各类激素都有可能影响产仔数。 随着分子生物学技 术和现代繁育理论的不断发展和渗透， 从基因水平对 家畜高繁殖力机制进行探讨已取得许多成就， 而找到 与这些繁殖性状位点相连锁的分子遗传标记则是实 现标记辅助选择的先决条件。 促性腺激素释放激素（ gonadotropin releasing hormone， GnＲH） 是由丘脑下部神经内分泌细胞合成的 一种十肽， 是下丘脑 － 垂体 － 性腺轴的关键神经内分 泌调节因子， GnＲH 作用的发挥依赖于促性腺激素释 放激素受体 （ GnＲHＲ ） 的存在［1］。 G． W． Montgomery
［ 16］ 朱淑斌， 赵旭庭， 周春宝， 等． 姜曲海猪 A － FABP 基因内含子 1 多态性与肉 质 性 状 的 相 关 分 析［J］ ． 中 国 畜 牧 杂 志， 2013 ， 49 （ 13 ） ： 12 － 15． 位点多态性研究［J］． 畜牧与兽医， 2010 ， 42 （ 8 ） ： 15 － 18．
M． DL － 2 000 Marker； 1． 贵州白山羊； 2． 黔北麻羊； 3． 贵州黑山羊。
图1
PCＲ 扩增产物检测结果
PCＲ 反应体系及条件 反应体系（ 10 μL） ： 构建 DNA 池进行 PCＲ 反应， 基因 组 DNA 1 μL， 10 pmol / μL 上、 下游引物各 0． 75 μL， 2 ˑ Taq PCＲ Master Mix 试剂 5 μL， 双蒸水 2． 5 μL。 PCＲ 扩增条件： 95 ħ 预变性 3 min； 95 ħ 变 性 30 s， 退 火 30 s （ 退 火 温 度 见 表 1 ） ， 72 ħ 延 伸 1 min， 共 34 个循环； 72 ħ 再延伸 5 min； 4 ħ 保存。 PCＲ 产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测， 采用凝胶成像 仪观察电泳结果。选择特异性好的 PCＲ 产物送北京 2． 2
Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine
ɴ 08 2015
诺赛基因组研究中心有限公司进行测序 。 2． 3 序列分析、 比对及等位基因频率估算 将测得的序列用 DNAStar 软件中 SeqMan 程序 对序列进行组装校对， BLAST 分析并确定 SNP。利用 测序 图 看 图 软 件 Chromas． exe 和 MWSnap 测 量 各 SNP 位点等位基因的相应峰高。 SNP 通常所指二等 位多态性， 并 根 据 以 下 公 式 估 算 等 位 基 因 频 率［9］。 i = 1， 2 。 式中： f i 表示 SNP 位点某 f i = h i / （ h1 + h2 ） ， 等位基因频率， h1 和 h2 分别表示测序图上该 SNP 等 位基因 1 ， 2 峰高度。 2． 4 GnＲHＲ ＲNA 二级结构预测 利用 在 线 软 件 对 GnＲHＲ 基 因 突 变 前 后 不 同 DNA 序列进行 ＲNA 二级结构变化预测， 比对结果并 分析。 ＲNA 二 级 结 构 在 线 预 测 软 件： http： / / www． genebee． msu． su / services / rna2_reduced． html． 。 3 结果与分析 3． 1 DNA 池的 PCＲ 扩增产物检测（ 结果见图 1 ）
等［2］通过研究将绵羊的 GnＲHＲ 基因定位到 6 号染 色体上。对绵羊的 GnＲHＲ 基因进行研究发现， 该基 因存在 一 个 单 拷 贝， 在编码区有很高的序列同源 ［3 ］ 性 。GnＲHＲ 基因由 2 个内含子和 3 个外显子组 成， 外显子 1 编码 GnＲHＲ 蛋白的 N － 端尾巴及跨膜 （ TM） 单环 1 ， 2， 3 和部分 TM4 ， 外显子 2 编码剩余部 分 TM4 及整个 TM5 ， 而外显子 3 编码 TM6 和 TM7 。 哺乳动物的排卵依赖于促黄体生成素 （ LH ） 高 峰， GnＲH 分泌的增加和 GnＲHＲ 数量的增加均会引 起 LH 高峰。 因此， GnＲH 基因和 GnＲHＲ 基因在哺 许多 乳动物的繁殖调控中起重要作用［4］。 近年来， 研究人员将 GnＲHＲ 基因作为影响家畜繁殖性能的 候选 基 因 来 研 究， 取 得 了 一 系 列 研 究 成 果。 吴 旭 ［5 ］ 等 检测文昌鸡的 GnＲHＲ 内含子 1 的多态性发现， 其多态性与 300 和 400 日龄的产蛋数显著相关。 孙 CnＲHＲ 基因多态性与小尾寒羊的 洁等［6］研究表明，
关键词： 促性腺激素释放激素受体（ GnＲHＲ） 基因； 单核苷酸多态性（ SNP ） ； 外显子； 贵州地方山羊； 多 态性 摘 要： 为了分析山羊 GnＲHＲ 基因外显子区序列的多态性， 筛选出对山羊繁殖性状有显著影响的单 核苷酸多态性（ SNP） 位点， 试验以贵州白山羊、 黔北麻羊和贵州黑山羊 3 个地方品种为研究对象， 采 用 DNA 池结合 PCＲ 直接测序法对 GnＲHＲ 基因进行 SNP 检测， 同时结合在线软件预测不同基因型 mＲNA 的二级结构。 结果表明： 在 3 个山羊品种中共检测到 2 个 SNP 位点， 即 G121A、 G15A， 其中 G121A 位于外显子 1 中且为同义突变， G15A 位于内含子中。 对外显子 1 G121A SNP 位点进行生物 信息学分析显示， 其导致 mＲNA 二级结构发生改变。
由图 1 可知， 3 对引物的 PCＲ 扩增条带整齐无拖 带， 引物特异性较好， 与预期结果一致。 PCＲ 产物可 直接用于测序试验。 3． 2 PCＲ 产物序列分析 试验设计 3 对引物分别扩增贵州白山羊、 贵州黑 山羊和黔北麻羊 GnＲHＲ 基因 3 个外显子及第 1 和 第 2 内含子序列（ 见 297 页彩图 2 ） 。 PCＲ 产物经双 向测序结果与绵羊 GnＲHＲ DNA 序列（ GenBank 登录 号为 NC_019460． 1 ） 基 本 吻 合， 可以确定为山羊的 GnＲHＲ 基因序列。 试验中 SNP 的位置均以其所在 区域的外显子或内含子第 1 个碱基为第 1 位计算， 则 SNP 位点分别为 G121A、 G15A， 其中 G121A 位于外 显子 1 中且为同义突变， G15A 位于第 2 内含子区。 3． 3 SNP 等位基因频率估算 利用 MWSnap 软件中的标尺分别测量 3 个山羊 品种中 2 个等位基因相应的峰高， 并根据等位基因频 率公式估算各位点等位基因频率（ 见表 2 ） ， 外显子区 G121A 和内含子区 G15A 位点在 3 个山羊品种的优 势等位基因均为 G。 3． 4 Gn猪 H － FABP 和 A － FABP 基因 ［ 14］ 朱弘焱， ［ 15］ 刘志成， 强巴央宗， 张浩， 等 ． 藏猪 FABPs 基因 PCＲ － ＲFLP 多样 性研究［J］． 中国农业大学学报， 2009 ， 14 （ 6 ） ： 6 － 10．
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98 方山羊繁殖性能提供分子生物学依据 。 1 材料 1． 1 山羊血样采集和 DNA 池构建 贵州黑山羊（ 103 只） ， 采自贵州省赫章县； 贵州 白山 羊 （ 105 只 ） ， 采 自 贵 州 省 沿 河 县； 黔 北 麻 羊 （ 105 只） ， 采自贵州省习水县。样品均来自各个品种 的中心产区。试验采用颈静脉采血， ACD 抗凝， 样品 均于 － 20 ħ 冰箱保存， 用于提取 DNA。 参照全血基 因组提取试剂盒使用说明书， 从血液中提取基因组 DNA， 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 提取效果， 并用 紫外分光光度计测定 DNA 样品浓度， 置于 － 20 ħ 条 件下保存， 备用。分别调整 3 种山羊 DNA 样品浓度 至 100 ng / μL， 各 取 5 μL 混 合 构 建 各 自 品 种 的 DNA 池。 1． 2 试验试剂 血液 基 因 组 DNA 提 取 试 剂 盒、 Mixture、 DL － 2 000 Marker、 核酸染料等， 均购自鼎国生物工程技术 有限公司； TAE 缓冲液、 超纯水、 无水乙醇等， 由高原 山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室制备 。 2 方法 2． 1 引物设计及 DNA 扩增 以绵羊 GnＲHＲ 基因 DNA 全序列（ GenBank 登录 号为 NC_019460． 1 ） 设计引物， 利用 NCBI 在线软件 Primer － BLAST 设计 3 对特异性引物。引物 P1 扩增 片段包含 GnＲHＲ 基因第 1 外显子序列及第 1 内含子 部分序列， 引物 P2 扩增片段包含 GnＲHＲ 基因第 2 外显子序列及第 2 内含子部分序列， 引物 P3 扩增片 段扩增外显子 3 序列。 引物由上海生工生物工程技 术服务有限公司合成。引物信息， 见表 1 。